穩定的水性抗體組合物的制作方法

穩定的水性抗體組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供包含濃度為至少約10mg/mL的抗體蛋白質和乙烯亞胺寡聚物的水溶液，其中寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目(n)在2-12的范圍內。
【專利說明】穩定的水性抗體組合物

【背景技術】
[0001] 雖然多種化學過程（如氧化、脫酰胺作用和天冬氨酸異構化）可以影響治療性蛋 白質（如抗體）的重要質量屬性，但蛋白質聚集可論證地是最常見的影響蛋白質穩定性的 過程。聚集通常是加重的，且是以高濃度（如l〇mg/ml或更高）配制在水溶液中的蛋白質 的關鍵降解途徑。在保存期間，聚集可以導致制劑中不可接受的高水平的高分子量種類 (HMWS)，或導致更大的不溶性聚集體（微粒）的形成。這類受污染的制劑可以落在美國食 品與藥品管理局及其他藥物監管機構設定的規格之外。
[0002] 在某種程度上，可以通過優化蛋白質組合物的多種參數來控制蛋白質聚集。例如， 控制聚集率的方法可以涉及優化pH、加入金屬離子螯合劑或加入表面活性劑。
[0003] 組合物的離子強度也可以影響水性蛋白質組合物的聚集率。因此，治療性蛋白質 的常規制劑開發通常包括滲漲度調節劑（tonicity modifier)的篩選，滲漲度調節劑可以選 自不帶電荷的化學種類，如糖，或帶電荷的化學種類，如無機鹽或有機鹽。如果聚集率在低 離子強度組合物中較低，則通常優選不帶電荷的滲漲度調節劑，如果聚集率在較高離子強 度組合物中較低，則優選帶電荷的滲漲度調節劑。通常在用于治療性應用的水性蛋白質組 合物中使用的帶電荷的滲漲度調節劑包括氯化鈉。典型的不帶電荷的滲漲度調節劑包括蔗 糖、海藻糖、甘油和甘露醇。
[0004] 蛋白質聚集是非常復雜的過程，涉及許多不同的機制。但是，據信，兩種主要類型 的非共價相互作用驅動蛋白質聚集：（1)蛋白質分子的非極性部分之間的疏水相互作用； 和（2)蛋白質分子的帶電荷區域之間的電荷-電荷相互作用。據信，當聚集率在較高離子 強度的組合物中比在較低離子強度的組合物中低的那些情況下，聚集的關鍵原因是由于蛋 白質分子之間的電荷-電荷相互作用。
[0005] 但是，如果能夠控制蛋白質聚集的溶液和組合物將用于治療性應用，則它們顯示 有利的毒性譜也至關重要。因此，可以用來降低蛋白質聚集率的任意添加劑自身必須具有 有利的毒性譜。
[0006] 因此，存在對用于制備穩定、高度濃縮的蛋白質溶液，尤其是具有有利的毒性譜并 因此適合用于治療性應用的高度濃縮的抗體溶液的改進方法的需要。
[0007] US 2007/0036866 (Kissel等）描述了包含PEI和PEG殘基的陽離子嵌段聚合物。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明涉及抗體蛋白質，尤其是處于高濃度的抗體蛋白質的聚集問題。本發明還 涉及提供顯示有利的毒性譜且適合用于治療性應用的濃縮抗體溶液的問題。預期本發明的 應用導致水性抗體蛋白質組合物中的聚集率顯著降低，同時提供顯示有利的毒性譜并因此 可以用于治療性應用的組合物。本發明還涉及抗體蛋白質及尤其是處于高抗體蛋白質濃度 的抗體蛋白質水性組合物中的自締合問題，同時提供抗體蛋白質的顯示有利毒性譜的治療 用組合物。
[0010] 在一個實施方案中，本發明涉及包含濃度為至少約10mg/mL的抗體蛋白質和乙烯 亞胺的寡聚物的水溶液，其中該寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12的范圍內。
[0011] 在一個實施方案中，本發明提供降低濃度為至少約l〇mg/mL的水溶液中的抗體蛋 白質的聚集率的方法。該方法包括向該溶液中加入乙烯亞胺的寡聚物的步驟，其中η = 2-12。
[0012] 在一個實施方案中，本發明可以提供降低抗體濃度為至少約10mg/mL的水性抗體 蛋白質溶液在保存期間的黏度增加速率的方法。該方法包括向該溶液中加入乙烯亞胺的寡 聚物的步驟，其中η = 2-12。
[0013] 在一個實施方案中，本發明可以提供降低濃度為至少約10mg/mL的水溶液中的抗 體蛋白質的不希望的片段化的速率，該速率通過保存期間低分子量種類的形成來檢測。具 體而言，這種不希望的片段化可以發生在包含一種或多種抗體片段的融合蛋白質中。該方 法包括向該溶液中加入乙烯亞胺的寡聚物的步驟，其中η = 2 - 12。
[0014] 本文公開的某些乙烯亞胺寡聚物是新的，因此作為本發明的一個方面要求保護。 因此，本發明還提供式（V)的化合物：
[0015] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0016] 式 V
[0017] 其在下文中更詳細地描述，其用于本發明的溶液、組合物和方法。
[0018] 預期本文所述實施方案的溶液和組合物顯示有利的毒性譜并因此適合用于治療 性應用。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1A-1F顯示乙烯亞胺的PEG化和非PEG化寡聚物及5k mPEG在40°C對利妥昔單 抗（rituximab)制劑的聚集率的影響。
[0021] 圖2顯示PEI的大小對HEK293和Vero細胞的細胞毒性作用的影響。
[0022] 圖3顯示乙烯亞胺寡聚物的大小對Vero細胞抑制的影響。每個點旁邊的數字表 示所測試的寡聚物或聚合物的分子量（Da)。
[0023] 圖4顯示乙烯亞胺寡聚物的大小對MDCK細胞抑制的影響。每個點旁邊的數字表 示所測試的寡聚物的分子量（Da)。
[0024] 圖5顯示五亞乙基六胺和2K mPEG戊酸酰氨基五亞乙基六胺（化合物（1))對Vero 細胞抑制的影響。
[0025] 發明詳述
[0026] 本發明涉及其中η = 2-12的乙烯亞胺寡聚物穩定高度濃縮的抗體水溶液（即至 少約10mg/mL的濃度）同時預期顯示有利的毒性譜的發現。具體而言，預期本發明的乙烯 亞胺寡聚物顯示比高級同系物（例如，分子量大于600Da的聚乙烯亞胺）更有利的毒性譜。
[0027] 由于此預期的有利毒性譜，本發明尤其適用于治療性應用的抗體蛋白質的水性組 合物。
[0028] 與現有的用于穩定抗體蛋白質的高濃度水性制劑的方法相比，尤其是就降低的聚 集率和可逆的自締合而言，本發明提供了幾個優勢。例如，本發明應允許更合理的制劑開發 方法，在設計試驗制劑中需要更少的試驗和差錯。結果是，這使得能夠以加速、更低成本的 途徑來優化符合保存穩定性和對低體積皮下注射的適合性的關鍵性能要求的制劑。
[0029] 與現有技術的方法相比，本發明所顯示的穩定性益處和預期的有利毒性譜應使得 能夠使用治療上重要的抗體蛋白質的更高濃度水性制劑。
[0030] 本文所用的術語"抗體蛋白質"指抗體、抗體片段、與活性部分綴合的抗體、包含一 種或多種抗體片段（如免疫球蛋白Fc結構域）的融合蛋白質、或前述任一種的衍生物。衍 生物的實例包括綴合衍生物，例如，與另一部分綴合的抗體或抗體片段。這類部分包括化學 惰性聚合物，如PEG。優選的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，優選單克隆抗體。單克隆 抗體可以是例如哺乳動物或禽類抗體、嵌合抗體（例如人/小鼠或人/靈長類嵌合體）、人 源化抗體或全人抗體。適宜的抗體包括免疫球蛋白，如IgG(包括IgGpIgGylgQ* IgG4)、 IgM、IgA(如IgAi或IgA2)、IgD、IgE或IgY。適宜的抗體還包括單鏈抗體。還包括抗體片 段，包括Fc、Fab、Fab 2、ScFv片段等。還包括單結構域抗體，包括納米抗體。
[0031] 抗體蛋白質優選是治療性抗體蛋白質。這種抗體蛋白質具有希望的治療或預防活 性，且標示用于治療、抑制或預防疾病或醫學障礙。
[0032] 術語"PEI"指聚乙烯亞胺（包含多個重復基團的乙二胺聚合物），其可以可選地被 衍生化。
[0033] 術語"0ΕΙ"指包含2-12個重復單位的乙烯亞胺寡聚物，其可以可選地被衍生化。
