用于產生和純化來自溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的膠原酶的新方法
【專利摘要】本發明要求用于產生和純化通過非致病性需氧細菌溶藻弧菌解毒化學變型(NCIMB編號：11038，異名LMG 3418，后文中稱為溶藻弧菌)產生的微生物膠原酶(微生物膠原酶EC 3.4.24.3)的新方法，該方法以穩定、可重現、便宜的發酵方法提供高產生水平的膠原酶。按照本文所述的方法從溶藻弧菌產生的膠原酶還具有優于其他微生物膠原酶的比活，在水溶液中穩定，且可以冷凍而無顯著損傷。本發明的另一目的是包含按照所述的產生和純化方法獲得的膠原酶的藥物組合物，其用于表征為膠原累積的障礙的治療性處理的目的，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕疵/缺陷的處理。
【專利說明】用于產生和純化來自溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus) 的膠原酶的新方法
【技術領域】
[0001] 膠原酶是具有蛋白水解活性的金屬酶，其需要活性部位中的鋅離子來執行其分解 天然膠原的具體功能。與其他蛋白酶不同，它們可以在生理pH和溫度條件下水解膠原。 許多由細菌產生的膠原酶為現有技術中已知（弧菌屬（Vibrio)、梭菌屬（Clostridium)、 鏈霉菌屬（Streptomyces)、假單胞菌屬（Pseudomonas));由梭菌屬產生的那些膠原酶 (Santyl?、Noruxol?)廣泛用于治療多種來源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷和肥 大性瘢痕的藥物組合物中，因為它們分解存在于壞死組織中的膠原。這便于去除細胞碎片， 細胞碎片常構成上皮細胞在創傷愈合和再生上皮過程中遷移的障礙（Rao,D.B.等，1975)。 最近也將來自弧菌屬的膠原酶用于相似目的（EP1901755);此專利僅描述了包含角叉藻聚 糖作為穩定劑的親脂性組合物（脂質凝膠（lipogel))。但是，通常由該物質發揮的炎性作 用為技術人員已知。在任何情況下，不考慮其來源，膠原酶在水性載體中具有極低的穩定 性，因此總是配制在完全親脂的載體中；Santyl?、Noruxol?和BionectStart?,是具 有全親脂基的軟膏劑，其中酶絕非均勻分布，且隨時間推移而經歷顯著的活性喪失。
[0002] 親脂性載體確保酶的穩定性和藥物產品的可保存性，而對其治療活性不利；膠 原酶非常緩慢地從親脂性載體釋放，以致其生物利用率極大地受限。膠原酶也可以用于 諸如粘連性囊炎（凍結肩）、掌攣縮病（Dupuytren'scontracture)、纖維性海綿體炎 (Peyronie'sdisease)、蜂窩織炎和手術后粘連的障礙的全身治療，尤其是通過注射。在水 性載體中的穩定性對這些應用至關重要。用于掌攣縮病的注射治療的產品目前已上市（在 使用時復溶的親液物質），該產品以精確的重量比包含通過發酵溶組織梭菌（Clostridium histolyticum)提取和純化的兩種膠原酶的混合物。
[0003] 如已述，后者是膠原酶最常見的來源之一；但是，它是需要厭氧發酵的致病微生物 (Mandl,I?等，1958,ArchBiochemBiophys, 74:465-475)。