[0034] 本文所用的術語"水溶液"指水中，優選蒸餾水、去離子水、注射用水、無菌注射用 水或注射用制菌水中的溶液。本發明的水溶液包含溶解的抗體蛋白質、乙烯亞胺寡聚物及 可選的一種或多種添加劑和/或賦形劑。水溶液還可以包含一種或多種部分溶解或不溶解 的成分，如添加劑或賦形劑。這種或這類成分的存在將產生多相組合物，如懸液或乳狀液。 優選地，如通過眼睛或光散射確定，本發明的水溶液是均相溶液。
[0035] 寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯亞胺寡聚物通常基 本上由其中η在2-12范圍內的化學式-(CH 2CH2NH)η-的部分或其支化衍生物組成，或包含其 中η在2-12范圍內的化學式_(CH 2CH2NH)n-的部分或其支化衍生物。線性乙烯亞胺寡聚物 僅包含仲氨基（不考慮寡聚物的末端官能度），而支化的乙烯亞胺寡聚物可以包含伯氨基、 仲氨基和叔氨基。在本發明中，也考慮包含線性和支化的乙烯亞胺寡聚物的混合物的水溶 液。適宜地，本發明的乙烯亞胺寡聚物是線性的。
[0036] 例如，n = 2、n = 3、n = 4、n = 5、n = 6、n = 7、n = 8、n = 9、n = 10、n = 11 或 11=12。在一個實施方案中，11 = 3-12、4-12、5-12或6-12。在另一實施方案中，11 = 2-11、 2-10、2-9、2-8、2-7、2-6或2-5，例如3-5。在另一實施方案中，11 = 3-9、4-8或5-7。還在 另一實施方案中，η = 2-ll、3-ll、4-10、5-9或6-8。還在另一實施方案中，η = 4-7、4-6或 4-5。其中η = 2-12的乙烯亞胺寡聚物可以是衍生化的或未衍生化的。在一個實施方案中， 乙烯亞胺寡聚物是未衍生化的，且適宜地選自二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺 和五亞乙基六胺。未衍生的乙烯亞胺寡聚物成本較低，且比對應的衍生化寡聚物更易于獲 得。
[0037] 術語"乙烯亞胺寡聚物"包括其中例如通過惰性聚合物或封端基團衍生化（例如 化學修飾）寡聚物的一個或多個末端的衍生物。
[0038] 本文所用的"Ci-C；烷基"定義為包含1-6個碳原子的直鏈或支化的脂肪族碳鏈，例 如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基，及對應的亞燒 基，如亞甲基、1，2-亞乙基等。
[0039] 還可以用化學惰性聚合物衍生化乙烯亞胺寡聚物。除非另有說明，本文所用的術 語"聚合物"包括共聚物。化學惰性聚合物可以例如通過提高水溶性、提高穩定性或降低 毒性來賦予乙烯亞胺寡聚物本身物理化學益處。備選地或此外，化學惰性聚合物可以例如 通過增強乙烯亞胺寡聚物在減少抗體蛋白質聚集中的作用來賦予水溶液中的抗體蛋白質 物理化學益處。在一個實施方案中，用選自聚乙二醇（PEG和mPEG(mPEG是用甲氧基封端 的聚乙二醇聚合物））、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的一種或多種聚合物衍生化乙烯亞胺寡 聚物。在另一實施方案中，用共聚物衍生化乙烯亞胺寡聚物，其中該共聚物由選自聚乙二 醇（PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的聚合物（和/或其相關單體）組成。適宜 的聚氨基酸包括具有不帶電荷的側鏈或無側鏈的那些，且包括聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚纈氨 酸、聚亮氨酸、聚異亮氨酸和聚苯丙氨酸。適宜地，用一個或多個聚乙二醇（PEG)基團衍生 化乙烯亞胺寡聚物。
[0040] 在用化學惰性聚合物衍生化乙烯亞胺寡聚物時，該聚合物通常具有約500至約 lOOOODa，例如約1000至約5000Da的范圍內的分子量。
[0041] 聚合物聚乙二醇（例如PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)在化學式上定義為PEG-0-、 mPEG-Ο-和PPG-0-(及其共聚物），即PEG、mPEG、PPG或共聚物分子在作為衍生物發揮作用 時以-0-終止。例如，在代表件化學式PEG-0-(OiOiNH) ,Η或PEG-0-0EI中，-〇-部分與PEG 分子締合而不是與乙烯亞胺寡聚物締合。在這種背景下，本文所用的"PEG"和"PEG-0-"應 認為是在結構上等同，只是在后一種情況下，明確地定義了 PEG的末端基團。以類似的方 式，取決于它所結合的寡聚物上的基團的官能度，本文在化學式上將聚氨基酸定義為包括 氨基端或羧基端。例如，在代表性化學式[聚氨基酸]-MI-(ch 2ch2nh)4H中，-腿-部分與聚 氨基酸締合。備選地，在代表性化學式H 2N- (CH2CH2NH) ,-C(0)~ [聚氨基酸]中，-cm-部分 與聚氨基酸締合。
[0042] 如果存在的話，化學惰性聚合物可以是封端的，即以通常與具體聚合物相關的官 能度不同的官能度終止。例如，在一個實施方案中，該化學惰性聚合物是聚乙二醇，且用甲 氧基封端，即Me0CH2CH2-PEG-0-。如之前所述，用甲氧基封端的聚乙二醇聚合物可以表示為 "mPEG"。在優選實施方案中，用一個或多個PEG或mPEG基團衍生化乙烯亞胺寡聚物。PEG或 mPEG亞單位可以選擇最佳大小。在一個實施方案中，PEG或mPEG為約500Da至約10000Da， 例如約1000Da、2000Da或5000Da。希望得到PEG和mPEG亞單位的低多分散性。優選地，多 分散性小于1. 2,更優選小于1. 1。
[0043] 可以通過可選的橋連基（即定位在乙烯亞胺寡聚物和衍生化基團（例如封端基團 或載體基團或化學惰性聚合物）之間的基團）來衍生化乙烯亞胺寡聚物。可選的橋連基優 選具有低反應性，且對本發明的組合物的水溶液中的水解穩定。例如，適宜的橋連基包括 羰基、酰胺、氨基甲酸酯和脲。可選地，可以在該橋連基和衍生化基團之間插入亞烷基（如 c2-c1(l亞烷基或c3-c1(l亞烷基）。優選地，橋連基是可選地與亞烷基連接的酰胺。在備選實 施方案中，橋連基僅由c 3-c1(l亞烷基組成，適宜地，c3-c6亞烷基，更適宜地，c 3或c4亞烷基， 其在乙烯亞胺寡聚物的一個末端與NH直接連接。
[0044] 可以按上文所述衍生化乙烯亞胺寡聚物，其中衍生化寡聚物的一個或多個末端。 備選地，可以衍生化乙烯亞胺寡聚物的一個或多個末端，且可以用-H或惰性封端基團封端 寡聚物的一個或多個備選末端。
[0045] 適宜的惰性封端基團包括-CfQ烷基、-(C2_C6烷基）-0H和-(C 2_C6烷 基）-0- (CfC；烷基）。優選的封端基團是ch2ch2oh。
[0046] 備選地，乙烯亞胺寡聚物可以是未衍生化的，但可以用-Η或上文所述的惰性封端 基團在寡聚物的一個或多個末端封端。
[0047] 上文所述的任意乙烯亞胺寡聚物可以是線性的或支化的。
[0048] 在一個實施方案中，提供式I的乙烯亞胺寡聚物：
[0049] R-K-[CH2CH2NH]n-R
[0050] 式 I
[0051] 其中，K代表0或ΝΗ，η = 2-12,且每個R獨立地是Η或選自-Q-C；烷基、_(C2_C6 烷基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (Q-C；烷基）的惰性封端基團。
[0052] 在一個實施方案中，K代表NH。
[0053] 在一個實施方案中，提供式II的乙烯亞胺寡聚物：
[0054] X-Yr[CH2CH2NH]n-Y2-X
[0055] 式 II
[0056] 其中，η = 2-12,每個X獨立地選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙 二醇（PPG-0-)和聚氨基酸；Yi是可選的，且選自-(Qj-Ce)燒基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)燒 基-0C(0)-NH-、_(C2_C6)烷基-NHC(0)NH-和 _(CH上K-，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH ;Y2 選自(0) - (CQ_C6)燒基-、-C (0) 0 (C2_C6)燒基-、-C (0) -ΝΗ- (C2_C6)燒基-和-(CH2) m-， 其中 m = 2-10。
[0057] 在一個實施方案中，可選的￥1選自-(CQ-C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (C2-C6)烷基-NHC (0) NH-和-(CH2) J-，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0058] 在一個實施方案中，可選的￥1選自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH。
[0059] 在一個實施方案中，可選的￥1選自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0060] 在一個實施方案中，Y2 選自-c(o)-(c2-c6)烷基-、-c(o)o(c2-c 6)烷基-、-C(0)-NH-(C2-C6)烷基-和 _(CH2)m，其中 m= 2-10。
[0061] 在備選實施方案中，提供式III的乙烯亞胺寡聚物：
[0062] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0063] 式 III
[0064] 其中，η = 2-12 ;X選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙二醇 (PPG-0-)和聚氨基酸；Yi是可選的，且選自-(Qj-Ce)燒基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)燒 基-0C(0)-NH-、-(C2-C6)烷基-NHC(0)NH-和（CH上K，其中 m = 3-10，K 代表 0 或 NH;R 是 Η 或選自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C2-C 6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基團。
[0065] 在一個實施方案中，Yi是可選的，且選自-(Qj-Ce)燒基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)燒 基-0C (0) -NH-、- (C2-C6)烷基-NHC (0) NH-和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0066] 在一個實施方案中，可選的￥1選自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH。
[0067] 在一個實施方案中，可選的￥1選自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0068] 在式（III)的一個實施方案中，n = 2-12;X是PEG-0-或mPEG-0-，Y1缺乏，R是-H 或-CH2CH2OH。在另一實施方案中，η = 2-12 ;X是mPEG-O-A缺乏，R是-Η。在另一實施 方案中，η = 2-12 ;Χ是mPEG-0- Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一實施方案中，η = 2-8 ;Χ 是mPEG-0- Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一實施方案中，η = 2 ;Χ是mPEG-0- Α缺乏，R 是-CH2CH20H。在另一實施方案中，n = 5;X是mPEG-0-Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一實 施方案中，η = 8 ;X 是 mPEG-0- A 缺乏，R 是-CH2CH20H。
[0069] 在式（III)的一個實施方案中，η = 2-12 ;X是mPEG-O-J存在，且選自-(CQ-C6) 燒基-C (0) -NH-、- (C2_C6)燒基-〇C (0) -NH-、- (C2_C6)燒基-NHC (0) NH-和-(CH2)mK_，其中 m =3-10，K 代表 0 或 NH ;R 是-Η 或 CH2CH20H。在另一實施方案中，η = 4-8 ;X 是 m PEG-0- ;Y 是-(CQ_C6)燒基-C(0)_NH-，R是-Η。在另一實施方案中，η = 5 ;Χ是mPEG-〇-;Υ是_(C2)燒 基-C(0)-NH -，R是-H。在另一實施方案中，η = 5 ;X是mPEG-0- ;Y是-(C4)燒基-C(0)-NH-， R 是-Η。
[0070] 在備選實施方案中，提供式IV的乙烯亞胺寡聚物：
[0071] R-K-[CH2CH2NH]n-Y2-X 2
[0072] 式 IV
[0073] 其中，η = 2-12, K代表0或NH ;X2選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、 聚丙二醇（PPG-0-)和聚氨基酸；Y 2選自-(：(0)-%-(；)烷基-、-C(0)0(C2-C6)烷基-、-C (0) -NH- (C2_C6)燒基-和-(CH2)m-，其中 m = 2-10 ;R 是-H 或選自-CfCg 燒基、-(C2_C6 燒 基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (CfC；烷基）的惰性封端基團。
[0074] 在式IV的一個實施方案中，η = 2 ;K表示0, X2是11^6-0_ ;Y2是-C(0)-(C2) 烷基-;R是-Η。類似地，在式IV的另一實施方案中，η = 2 ;K代表0;X2是mPEG-0-;Y2 是-(CH2)3-;R 是- Η。在一個實施方案中，Υ2 選自-c(o)-(c2-c6)烷基-、-c(o)o(c2-c 6)烷 基-、-C(0)-NH-(C2_C6)燒基-和-(CH 2)m_，其中 m = 2-10。
[0075] 可以通過常規方法制備乙烯亞胺寡聚物（包括其衍生物），例如通過包括以下的 步驟：
[0076] ⑴聚合乙烯亞胺或聚合2-甲基-2-K惡唑啉或2-乙基-2-5惡唑啉，然后 通過堿水解脫酰。例如，此方法可應用于制備用mPEG衍生化的乙烯亞胺寡聚物，其中 用mPEG衍生物mPEG-X(其中X是NH 2、0H、0-甲磺酰基或0-甲苯磺酰基）作為聚合 的起始反應劑。這類方法可以基于Kissel等在US20070036866A1中及Akiyama等在 Macromolecules, 2000, 33, 5841-5845 中所述的那些方法。
[0077] (ii)通過與載體聚合物的活化羧基衍生物反應來酰化預形成的乙烯亞胺寡聚物。 例如，在基于mPEG的載體聚合物的情況下，適宜的活化羧基衍生物是mPEG-琥珀酰亞胺 基丙酸酯和mPEG-琥珀酰亞胺基戊酸酯，從而摻入烷基-酰胺橋連基。這類方法可以基于 Wagner等在US20040248842A1中及Schlu印在US20050031579A1中所述的那些方法。
[0078] (iii)使預形成的乙烯亞胺寡聚物與載體聚合物的異氰酸酯衍生物反應，從而摻 入烷基-脲橋連基。例如，在基于mPEG的載體聚合物的情況下，從mPEG-醇和1，6-己二 異氰酸酯制備適宜的異氰酸酯衍生物。這類方法可以基于Petersen等在Macromolecules 2002, 35, 6867-6874中所述的那些方法。