[0004] 1972年首次鑒定了無色桿菌屬（Achromobacter)的一些菌株的溶膠原活性 (Thomson,J.A.，Woods,D.R?和Welton,R.L. 1972)，隨后對解毒無色桿菌（Achromobacter iophagus)菌株（隨后重新歸類為溶藻弧菌解毒化學變型（Vibrioalginolyticus chemovar.iophagus)，Emod,I?等1983)進行了第一批研究，這些研究證明了具有高比活的 膠原酶的存在（Welton和W〇〇dsl973)。關于用來通過發酵產生膠原酶的微生物的選擇，溶 藻弧菌的使用比溶組織梭菌更有利，因為它是非致病性的，且允許在需氧環境中進行發酵， 具有相當大的工業優勢。微生物菌株的致病性是重要方面，因為成品中的任意雜質（微生 物或蛋白質殘余物）可引起嚴重的副作用。操作致病菌株明顯需要在純化階段特別注意， 因此是更復雜、昂貴的工業方法。
[0005] 產生自溶藻弧菌的微生物膠原酶EC3. 4. 24. 3是Zn2+金屬酶，其還因許多原因而 不同于由溶組織梭菌產生的膠原酶：
[0006] ?它特異性作用于合成肽Pz-Pro-Leu-Gly-Ala-D-Arg(其中PZ= 4-苯基偶氮 芐基氧羰基），該合成肽是選擇用于評價溶膠原活性的合成底物。按照本發明產生的來自 溶藻弧菌的膠原酶是唯一一種能夠在Leu-Gly鍵處分解膠原的膠原酶（Keil，B.，Gilles 八.-]\1.，1^。1'〇1867，六.，11111'；[011，1和1'0叫，1-1'.1975;1(6；[113.]\^1：1'1叉3卯卩1.1992; 1:127-33)；
[0007] ?它具有比獲自溶組織梭菌的類似物高得多的蛋白水解活性；
[0008] ?它在天然膠原的切割位點處具有特異性；它在2個位點處切割天然膠原的螺旋 鏈，優選在距N端3/4的Pro-Y-Gly-Pro序列的Y-Gly鍵處，其中Y是中性氨基酸。相反，來 自溶組織梭菌的膠原酶在天然膠原鏈中存在多個切割位點（Lecroisey，A.Keil，B. 1979)。
[0009] 溶藻弧菌解毒化學變型菌株僅產生一種膠原酶，但純化產物的SDS-PAGE分析證 明保持溶膠原活性的幾個具有不同分子量的條帶的存在。已將這些低分子量種類歸因于該 酶的自體蛋白水解過程，該過程受特別配制的緩沖液抑制（Keil-Dlouha，V. 1976)。
[0010] 1992年，Takeuchi等從溶藻弧菌克隆了編碼膠原酶的整個序列。從核苷酸序列 推斷的氨基酸序列顯示成熟膠原酶由739個氨基酸形成，具有81，875Da的分子量。來自 溶藻弧菌的膠原酶的核苷酸和氨基酸序列未與其他膠原酶的序列顯示任何顯著的相似性 (Takeuchi，H.，1992)。到目前為止，用于從所討論的菌株產生酶的方法產生相當低的產率 及尤其是對注射用途而言具有不能令人滿意的純度的產物。專利EP0115974描述了用于 產生和純化來自溶藻弧菌膠原酶的方法；終產品是僅在加入牛皮膠原片段（ASF)后穩定的 酶混合物（膠原酶、中性蛋白酶和內切核酸酶）。
[0011] 所獲得的物質具有非常低的純度。此外，在通過注射施用所選擇的藥物組合物時， ASF的存在可以在制備所鑒定的藥物形式時或尤其是在它是動物來源的物質時產生問題。
[0012] 此外，如已述，目前已知的藥物組合物采用軟膏劑的形式，而對于局部應用，尤其 是對于全身施用，膠原酶處于極純的形式且在水性載體中穩定（以改善酶在組合物中的分 布）是至關重要的；絕對優選水性載體用于注射治療。
[0013] 本發明通過公開用于產生和純化來自溶藻弧菌的膠原酶的創新方法來克服這些 問題，該方法的特征在于高產率、重現性、穩定性及成品的高純度。成品還在水溶液中穩定， 因此可以甚至在-20°c和-80°c之間的溫度下長期保存而不遭受顯著損傷。
[0014] 由于高純度和膠原鏈上切割的特異性，本文所要求的膠原酶還可以用來解離組織 和分離細胞團或單細胞，以用于需要分離的細胞的所有實驗和治療方法。
[0015] 發明詳述
[0016] 本發明要求用于產生和純化通過非致病性需氧細菌溶藻弧菌解毒化學變型 (NCMB編號：11038,異名LMG3418,后文中稱為溶藻弧菌）產生的微生物膠原酶（微生物 膠原酶EC3.4.24.3)的新方法：該方法以穩定、可重現、便宜的發酵方法提供高產牛水平 的膠原酶。按照本文所述的產生和純化方法從溶藻弧菌產生的膠原酶的序列（SEQIDN0 : 1)的特征在于，與由來自溶藻弧菌的膠原酶基因編碼的814個氨基酸的序列（本文報道為 SEQIDN0 :2,對應于微生物膠原酶EC3.4. 24. 3)相比，缺失了氨基酸1-75。通過本發明 的方法，產生了成熟蛋白質，該成熟蛋白質是活性核心，由739個氨基酸組成，更確切而言， 由氨基酸76-814組成：
[0017] TACDLEALVTESSNQLISEILSQGATCVNQLFSAESRIQESVFSSDHMYNIAKHTTTLAKGYTGGGSDE LETLFLYLRAGYYAEFYNDNISFIEWVTPAVKESVDAFVNTASFYENSDRHGKVLSEVIITMDSAGLQHAYLPQVTQ WLTRWNDQYAQHffYMRNAVNGVFTILFGGQffNEQFVQIIGNQTDLAKALGDFALRASSIGAEDEFMAANAGRELGRL TKYTGNASSVVKSQLSRIFEQYEMYGRGDAVWLAAADTASYYADCSEFGICNFETELKGLVLSQTYTCSPTIRILSQ NMTQEQHAAACSKMGYEEGYFHQSLETGEQPVKDDHNTQLQVNIFDSSTDYGKYAGPIFDISTDNGGMYLE⑶PSQP GNIPNFIAYEASYANADHFVWNLEHEYVHYLDGRFDLYGGFSHPTEKIVWWSEGIAEYVAQENDNQAALETILDGST YTLSEIFETTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFENHKDDVNQMLVETRQGNWINYKATITQWANLYQSEFEQWQQTLVS NGAPNAVITANSKGKVGESITFSSENSTDPNGKIVSVLWDFGDGSTSTQTKPTHQYGSEGEYSVSLSVTDSEGLTAT ATHTVVISALGGNDTLPQDCAVQSKVSGGRLTAGEPVCLANQQTIWLSVPAVNESSNLAITTGNGTGNLKLEYSNSG WPDDTNLHGWSDNIGNGECITLSNQSNYWGYVKVS⑶FENAAIVVDFDAQKCRQ(SEQ ID NO :1)
[0018] 此外，按照本發明的方法從溶藻弧菌產生的膠原酶還具有優于其他微生物膠原酶 的比活，￥純，在水溶液中穩定，目.可以冷凍而無顯著損傷。
[0019] 因此，本發明的另一個目的是按照所述的產生和純化方法獲得的膠原酶，其用于 表征為膠原的累積的病理的治療性處理，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕疵/缺陷的 處理；例如，值得一提的是，多種來源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷、燙傷和肥大性瘢 痕、蜂窩織炎、手術后粘連，以及"凍肩"或粘連性囊炎、掌攣縮病、陰莖纖維性海綿體炎。
[0020] 本發明的另一目的是包含按照所述的產生和純化方法獲得的膠原酶的藥物組合 物，其用于表征為膠原的累積的障礙的治療性處理，或用于從減少局部膠原累積受益的瑕 疵/缺陷的處理；實例是多種來源的皮膚潰瘍、褥瘡、不同程度的燒傷、燙傷和肥大性瘢痕、 蜂窩織炎、手術后粘連、粘連性囊炎（凍肩）、掌攣縮病和陰莖纖維性海綿體炎。