[0079] (iv)利用預形成的乙烯亞胺寡聚物和載體聚合物的醛衍生物的還原性胺化，從而 摻入（CH 2)m橋連基。例如，在基于mPEG的載體聚合物的情況下，適宜的醛衍生物是mPEG 丙醛和mPEG 丁醛。也可以利用相應的醛水合物。這類方法可以基于例如Kintsler在 US5824784中及Bentley和Harris在US5990237中所述的用于蛋白質的N端PEG化的那些 方法。
[0080] 示例性條件描述于實施例章節中。
[0081] 乙烯亞胺寡聚物可以以游離堿形式或以鹽的形式加至本發明的水溶液或組合物。 水溶液或組合物的pH優選足夠低，使得乙烯亞胺寡聚物的至少部分堿性基團在溶液中質 子化。通常，本發明的水溶液或組合物的pH在4至8,例如5. 0至7. 5或5. 5至7. 0的范圍 內。優選地，本發明的水溶液或組合物的pH可以在5. 5至6. 0、6. 0至6. 5或6. 5至7. 0的 范圍內。
[0082] 乙烯亞胺寡聚物還可以作為適宜的酸（如可藥用酸）的鹽加至水溶液或組合物。 適宜的酸包括鹽酸、氫溴酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、馬來酸、延胡 索酸、蘋果酸、琥珀酸、丙二酸、硫酸、L-谷氨酸、酒石酸、L-天冬氨酸、丙酮酸、粘酸、苯甲 酸、葡糖醛酸、草酸和抗壞血酸。在一個實施方案中，該酸是包含兩個或多個酸性基團的多 酸。應注意，雖然式Ι、Π 、ΙΙΙ和IV的衍生化聚乙二醇寡聚物以未質子化的氮中心顯示，但 這些化學式的部分或實際上全部堿性氮中心質子化的寡聚物也旨在認為包含在本發明的 范圍之內。考慮其中部分或全部堿性氮中心質子化的未衍生化的乙烯亞胺寡聚物的所有實 施方案也認為包含在本發明的范圍之內。
[0083] 在一個實施方案中，乙烯亞胺寡聚物的50-100%的堿性氮中心質子化。在另一實 施方案中，乙烯亞胺寡聚物的80-100%的堿性氮中心質子化。優選地，乙烯亞胺寡聚物的至 少95%的堿性氮中心質子化。不希望受限于理論，考慮在乙烯亞胺寡聚物的至少95%的堿 性氮中心質子化時，掩蓋了抗體蛋白質表面的高電荷密度，從而抑制抗體蛋白質的聚集。具 體而言，不希望受限于理論，考慮乙烯亞胺寡聚物掩蓋了抗體蛋白質表面帶負電荷的區塊， 從而抑制抗體蛋白質的電荷驅動的聚集。
[0084] 在一個實施方案中，包含抗體蛋白質的水溶液的pH低于蛋白質的等電點（pi)。在 一個實施方案中，抗體蛋白質的pi高于溶液的pH,適宜地，高至少0. 5個單位，更適宜地， 高0. 5至5個單位之間，甚至更適宜地，高1至3個單位之間。在一個實施方案中，抗體蛋 白質的pi為至少7,例如，在7-10或7. 5-9的范圍內。
[0085] 在一個實施方案中，包含抗體蛋白質的水溶液是等滲的。在一個實施方案中，包含 抗體蛋白質的水溶液是高滲的。在一個實施方案中，包含抗體蛋白質的水溶液是低滲的。 [0086] 乙烯亞胺寡聚物以足以提供希望的穩定性的濃度存在于組合物中。在一個實施 方案中，乙烯亞胺寡聚物的濃度從約0. 01至約10mg/mL，例如從約0. 01至約0. lmg/mL、約 0. 1至約0. 25mg/mL、約0. 25至約lmg/mL、約1至約2mg/mL、約2至約5mg/mL或約5至約 10mg/mL。在一個實施方案中，乙烯亞胺寡聚物的濃度為約0. 2mg/mL至約2mg/mL。如本文 中所使用，本發明的組合物中乙烯亞胺寡聚物的質量指游離堿當量，即它不包括任何抗衡 陰離子（如果存在）。
[0087] 在某些實施方案中，抗體蛋白質與乙烯亞胺寡聚物的比（wt/wt)為至少10,例如， 至少20。在某些實施方案中，蛋白質與乙烯亞胺寡聚物的重量比從約20至約300,優選從 約50至約200。在某些實施方案中，蛋白質與乙烯亞胺寡聚物的重量比為約100。在某些 實施方案中，蛋白質與乙烯亞胺寡聚物的重量比可以高于300,例如，高達500、800或1000。 這些重量比指排除任意衍生化基團（例如PEG基團）的乙烯亞胺寡聚物含量本身的重量。 在一個實施方案中，抗體蛋白質與寡聚物的比（wt/wt)從約100至約200。
[0088] 本發明的溶液優選包含緩沖劑。通常，選擇緩沖劑來提供允許蛋白質溶解至希望 的濃度的pH。優選地，pH足夠低，使得乙烯亞胺寡聚物中的至少部分堿性基團質子化。還 可以選擇緩沖劑來增強蛋白質穩定性。
[0089] 本發明人已研究了乙烯亞胺寡聚物和聚合物的大小對細胞毒性的影響，如實施例 7和8中所述。結果顯示在圖2、3和4中，并清楚地證明，隨著聚乙烯亞胺的大小的減小，其 細胞毒性作用也減小。證明了重量從約50, OOODa減小至約800Da的聚乙烯亞胺的逐漸減小 的細胞毒性（見實施例7)。此細胞毒性逐漸減小的趨勢可以合理地外推，暗示寡聚物中乙 烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內（即重量<800Da)的乙烯亞胺寡聚物將具有甚至 更低的細胞毒性。實際上，進一步證明了向下至約l〇〇Da的逐漸降低的細胞毒性（見實施 例8)。不希望受限于理論，本發明人認為，寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12 范圍內的乙烯亞胺寡聚物具有足夠的大小來掩蓋抗體蛋白質表面具有高電荷密度的區域， 從而解決濃縮溶液中抗體蛋白質聚集的問題。具體而言，不希望受限于理論，考慮η = 2-12 的乙烯亞胺寡聚物具有足夠的大小來掩蓋抗體蛋白質的具有高負電荷密度的區塊，從而解 決濃縮溶液中電荷驅動的抗體蛋白質聚集的問題。此外，作為本發明人的研究的結果（見 圖2、3和4)，且同樣不希望受限于理論，本發明人認為，寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目 (η)在2-12范圍內的乙烯亞胺寡聚物還具有足夠小的大小，以避免施加與細胞膜的破壞相 關的任意毒性作用。因此，這類寡聚物可以減少濃縮抗體蛋白質溶液中的聚集，同時顯示有 利的毒性譜。因此，這類寡聚物在治療性應用中尤其有用。
[0090] 如實施例1-6中所述，已發現，在相同條件下保存相同時長后，與缺乏該乙烯亞胺 寡聚物但其他方面相似或相同的組合物相比，本文定義的乙烯亞胺寡聚物可以顯著降低組 合物（如水性抗體蛋白質溶液）中抗體蛋白質的聚集率。
[0091] 在一個實施方案中，寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯 亞胺寡聚物在抗體蛋白質的濃縮水溶液中的存在將高分子量蛋白質種類的增加限制于在 40°C保存一個月后不超過5% (按總蛋白質重量計），適宜地，不超過3%，更適宜地，不超 過2%。在一個實施方案中，寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯 亞胺寡聚物在抗體蛋白質的濃縮水溶液中的存在將高分子量蛋白質種類的增加限制于在 2-8°C保存多達兩年后不超過5% (按總蛋白質重量計），適宜地，不超過3%，更適宜地，不 超過2%。高分子量種類的定量按組合物中總蛋白質的重量的百分比計。
[0092] 在一個實施方案中，在相同條件下保存相同時長后，與缺乏乙烯亞胺寡聚物但其 他方面相同的組合物相比，寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯亞 胺寡聚物在抗體蛋白質的濃縮水溶液中的存在將高分子量蛋白質種類的增加限制了至少 10 %，優選至少25 %，更優選至少50 %。
[0093] 在一個實施方案中，在相同條件下保存相同時長后，寡聚物中乙烯亞胺重復單位 的數目（η)在2-12范圍內的乙烯亞胺寡聚物在抗體蛋白質的濃縮水溶液中的存在保持蛋 白質的水性組合物不含可見聚集體，而在缺乏乙烯亞胺寡聚物但其他方面相同的組合物中 觀察到了可見聚集體的形成。可見聚集體的定量可以通過濁度或其他類型的光散射測量來 進行。
[0094] 在某些實施方案中，將抗體融合或綴合至活性分子，如毒素或能夠結合諸如"Tc、 mIr、131I或9°Y的放射性金屬離子的螯合劑。在這類實施方案中，抗體通常作為靶向劑發揮 作用，例如將活性分子定向至展示某種細胞表面蛋白質的細胞。