[0021] 按本文所述獲得的膠原酶還適合應用于組織解離，及細胞團或單細胞的分離。此 應用用于例如胰島細胞移植方法，以從周圍胰腺組織分離胰島細胞，且通常用于需要組織 解離的所有實驗和治療方法。
[0022] 通過下文所述的方法獲得的膠原酶表征為：
[0023] 分子量為82Kda ;
[0024]比活在1000和1800nkat/mg之間；
[0025] 純度在98. 0和100%之間；
[0026] 缺乏微生物和蛋白質污染物，特別是缺乏內毒素和DNA ;
[0027] 在5. 5和11之間的pH下穩定；
[0028] 在4°C和40°C之間的T下在水溶液中穩定，尤其是在37°C下穩定；
[0029] 在4°C下在水溶液中穩定30天；
[0030] 在-20°C和-80°C之間的T下在水溶液中穩定24-48個月；
[0031] 獲得穩定冷凍粉末的親液性（lyophilisability)。
[0032] 它優選還表征為：
[0033] N端序列：H2N-Thr-Ala-Cys-Asp-Leu-Glu-Ala-Leu-Val-Thr-Glu-Se;r-Se;r-Asn-G ln(SEQ ID NO:3)；
[0034] 受Ag和Cu鹽及螯合劑EDTA抑制；
[0035] 可在_20°C和-80°C之間的溫度下（即以冷凍形式）保存而無酶活性的顯著喪失 (5-15% )〇
[0036] 本發明的膠原酶產生和純化方法包括以下階段：
[0037] 階段A:將溶藻弧菌解毒化學變型接種入三角瓶，并用非牛動物來源的培養液發 酵；
[0038] 階段B:通討用100_500kD分子量截留（MWC0)盒（優選300kD)進行切向流超濾 (TFF1)來澄清這樣獲得的發酵液；
[0039] 階段C:通討用5-30kDMWC0盒（優選10kDMWC0)進行切向流超濾（TFF2)來透 析和濃縮階段B中獲得的澄清培養基；
[0040] 階段D:在6. 9和7. 4之間的pH下，優選在7. 1的pH下，通過攜帶弱堿性基團的 陰離子交換樹脂來純化階段C中獲得的含有膠原酶的溶液；
[0041] 階段E:通討用10-50kDMWC0盒（優選30kDMWC0)進行切向流超濾（TFF3)來透 析和濃縮所收集的源自階段D的具有溶膠原活性的級分；
[0042] 蹌段￡:在6. 9和7. 4之間的pH下，優選在7. 1的pH下，通過攜帶強堿性基團的 陰離子交換樹脂來純化這樣獲得的溶液；
[0043] 階段G:通討用10_50kDMWC0盒（優選30kDMWC0)進行切向流超濾（TFF4)來滲 濾和濃縮源自階段F的具有> 95%的溶膠原活性的級分；
[0044] 階段H:通過0.2um絕對過濾器過濾這樣獲得的含有膠原酶的溶液，并保存 在-20°C和_80°C之間的溫度下。
[0045] 在每個階段結束時用下文"測試方法"段落中所述的材料和方法測試。
[0046] 階段A:是分批發酵法；在含有培養液的三角瓶中制備接種物，該培養液由非牛動 物來源（如豬來源）的蛋白胨或非牛動物和植物來源的蛋白胨的混合物、NaCl、CaCljP TRIS(三羥甲基氨基甲烷）在6. 9和7. 4之間，優選7. 1的pH下形成。在600nm下測量的 光密度（〇D_J達到1和4之間的值時，接種物即可轉移至發酵罐。
[0047] 用來進行發酵的培養基與用來制備接種物的相同，加入少量消泡劑來防止由通氣 和攪拌引起的泡沫形成。
[0048] 一次發酵持續14-20小時，通常為16小時。發酵期間，通過無菌方法取樣來檢驗 純度、〇D6Q(lmi、酶活性和pH。
[0049] 在酶活性彡25,OOOnkat/升時，終止發酵，并加入0&(：12來穩定酶。使溫度降至約 8 °C，并使混合物處于攪拌之下。
[0050]對在階段A獲得的溶液進行以下控制測試：0D6(l(lnm、pH、酶活性、蛋白質濃度、 SDS-PAGE。
[0051] 除目的膠原酶外，源自階段A的發酵液含有（present)在發酵期間由細菌產生的 其他蛋白酶（主要是絲氨酸蛋白酶）、具有高分子量的蛋白質聚集體和培養基的殘留物。
[0052] 階段B:通討用100_500kDMWC0盒（優選300kD)進行切向流超濾（TFF1)來澄清 源自階段A的發酵液；這消除了微生物細胞和具有高分子量的蛋白質聚集體。
[0053] 對在階段B獲得的溶液進行以下控制測試：pH、酶活性、蛋白質濃度、SDS-PAGE、酪 蛋白酶測定。
[0054] 階段C:通討用5-30kDMWC0盒（優選10kDMWC0)進行超濾來濃縮和透析源自階 段B的澄清培養基15-25倍。在階段C獲得的溶液通常含有500-700nkat/ml的酶活性，且 在-20°C下穩定12個月。用5-30kDMWC0盒進行的切向流過濾的目的是顯著減小體積，并 用25mMTRIS-HCl、10mMCaCl2、pH7. 1緩沖液替換培養基，該緩沖液穩定膠原酶，且適合用 于隨后的純化方法。
[0055] 對在階段C獲得的溶液進行以下控制測試：pH、酶活性、蛋白質濃度、SDS-PAGE。
[0056] 階段D:用攜帶二乙基氨基烷基，優選二乙基氨基乙基的陰離子交換樹脂，如 DE-52 (二乙基氨基乙基纖維素DEAEWhatman)對源自階段C的含有膠原酶的溶液進行第一 次層析純化。這些樹脂攜帶弱堿性基團，因此在6. 9和7. 4之間的窄pH范圍內，優選7. 1 具有依賴于pH的離子化程度。
[0057] 然后將源自階段C的含有膠原酶的溶液上樣至用DE-52樹脂裝填的柱（Pall ChromatographyColumnResoluteMod. 400-V-EP7040)內。通過紫外-可見光檢測器在 280nm監測層析運行。
[0058] 在對柱進行上樣前，用與在階段C期間在其中透析膠原酶的緩沖液相同的緩沖液 (后文稱為"平衡緩沖液"（25mMTRIS-HCl、10mMCaCl2、pH7. 1))平衡柱。
[0059] 上樣后，用相同的平衡緩沖液洗脫具有結合的膠原酶的樹脂，以消除未與樹脂結 合的蛋白質。用具有更高電導的緩沖液（后文稱為"洗滌緩沖液"（300mMTRIS-HC1和 10mMCaCl2、pH7. 1))進行第二次洗滌，以消除低分子量雜質。用稱為"洗脫緩沖液"(300mM TRIS-HCl、700mMNaCl和10mMCaCl2、pH7. 1)的第三緩沖液通過進一步提高電導來洗脫與 樹脂結合的膠原酶。
[0060] 階段E:將洗脫期間收集的含有膠原酶活性且在SDS-PAGE中顯示良好純度的級分 組合，并轉移至具有10_50kDMWC0盒（優選30kD)的超濾系統，以在穩定膠原酶且適合用 于隨后的純化方法的緩沖液中濃縮和透析。
[0061] 對在階段E獲得的溶液進行以下控制測試：pH、酶活性、蛋白質濃度、SDS-PAGE、酪 蛋白酶測定。
[0062] 階段F:將源自階段E的溶液轉至具有陰離子交換層析的第二純化階段，該陰離子 交換層析使用攜帶由季銨形成的強堿性交換基團的樹脂，如Source?15Q(GE Healthcare)。 通過紫外-可見光檢測器在280nm監測層析運行。
[0063] 上樣前，用與在階段E期間在其中透析膠原酶的緩沖液相同的緩沖液（平衡緩沖 液）平衡用Source?15Q樹脂裝填的柱（MilliporeGS70-550)。