[0095] 可以按本文所述配制的具體抗體包括但不限于：英夫利昔單抗（infliximab) (嵌合抗體，抗 -TNF α )、阿達木單抗（adal imumab)(人抗體，抗-TNF α )、巴利昔單抗 (basiliximab)(嵌合抗體，抗-IL-2)、阿昔單抗（abciximab)(嵌合抗體，抗-GpIIb/ 111&)、達利珠單抗（(^]^111]^13)(人源化抗體，抗-11^-2)、吉妥珠單抗&61111：112111]^13) (人源化抗體，抗-⑶33)、阿倫單抗（alemtuzumab)(人源化抗體，抗-⑶52)、依決洛單 抗（edrecolomab)(鼠 Ig2a，抗-EpCAM)、利妥昔單抗（嵌合抗體，抗-⑶20)、帕利珠單抗 (palivizumab)(人源化抗體，抗-呼吸道合胞病毒）、曲妥珠單抗（trastuzumab)(人源 化抗體，抗-HER2/neu(erbB2)受體）、貝伐單抗（bevacizumab)(人源化抗體，抗-VEGF)、 西妥昔單抗（cetuximab)(嵌合抗體，抗-EGFR)、艾庫組單抗（eculizumab)(人源化抗 體，抗 -補體系統蛋白質C5)、依法利珠單抗（efalizumab)(人源化抗體，抗-CD 11a)、替 伊莫單抗（ibritumomab)(鼠抗體，抗-⑶20)、莫洛單抗-⑶3(muromonab_⑶3)(鼠抗體， 抗-T細胞CD3受體）、那他珠單抗（natalizumab)(人源化抗體，抗-α 4整聯蛋白）、尼 妥珠單抗（nimotuzumab)(人源化IgG，抗-EGF受體）、奧馬珠單抗（omalizumab)(人源 化抗體，抗-IgE)、帕尼單抗（panitumumab)(人抗體，抗-EGFR)、蘭尼單抗（ranibizumab) (人源化抗體，抗-VEGF)、1-131托西莫單抗（tositumomab)(人源化抗體，抗-⑶20)、奧 法木單抗（ofatumumab)(人抗體，抗-⑶-20)、賽妥珠單抗（certolizumab)(人源化抗體， 抗-TNF-α )、戈利木單抗（golimumab)(人抗體，抗-TNFa )和地諾單抗（denosumab)(人抗 體，抗-RANK配體）。優選的抗體包括曲妥珠單抗和利妥昔單抗。另一種目的抗體是英夫利 昔單抗。
[0096] 可以按本文所述配制的其他嵌合抗體包括巴維昔單抗（bavituximab)(抗-磷酯 酰絲氨酸）、brentuximab (抗-0)30)、司妥昔單抗（siltuximab)(抗-IL-6)、克立昔單抗 (clenoliximab)(抗-0)4)、加利昔單抗（galiximab)(抗-0)80)、魯昔單抗（gomiliximab) (抗-⑶23)、凱利昔單抗（keliximab)(抗-0)4)、魯西單抗（lumiliximab)(抗-0)23)、 普立昔單抗（priliximab)(抗-0)4)、替奈昔單抗（teneliximab)(抗-0)40)、伐利昔 單抗（vapaliximab)(抗-VAP1)、依美昔單抗（ecromeximab)(抗-GD3)和帕基昔單抗 (pagibaximab)(抗-葡萄球菌脂磷壁質）。
[0097] 可以按本文所述配制的其他人源化抗體包括依帕珠單抗（epratuzumab) (抗-CD 22)、阿夫土株單抗（afutuzumab)(抗_CD2〇)、比伐單抗（bivatuzumab mertansine) (抗-⑶44)、坎圖珠單抗（cantuzumab mertansine)(抗-黏蛋白）、泊西他珠單 抗（citatuzumab bogatox)(抗-TACSTD1)、達塞珠單抗（dacetuzumab)(抗-CD40)、 elotuzumab (抗-0)319)、伊瑞珠單抗（etaracizumab)(抗-ανβ3-整聯蛋白）、 farletuzumab (抗-FR α)、沃伊圖珠單抗（inotuzumab ozogamicin)(抗-CD22)、拉貝珠 單抗（labetuzumab)(抗-癌胚抗原）、林妥珠單抗（lintuzumab)(抗-⑶33)、米拉圖單抗 (milatuzumab)(抗-CD74)、尼妥珠單抗（抗-EGFR)、oportuzumab monatox (抗-EpCAM)、 帕妥珠單抗（pertuzumab)(抗-HER2)、西羅珠單抗（sibrotuzumab)(抗-FAP)、他珠單抗 (tacatuzumab tetraxetan)(抗-甲胎蛋白）、替加珠單抗（tigatuzumab)(抗-TRAIL-2)、 圖考珠單抗（tucotuzumab celmoleukin)(抗-EpCAM)、維妥珠單抗（veltuzumab) (抗-⑶20)、阿塞珠單抗（aselizumab)(抗-⑶62L)、阿泊珠單抗（apolizumab) (抗-HLA-DRB)、benralizumab (抗-CD125)、西利珠單抗（cedelizumab)(抗-CD4)、依帕 珠單抗（抗-⑶22)、厄利珠單抗（erlizumab)(抗-⑶18)、芳妥珠單抗（fontolizumab) (抗 -干擾素1)、美泊利單抗（mepolizumab)(抗-IL5)、奧瑞珠單抗（ocrelizumab) (抗-⑶20)、帕考珠單抗（pascolizumab)(抗-IL4)、培克珠單抗（pexelizumab)(抗-補 體組分5)、PR0-140 (抗-CCR5)、瑞利珠單抗（reslizumab)(抗-IL5)、隆塔珠單抗 (rontalizumab)(抗-干擾素 -α )、羅維珠單抗（rovelizumab)(抗-⑶11XD18)、西利珠單 抗（siplizumab)(抗-⑶2)、他利珠單抗（talizumab)(抗-IgE)、替麗珠單抗（teplizumab) (抗-⑶3)、托珠單抗（tocilizumab)(抗-IL6R)、維多珠單抗（vedolizumab)(抗-α 4β 7-整 聯蛋白）、維西珠單抗（visilizumab)(抗-CD3)、伊利珠單抗（ibalizumab)(抗-CD4)、替 巴珠單抗（tefibazumab)(抗-聚集因子A)、他西珠單抗（tadocizumab)(抗-a llb β 3-整聯 蛋白）、內珠單抗（bapineuzumab)(抗-淀粉狀-β )、solanezumab(抗-淀粉狀-β )、他 尼珠單抗（tanezumab)(抗-NGF)、烏珠單抗（urtoxazumab)(抗-大腸桿菌志賀樣毒素 II B亞基）、非維珠單抗（felvizumab)(抗-呼吸道合胞病毒）、莫維珠單抗（motavizumab) (抗 -呼吸道合胞病毒糖蛋白F)和lebrikizumab (抗-IL13)。
[0098] 可以按本文所述配制的其他人抗體包括阿托木單抗（atorolimumab)(抗-Rh因 子）、夫蘇木單抗（fresolimumab)(抗-TGF0-1、_2 和-3)、樂德木單抗（lerdelimumab) (抗-TGF0-2)、美替木單抗（metelimumab)(抗-TGF0_1)、莫羅木單抗（morolimumab) (抗-Rh 因子）、伊匹單抗（ipilimumab)(抗-CTLA-4)、曲利木單抗（tremelimumab) (抗-CTLA-4)、桕替木單抗（bertilimumab)(抗-CCL11)、扎木單抗（zanolimumab) (抗-Q)4)、巴列津單抗（briakinumab)(抗-IL12、-23)、康納單抗（canakinumab) (抗-IL1 β )、優特克單抗（ustekinumab)(抗-IL12、-23)、阿德姆單抗（adecatumumab) (抗-EpCAM)、貝利單抗（belimumab)(抗-B細胞激活因子）、西妥木單抗（cixutumumab) (抗-IGF-1 受體）、可那木單抗（conatumumab)(抗-TRAIL-R2)、figitumumab (抗-IGF-1 受 體）、伊妥木單抗（iratumumab)(抗-⑶30)、來沙莫單抗（lexatumumab)(抗-TRAIL-R2)、 魯圖莫單抗（lucatumumab)(抗-⑶40)、馬帕木單抗（mapatumumab)(抗-TRAIL-R4)、 necitumumab (抗-EGFR)、olaratumab (抗-PDGF-R α )、普林木單抗（pritumumab)(抗-波 形蛋白）、羅妥木單抗（robatumumab)(抗-IGF-1受體）、伏妥莫單抗（votumumab)(抗-腫 瘤抗原 CTAA16. 