[0064] 將源自階段E的含有膠原酶的溶液上樣至柱中，并用平衡緩沖液洗脫具有結合的 膠原酶的樹脂，以消除未結合的蛋白質。用第二緩沖液（洗脫緩沖液，2-300mMTRIS-HC1和 10mMCaCl2、pH7. 1)通過進一步提高電導來洗脫與樹脂結合的膠原酶。
[0065] 階段G:將洗脫期間收集的含有溶膠原活件目.在SDS-PAGE中顯示彡95%的純度的 級分組合，并轉移至具有10_50kDMWC0盒（優選30kD)的超濾系統，以在穩定膠原酶的緩 沖液中濃縮和透析。
[0066] 對在階段G獲得的溶液進行以下控制測試：pH、酶活性、蛋白質濃度、SDS-PAGE。 [0067] 階段H:將源自階段G的膠原酶溶液稀釋在穩定緩沖液中，并濾過0. 2ym絕對過 濾器。這樣獲得的無菌溶液是純化方法的終產品，針對以下特征進行分析：
[0068]-蛋白質濃度
[0069] _酶活性
[0070] -pH
[0071] _酪蛋白酶測定
[0072]-SDS純度
[0073] -UPLCSEC二聚體和高分子量分析
[0074] _內毒素
[0075] -無菌測試
[0076] 分析方法
[0077]膠原酶的酶活性的分光光度測定（Wilnsch，E.，&Heidrich，H.G.，修改）
[0078] 本方法允許測定存在于水溶液中的膠原酶的活性。活性表示為開特，其定義為在 方法指定的條件下在1秒內催化1摩爾底物的轉化的酶的量。與所分析的溶液的量相關的 在37°C和pH7. 1下在預設時間內催化底物轉化的酶的量表示為nkat/ml。該方法的原理基 于膠原酶和膠原酶特異的合成底物PZ-L-脯氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨 酸（其中PZ= 4-苯基偶氮芐基氧羰基）之間的反應。與膠原酶反應后，合成底物切割為 2個片段：PZ_L_脯氨酰-L-殼氨酰和甘氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酸。第二片段是無色的， 而第一片段是生色團，且可以在用用檸檬酸酸化的乙酸乙酯的有機溶液萃取后通過分光光 度法測定。該片段在320nm的吸光度與酶活性成比例。
[0079] 為了進行酶促測定，有必要制備樣品的一系列稀釋液，以使酶濃度落入該方法的 線性范圍。
[0080] 將待分析的樣品稀釋在25mMTris、10mMCaCl2、pH7. 1緩沖液中；使0. 5ml此緩 沖溶液與2ml1. 23mM的合成底物溶液在37°C反應15分鐘。在酶促反應結束時，用含5:1 乙酸乙酯和0. 5%檸檬酸的混合物、pH3. 5的有機相萃取0. 5ml反應混合物。去除有機相， 并通過加入300mg無水硫酸鈉來脫水。在320nm通過分光光度法針對乙酸乙酯分析經脫水 的有機相。用以下公式計算表示為nkat/ml的酶活性的結果：
【權利要求】
1. 用于產生和純化來自溶藻弧菌解毒化學變型的膠原酶的方法，其包括以下階段： 階段A :將溶藻弧菌解毒化學變型接種入三角瓶，并用非牛動物來源的培養液發酵； 階段B :通過用100-500kD分子量截留（MWCO)盒，優選用300kD分子量截留（MWCO)盒， 進行切向流超濾來澄清這樣獲得的發酵液； 階段C :通過用5-30kD MWCO盒，優選用10kD MWCO盒，進行切向流超濾來透析和濃縮 階段B中獲得的澄清培養基； 階段D :在6. 9和7. 4之間的pH下，優選在7. 1的pH下，通過攜帶弱堿性基團的陰離 子交換樹脂來純化階段C中獲得的含有膠原酶的溶液； 階段E :通過用10-50kD MWCO盒，優選用30kD MWCO盒，進行切向流超濾來透析和濃縮 階段D中收集的具有溶膠原活性的級分； 階段F :在6. 9和7. 4之間的pH下，優選在7. 1的pH下，通過攜帶強堿性基團的陰離 子交換樹脂來純化這樣獲得的溶液； 階段G :通過用10-50kD MWCO盒，優選用30kD MWCO盒，進行切向流超濾來滲濾和濃縮 源自階段F的具有> 95%的溶膠原活性的級分； 階段H :通過0. 2 y m絕對過濾器過濾這樣獲得的含有膠原酶的溶液，并保存在-20°C 和-80°C之間的溫度下。