88)、雜魯木單抗（zalutumumab)(抗-EGFR)、斯達盧單抗（stamulumab) (抗肌生成抑制素）、依芬古單抗（efungumab)(抗真菌HSP90)、艾韋單抗（exbivirumab) (抗 -乙型肝炎表面抗原）、foravirumab (抗-狂犬病糖蛋白）、利韋單抗（libivirumab) (抗-乙型肝炎表面抗原）、瑞非韋魯單抗（rafivirumab)(抗-狂犬病糖蛋白）、瑞加韋單抗 (regavirumab)(抗-巨細胞病毒糖蛋白B)、司韋單抗（sevirumab)(抗-巨細胞病毒）、妥 韋單抗（tuvirumab)(抗-乙型肝炎病毒）、panobacumab (抗-銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS011)、雷西巴單抗（raxibacumab)(抗-炭疽毒素）、雷莫蘆單抗 (ramucirumab)(抗-VEGF-R2)和剛奈魯單抗（gantenerumab)(抗-淀粉狀-β )。
[0099] 包含免疫球蛋白分子的片段的融合蛋白質也可以按照本發明配制。適宜的融合蛋 白質包括含有與一個或多個免疫球蛋白片段（如Fc結構域）融合的活性蛋白質結構域的 蛋白質。這類融合蛋白質包括具有單體單位的二聚體蛋白質，該單體單位包含諸如可溶性 受體或受體胞外配體結合結構域的活性蛋白質結構域，該活性蛋白質結構域與免疫球蛋白 Fc結構域融合。兩個Fc結構域可以通過二硫鍵結合形成二聚體蛋白質。這類融合蛋白質 包括依那西普（etanercept)、阿巴西普（abatacept)和貝拉西普（belatacept)。
[0100] 包含抗體（或一個或多個抗體片段）和諸如PEG的化學惰性聚合物的綴合衍生物 也可以按照本發明配制。這類衍生物包括賽妥珠單抗（certolizumab pegol)。
[0101] 抗體蛋白質可以分離自天然來源或可以是重組蛋白質。
[0102] 在某些實施方案中，抗體蛋白質基本上純，也就是說，組合物包含單種蛋白質，且 無實質性量的任意額外蛋白質。在優選實施方案中，蛋白質包含組合物的總蛋白質含量的 至少99%、優選至少99. 5%和更優選至少約99. 9%。在優選實施方案中，蛋白質對在藥物 組合物中的用途而言足夠純。
[0103] 水溶液中抗體蛋白質的濃度為至少約10mg/mL，且優選在約25mg/mL至約400mg/ mL的范圍內。在某些實施方案中，濃度為至少約25mg/mL。在某些實施方案中，蛋白質濃度 為至少約3〇11^/1]1]^、4〇11^/1]1]^、5〇11^/1]1]^、6〇11^/1]1]^、7〇11^/1]1]^、8〇11^/1]1]^、9〇11^/1]11^或10〇11^/1]1]^。更 優選地，蛋白質濃度高于50mg/mL，例如至少約80mg/mL。濃度可以是多達約400mg/mL，例如 多達約350mg/mL、300mg/mL、250mg/mL、200mg/mL或175mg/mL。本文考慮通過前述下限之一 和前述上限之一限定的每個濃度范圍。
[0104] 本文所用的術語"可藥用"指藥物組合物的成分，其適合用于預期的用途及對人或 動物（如哺乳動物）身體施用的方式而無過度的不良結果，如毒性、刺激和變態反應，且具 有合理的風險/收益比。
[0105] 適宜地，本發明的組合物包含緩沖劑來穩定組合物的pH，還可以選擇緩沖劑來增 強蛋白質穩定性。在一個實施方案中，選擇具有接近組合物pH的pKa的緩沖劑；例如，在組 合物的pH在4. 5-5. 5范圍內時，適宜地利用乙酸作為緩沖劑，在組合物的pH在5. 6-6. 5范 圍內時，適宜地利用組氨酸作為緩沖劑。備選地，在另一實施方案中，按W02008/084237中 所公開進一步穩定本發明的組合物，W02008/084237描述了包含蛋白質和一種或多種添加 劑的組合物，其特征在于該系統基本上不含常規緩沖劑，即在保存組合物的預期溫度范圍 內具有組合物的pH的1個單位之內的pKa的化合物。在此實施方案中，將組合物的pH設在 這樣的值，組合物在該pH值下具有就pH而言的最大可測量穩定性；一種或多種添加劑（替 換緩沖液）能夠與蛋白質交換質子，且在保存組合物的預期溫度范圍內具有比組合物的pH 高或低至少1個單位的pKa值。通過保持蛋白質處于適宜的pH，處于或接近可測量穩定性 最大的值，在缺乏常規緩沖劑的情況下，可以實質性提高蛋白質的保存穩定性。在某些實施 方案中，通過使用在組合物的預期保存溫度范圍內具有水性組合物pH的1至5個pH單位 之間、優選1至3個pH單位之間、最優選1. 5至2. 5個pH單位之間的pKa的添加劑，通常 可以可能實質性地進一步增強保存穩定性。
[0106] 本發明的溶液可以進一步包括一種或多種常規賦形劑，如無機鹽，優選鈉、鉀、鈣 或銨與氯、硫酸、碳酸、亞硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、馬來酸或乳酸組合的鹽；氨基酸， 優選組氨酸、甘氨酸、精氨酸或甲硫氨酸（例如作為抗氧化劑）；糖或糖醇，優選海藻糖、蔗 糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、乳糖醇、甘油或1，2-丙二醇；表面活性劑，優選聚山梨酸酯20、 聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯80、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407 ;痕量金屬螯合劑，優選ETDA ; 防腐劑，優選苯酚、間甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸丙酯、苯扎氯銨或苯索氯銨。鎂與氯、硫 酸、碳酸、亞硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、馬來酸或乳酸組合的無機鹽也是適宜的賦形 劑。
[0107] 本發明的溶液可選地包含滲漲度調節劑。適宜的滲漲度調節劑在上文【背景技術】中 列出，且可以是帶電荷或不帶電荷的化學種類。典型的不帶電荷的滲漲度調節劑包括糖類， 如蔗糖、海藻糖、甘油和甘露醇。典型的帶電荷的滲漲度調節劑包括帶電荷的化學種類，如 精氨酸或氯化鈉。
[0108] 在一個實施方案中，用諸如無機鹽或有機鹽的帶電荷種類調節抗體蛋白質的水溶 液的滲漲度。在一個實施方案中，用諸如糖類或糖醇的不帶電荷種類調節抗體蛋白質的水 溶液的滲漲度。
[0109] 本發明的水性組合物涵蓋廣范圍的摩爾滲透壓濃度，包括低滲、等滲和高滲的組 合物。優選地，本發明的溶液基本上等滲。優選的溶液具有約200至約500m0sm/L范圍內 的摩爾滲透壓濃度。優選地，摩爾滲透壓濃度在約250至約350m0sm/L的范圍內。更優選 地，摩爾滲透壓濃度為約300m0sm/L。在一個實施方案中，溶液預期用于通過肌內或皮下注 射來對受試者施用，且選擇溶液的摩爾滲透壓濃度來最小化注射時的疼痛。
[0110] 本文所用的術語"高分子量種類"指蛋白質含量的任意成分，其具有至少兩倍于親 本活性蛋白質的分子量的表觀分子量。也就是說，高分子量種類是親本蛋白質的多聚聚集 體。多聚聚集體可以包含具有顯著改變的構象的親本蛋白質分子，或者它們可以是處于天 然構象或近天然構象的親本蛋白質單位的組裝。高分子量種類的測定可以用本領域已知的 方法進行，包括大小排阻層析、電泳、分析型超速離心/沉降速度、光散射、動態光散射、靜 態光散射和場流分級分離。
[0111] 優選地，在40°c保存至少一個月、兩個月或三個月后，本發明的組合物包含不超過 5% (按總蛋白質重量計）高分子量種類。在一個實施方案中，在40°C保存至少一個月、兩個 月或三個月后，高分子量種類的量增加不超過5% (按總蛋白質重量計），優選不超過3%。 高分子量種類的定量按組合物中總蛋白質的重量的百分比計。
[0112] 在優選實施方案中，在相同條件下保存相同時長后，本發明的組合物應顯示保存 期間高分子量種類的增加比缺乏乙烯亞胺寡聚物但其他方面相同的組合物低至少10%，優 選低至少25 %，更優選低至少50 %。
[0113] 在一個實施方案中，本發明的組合物是適合用于對有需要的受試者施用治療性抗 體蛋白質的藥物組合物。這類組合物可以在用于對受試者施用治療性蛋白質的方法中使 用。
[0114] 在另一實施方案中，本發明提供用于對有需要的受試者施用治療性抗體蛋白質的 方法。該方法包括施用水溶液的步驟，該水溶液包含濃度為至少約10mg/mL的抗體蛋白質 及寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯亞胺寡聚物。優選地，通過 靜脈內、皮下或肌內注射施用該組合物。更優選地，通過皮下注射施用該組合物。
[0115] 在優選實施方案中，蛋白質濃度足夠高，使得每次施用的總體積不超過約2mL。優 選地，每次施用的總體積不超過約1. 5mL或約1. OmL。在一個實施方案中，每次施用的溶液 體積從約〇. 5至約2mL，優選從約0. 5至約1. 5mL。
[0116] 在另一實施方案中，本發明提供適合用于對有需要的受試者施用的包裝的藥物組 合物。該藥物組合物包含水溶液，該水溶液包含濃度為至少約lOmg/mL的治療性抗體蛋白 質及寡聚物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內的乙烯亞胺寡聚物。
[0117] 優選地，溶液的體積為約2mL或更少。在一個實施方案中，溶液的體積提供約0. 5 至約2mL的施用體積，具有足夠的過剩來適應經注射器攝取溶液的限制。在一個實施方案 中，該過剩為施用體積的約10%至約20%。藥物組合物優選包裝在適于插入針頭來吸出溶 液的小瓶中。在一個實施方案中，該藥物組合物包裝在具有膠塞的玻璃瓶中。包裝的藥物 組合物可以作為試劑盒提供，該試劑盒進一步包含使用說明和可選的適合用于肌內或皮下 施用的注射器。備選地，包裝的藥物組合物可以以適合用于肌內或皮下施用的預裝一次性 注射器的形式提供。預裝自動注射裝置也將適合用于肌內或皮下施用。
[0118] 本文所用的乙烯亞胺寡聚物的百分比指基于乙烯亞胺寡聚物的游離堿的重量 (即排除任意抗衡離子的重量）。
[0119] 在另一方面，本發明提供式V的化合物：
[0120] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0121] 式 V
[0122] 其中，η = 2-6 ;X選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙二醇（PPG-0-)和 聚氨基酸A選自- (C2-C6)烷基-C(0)-NH-和（CH2)mK，其中m= 3-10，K代表NH;R是Η或 選自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C 2-C6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基團。
[0123] 在式（V)的一個實施方案中，η為3-5。
[0124] 在式（V)的一個實施方案中，X具有500Da至5000Da的麗，且是聚乙二醇（例如 PEG-0-和mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-)，適宜地，X具有約2000Da或約5000Da的MW，且 是 mPEG-0-。
[0125] 在式（V)的一個實施方案中，Yi是-((：2_(：6)烷基-C(0)-NH-，適宜地，是（C 2_C4)烷 基 _C (0)_NH_。
[0126] 在式（V)的一個實施方案中，￥1是（CH2)mK，其中m = 3-10,例如m = 3或4,且K 代表NH。
[0127] 在式（V)的一個實施方案中，R是H。在式（V)的一個實施方案中，R是_((：2-(；烷 基） _0H。
[0128] 在式（V)的一個實施方案中，η = 2_6，X具有500Da至5000Da的MW，且是聚乙二 醇（例如 PEG-0-和 mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-) A 選自- (C2-C6)烷基-C(0)-NH-和 (CH2) mK，其中 m = 3-10, K 代表 NH ;R 是 Η 或選自-C「C6 烷基、-(C2-C6 烷基）-0H 和-(C2-C6 烷基）-0- (Q-Q烷基）的惰性封端基團。
[0129] 在式（V)的一個實施方案中，η = 2-6, X是聚乙二醇（例如PEG-0-和/或 mPEG-0-) Α 選自 _(C2_C6)烷基-C(0)-NH-和（CHiK，其中 m = 3-4, Κ 代表 NH ;R 是 Η 或 選自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C2-C 6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基團。
[0130] 在式（V)的一個實施方案中，η = 2-6, X是mPEG-0- A選自_(C2_C6)烷 基-C (0) -NH-和（CH丄K，其中 m = 3-4, K 代表 NH ;R 是 Η 或-(c2-c6 烷基）-0H。
[0131] 在式（V)的一個實施方案中，η = 2-6, X是聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-); Yi 選自-(c2-c6)烷基-c (0) -NH-和（CH2) mK，其中 m = 3-4, K 代表 NH ;R 是 Η 或-(c2-c6 烷 基）-0H ;其中在 Yi 是（CH2)mK 時，R 是-(C2-C6 烷基）-0H。
[0132] 式（V)的示例性化合物包括mPEG戊酸酰氨基五亞乙基六胺（例如，其中mPEG是 2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基四亞乙基五胺（例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基三 亞乙基四胺（例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG丙基三亞乙基四胺乙醇（例如，其中mPEG 是2K或5KmPEG)和mPEG丙基五亞乙基六胺乙醇（例如，其中mPEG是2K或5KmPEG)。
[0133] 可以用實施例中所述的方法和與之類似的方法連同技術人員已知的方法來制備 式（V)的化合物。
[0134] 例如，其中Yi是-(C2_C6)燒基-C(0)-NH-的式（V)的化合物可以如下制備，其中 LG代表離去基團，如0-琥珀酰亞胺（見例如化合物（I)的合成）：
[0135]

【權利要求】
1. 水溶液，其包含濃度為至少約lOmg/mL的抗體蛋白質和乙烯亞胺寡聚物，其中寡聚 物中乙烯亞胺重復單位的數目（η)在2-12范圍內。
2. 降低水溶液中的抗體蛋白質的聚集率的方法，其中抗體蛋白質濃度為至少約10mg/ mL，其包括向所述溶液中加入乙烯亞胺寡聚物的步驟，其中寡聚物中乙烯亞胺重復單位的 數目（η)在η = 2-12的范圍內。
3. 權利要求1的水溶液或權利要求2的方法，其中η = 3-11。
4. 權利要求3的水溶液或方法，其中η = 6-8。
5. 權利要求4的水溶液或方法，其中η = 2-6,例如3-5。
6. 權利要求1至5中任一項的水溶液或方法，其中用選自聚乙二醇（例如PEG和 mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的一種或多種聚合物衍生化所述乙烯亞胺寡聚物。