2. 權利要求1的方法，其中培養基具有豬動物來源，或是豬和植物來源的混合物。
3. 權利要求1或2的方法，其中攜帶弱堿性基團的陰離子交換樹脂攜帶二乙基氨基烷 基，優選攜帶二乙基氨基乙基；攜帶強堿性基團的陰離子交換樹脂攜帶季銨基團。
4. 按照權利要求1-3中任一項產生和純化的來自溶藻弧菌解毒化學變型的膠原酶，其 特征在于： 分子量為82Kda ; 比活在1000和1800nkat/mg之間； 純度在98. 0和100%之間； 缺乏微生物和蛋白質污染物； 在5. 5和11之間的pH下穩定； 在4°C和40°C之間的T下在水溶液中穩定，尤其是在37°C下穩定； 在4 C下在水溶液中穩定30天； 在-20°C和_80°C之間的T下在水溶液中穩定24-48個月； 獲得穩定親液粉末的親液性。
5. 權利要求4的膠原酶，其在pH 7. 1下在包含25mM TRIS-HC1和10mM CaCl 2的水溶 液中穩定。
6. 權利要求4或5的膠原酶，其處于具有7-20nkat/mg粉末范圍內的酶活性的穩定親 液粉末的形式，其包含： -麥芽糖：95-96%，優選 95. 75% ; -鹽：1. 0-1. 5%，優選 1.3% ; -膠原酶：2. 5-3. 5%，優選 2. 95%。
7. 權利要求4-6中任一項的膠原酶，其用于治療不同程度的燒傷、褥瘡、燙傷、多種來 源的皮膚潰瘍、血管性和糖尿病性潰瘍、蜂窩織炎、手術后粘連、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩。
8. 權利要求4-6中任一項的膠原酶，其用于治療粘連性囊炎、掌攣縮病和陰莖纖維性 海綿體炎。
9. 用于局部用途的藥物組合物，其處于撲粉的形式，其包含： 權利要求4或6中的膠原酶，其量在等同于2和8nkat/g成品之間，優選量為5nkat/g 成品； 羥乙酸玉米淀粉，其量為達到百分比組成所需的量； 可選地，重量平均分子量在130和230kDa之間，優選145和210kDa之間、甚至更優選 160和200kDa之間的透明質酸，其量在0. 1和5%之間，優選量在0. 2和2%之間； 可選地，膠態二氧化硅，其量在0. 1和3%之間，優選量在0.2和1%之間。
10. 可注射藥物組合物，其每個單位劑量包含： 凍干形式的權利要求4或6中的膠原酶，其量為等同于120和450nkat之間的活性的 量； 無菌鹽溶液； 可選地，重量平均分子量在750和1200kDa之間的透明質酸，其濃度為1和30mg/ml鹽 溶液之間，優選濃度為8和20mg/ml之間、甚至更優選濃度為10和15mg/ml之間。
11. 權利要求9的藥物組合物，其用于不同程度的燒傷、燙傷、褥瘡、血管性和糖尿病性 潰瘍、蜂窩織炎、手術后粘連、肥大性瘢痕和瘢痕疙瘩的外部和/或局部治療。
12. 權利要求10的藥物組合物，其用于治療粘連性囊炎、掌攣縮病和陰莖纖維性海綿 體炎。
【文檔編號】A61K38/48GK104508127SQ201380020103
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年4月17日 優先權日:2012年4月18日
【發明者】S·瓦卡羅, M·卡普托, C·庫帕里, G·蓋恩納里 申請人:菲迪亞制藥股份公司