7. 權利要求1至6中任一項的水溶液或方法，其中用一種或多種共聚物衍生化所述乙 烯亞胺寡聚物，其中所述共聚物由選自聚乙二醇（例如PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚 氨基酸的聚合物（及其相關單體）組成。
8. 權利要求1至5中任一項的水溶液或方法，其中用一種或多種PEG或mPEG衍生化所 述乙烯亞胺寡聚物。
9. 權利要求6至8中任一項的水溶液或方法，其中經可選的橋連基衍生化所述乙烯亞 胺寡聚物，其中橋連基選自羰基、酰胺、氨基甲酸酯、脲和亞烷基。
10. 權利要求1的水溶液或權利要求2的方法，其中乙烯亞胺寡聚物選自二亞乙基三 胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺和五亞乙基六胺。
11. 權利要求1至10中任一項的水溶液或方法，其中用選自-CfQ烷基、-((：2-(：6烷 基）-0H和-(Q-C；烷基）-0- (C2-C6烷基）的惰性封端基團封端乙烯亞胺寡聚物。
12. 權利要求1或權利要求2的水溶液或方法，其中乙烯亞胺寡聚物為式III : X-Y「[CH2CH2NH]n-R 式III 其中，η = 2-12 ;X選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-Ο-)、聚丙二醇（PPG-0-)和聚 氨基酸；￥1是可選的，且選自_(〇|^6)燒基-(](0)-順-、-((] 2-(]6)燒基-0(](0)-順-、-((]2-〇6) 烷基-NHC(0)NH-和（CH丄K，其中m = 3-10,且K代表0或NH;且R是Η或選自-C「C6烷 基、-(C2-C 6烷基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基團。
13. 權利要求1至7或9至12中任一項的水溶液或方法，其中聚氨基酸選自聚甘氨酸、 聚丙氨酸、聚纈氨酸、聚亮氨酸、聚異亮氨酸和聚苯丙氨酸。
14. 權利要求12的水溶液或方法，其中η = 2-12, X是PEG-0-或mPEG-Ο- A缺乏，且 R 是-H 或-CH2CH20H。
15. 權利要求12的水溶液或方法，其中η = 2-12 ;X是mPEG-Ο- ;Y存在，且選 J，其中m = 3-10,且Κ代表0或NH ;R是Η。
16. 權利要求15的水溶液或方法，其中η = 4-8 ;X是mPEG-Ο- ;Y是-(CQ-C6)烷 基-C (0) -NH-，且 R 是 _H。
17. 權利要求12至16中任一項的水溶液或方法，其中K是NH。
18. 權利要求1至17中任一項的水溶液或方法，其中乙烯亞胺寡聚物的堿性氮中心的 至少95%質子化。
19. 權利要求1至18中任一項的水溶液或方法，其中乙烯亞胺寡聚物以約0. 2mg/mL至 約5mg/mL的濃度存在。
20. 權利要求1至19中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質是治療劑。
21. 權利要求1至20中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質是抗體、抗體片段、與 活性部分綴合的抗體、包含一個或多個抗體片段的融合蛋白質、或前述任一種的衍生物。
22. 權利要求21的水溶液或方法，其中抗體蛋白質是單克隆抗體。
23. 權利要求22的水溶液或方法，其中單克隆抗體是鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或 人抗體。
24. 權利要求22的水溶液或方法，其中單克隆抗體是曲妥珠單抗或利妥昔單抗。
25. 權利要求22的水溶液或方法，其中單克隆抗體是英夫利昔單抗。
26. 權利要求21的水溶液或方法，其中抗體蛋白質是包含與一個或多個免疫球蛋白Fc 片段融合的活性蛋白質結構域的融合蛋白質。
27. 權利要求26的水溶液或方法，其中抗體蛋白質是依那西普、阿巴西普或貝拉西普。
28. 權利要求21的水溶液或方法，其中衍生物是包含一種或多種抗體或抗體片段和化 學惰性聚合物的綴合衍生物。
29. 權利要求28的水溶液或方法，其中綴合衍生物是賽妥珠單抗。
30. 權利要求1至29中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質濃度在約25mg/mL和 約300mg/mL之間。
31. 權利要求1至30中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質濃度高于50mg/mL。
32. 權利要求1至31中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質與所述乙烯亞胺寡聚 物的重量比（wt/wt)為約50至約100。
33. 權利要求32的水溶液或方法，其中抗體蛋白質與所述乙烯亞胺寡聚物的重量比 (wt/wt)為約 100 至約 200。
34. 用于對有需要的受試者施用抗體蛋白質的方法，其包括對所述受試者施用權利要 求1至33中任一項的水溶液的步驟。
35. 權利要求34的方法，其中通過皮下或肌內注射或通過靜脈內注射或輸注施用所述 溶液。
36. 權利要求34或權利要求35的方法，其中所施用的溶液的總體積為約2mL或更少。
37. 權利要求1至36中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質的pi高于溶液的pH。
38. 權利要求37的水溶液或方法，其中抗體蛋白質的pi比溶液的pH高至少0. 5個單 位。
39. 權利要求1至38中任一項的水溶液或方法，其中抗體蛋白質的pi為至少7。
40. 權利要求39的水溶液或方法，其中抗體蛋白質的pi在7-10的范圍內。
41. 權利要求1至40中任一項的水溶液或方法，其中水溶液是等滲的。
42. 權利要求1至41中任一項的水溶液或方法，其中水溶液包含不帶電荷的滲漲度調 節劑。
43. 權利要求1至41中任一項的水溶液或方法，其中水溶液包含帶電荷的滲漲度調節 劑。
44. 式V的化合物： X-Y「[CH2CH2NH]n-R 式V 其中，η = 2-6 ;X選自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-O-)、聚丙二醇（PPG-0-)和聚 氨基酸A選自_(C2_C6)烷基-C(0)-NH-和（CH2) mK，其中m= 3-10,且K代表NH;且R是Η 或選自烷基、-(C2-C6烷基）-OH和-(C 2-C6烷基）-0- (Q-C；烷基）的惰性封端基團。
45. 權利要求44的化合物，其中η為3-5。
46. 權利要求44或45的化合物，其中X具有500Da至5000Da的麗，且是聚乙二醇（例 如 PEG-0-和 mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-)。
47. 權利要求44至46中任一項的化合物，其中Yi是-(C2-C6)烷基-C(0) -NH-。
48. 權利要求44至46中任一項的化合物，其中Yi是（CH2)mK ;m = 3或4,且K代表NH。
49. 權利要求44至48中任一項的化合物，其中R是H。
50. 權利要求44至48中任一項的化合物，其中R是- (C2-C4烷基）-0H。
51. 權利要求44的化合物，其選自mPEG戊酸酰氨基五亞乙基六胺、mPEG戊酸酰氨基四 亞乙基五胺、mPEG戊酸酰氨基三亞乙基四胺、mPEG丙基三亞乙基四胺乙醇和mPEG丙基五亞 乙基六胺乙醇。
52. 權利要求1的水溶液，其中乙烯亞胺寡聚物是權利要求44至51中任一項的化合 物。
53. 適用于對有需要的受試者施用的包裝的藥物組合物，其包含權利要求1至33、權利 要求37至43或52中任一項的水溶液。
【文檔編號】A61K39/395GK104203282SQ201380017932
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年1月30日 優先權日:2012年1月30日
【發明者】G·卡西, B·K·德勒姆, J·耶熱克, N·羅伊勒 申請人:艾瑞克有限公司