基于半氟化烷烴的穩定蛋白質組合物的制作方法

基于半氟化烷烴的穩定蛋白質組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了具有改善的穩定性和保質期的生物活性多肽和蛋白質的新的組合物。該組合物是基于選自半氟化烷烴的液體賦形劑。這些賦形劑對保護多肽和蛋白質免受降解和/或聚合的影響顯著有效。該組合物對例如給藥到眼睛中、或通過例如經由皮下或肌內途徑等腸外注射的局部給藥是有用的。
【專利說明】基于半氟化烷烴的穩定蛋白質組合物

【技術領域】
[0001] 本發明屬于肽和蛋白質組合物的領域，特別是對治療或診斷用途有用的作為多肽 或蛋白質的藥物制劑的組合物。

【背景技術】
[0002] 由于生物【技術領域】中已經出現的許多新進步和新進展的緣故，最近幾年已經出現 了將不可治療的疾病或疑難雜癥作為目標的基于肽和蛋白質的新類型的治療性的生物藥 劑學。
[0003] 然而，由于它們的口服生物利用度低和在體內的總的半衰期短，許多迄今開發的 蛋白質和多肽療法的給藥方法已主要被限制在腸外途徑。目前獲準的人類單克隆抗體（快 速發展的靶向治療劑類）都需要通過注射給藥。例如，首先標明用于治療類風濕性關節炎 的人類單克隆抗體阿達木單抗（Humira?，由Abbott銷售）存在于預填充注射器中。只有 少數口服、粘膜或吸入治療性組合物是目前市售的，其中許多僅包含相對較低分子量的多 肽制劑。通過吸入途徑給藥的較高分子量的蛋白質治療劑的一個例子是標明為治療囊腫性 纖維化的重組人類脫氧核糖核酸酶I的溶液阿法鏈道酶（Pulmozyme?，由Roche分銷）。
[0004] 蛋白質和多肽的絕對分子大小和復雜性，以及它們的通過破壞它們的結構完整性 相對容易損失的活性，對加工、配制和輸送這些類型的治療劑提出了挑戰。
[0005] 蛋白質的生物活性是由其獨一無二的三維結構；其二級結構和三級結構決定。圍 繞蛋白質的肽鏈成分之間的諸如氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水作用，以及共價鍵等內部 相互作用的特定的和平衡的組合導致了天然狀態的折疊的蛋白質的最終結構。這些相互作 用的邊際變化可以潛在地對蛋白質的結構完整性有很大的影響。蛋白質的精確的生物功能 是基于其與其它相關的大分子和/或小分子的特異性相互作用。因此，如果以任何方式破 壞必要的三維特征，則蛋白質將失去特異性并因此失去治療效果。
[0006] 可以通過許多降解途徑使天然蛋白質的結構發生損傷。可以通過諸如天然蛋白 質單體的自締合、或部分未折疊的蛋白質締合成非天然寡聚體之類的非共價鍵合作用發生 聚合。也可以通過諸如交聯二硫鍵的形成和/或交換、肽鍵水解、脫酰胺、或氧化之類的共 價的、不可逆的化學作用發生蛋白質的變質和聚合。這些現象的發生率不僅取決于蛋白質 的固有特征，還取決于諸如包括類似凍融周期的相關的應力條件的溫度、pH、蛋白質濃度、 離子強度、去穩定的化學添加劑的存在、諸如空穴作用或切應力之類的干燥和機械應力因 素等一些物理化學環境條件，所有這些因素都可以對天然折疊結構的蛋白質產生不利的影 響。
[0007] 蛋白質締合成這種的通常是高分子量形式的寡聚體，給蛋白質或多肽療法制劑 (therapeutics)的制備、運輸和長期儲存方面造成了嚴重問題。聚合可能導致活性蛋白質 藥物的損失，從而導致不可靠的和無效的配藥。在液體制劑中，可能是不溶性的聚合體可以 沉淀并形成可阻礙流動的大顆粒，這將對腸外施用極為不利。此外，蛋白質聚合體可以表現 出毒性并能觸發不希望有的免疫原性反應（Rosenberg, A. S.，AAPS J，2006, 8, E501)。因此， 選擇用于蛋白質或多肽的液體制劑的介質的特性可對制劑的實用性和壽命產生重大影響。
[0008] 已知水性環境在大多數情況下對蛋白質的結構和生物活性的維持是重要的，即水 分子可以是折疊所必不可少的或者甚至是折疊的驅動力和/或可以在酶的活性中發揮直 接作用。另一方面，取決于水相的組合物的性質以及諸如pH和離子強度之類的各種參數， 水性介質也可能有不良作用。水可以充當增塑劑或者可以用作反應介質以及可以例如在酰 胺鍵水解斷裂中直接作為反應成分。因此，在制定蛋白質療法制劑的領域中已廣泛使用的 方法是將蛋白質冷凍干燥（凍-干）或噴霧干燥成固態粉末的形式。在這種情況下，水的 去除限制了蛋白質大分子與其它物質相互作用的構象的靈活性和擴散的移動性，從而減少 聚合的可能性。因此，與許多水基制劑相比，干燥狀態下的蛋白質的較長期儲存基本上是可 行的。
[0009] 然而，應該指出的是，在冷凍干燥過程本身期間可能很容易發生蛋白質的降解和 聚合，并因此為了減少這些作用的發生率，用于開發冷凍干燥過程的時間投入和成本必然 很高。也經常添加用作補償水的氫鍵合作用的損失的諸如糖類、多元醇等的附加的穩定劑 到預冷凍干燥組合物中。盡管這樣的賦形劑在冷凍干燥過程中是有用的，但是在干燥狀態 下隨著時間的推移例如經由結晶通過相分離可能對蛋白質的穩定性是有害的。為了得到蛋 白質的較長的保質期，也可以根據需要包括其它的冷凍干燥后的穩定賦形劑，從而增加必 定要存在于最終制劑中的組分的數量。
[0010] 另外，盡管除去了水，但是干燥狀態下的蛋白質組合物也不能避免例如溫度、以及 諸如脫酰胺或氧化反應之類的其中水不是關鍵試劑的化學降解反應等外部環境因素的影 響。溫度升高導致流動性增加并且因此有較大的可能性發生蛋白質內部的反應，因此許多 經冷凍干燥的蛋白質仍然需要始終在冷藏條件下儲存。另外，為使制劑的pH和等滲更適合 于冷凍干燥過程而添加的賦形劑可以不是作為最終干燥狀態的蛋白質的穩定劑。水分的 引入可能會是一個問題，而且還必須特別注意干燥固體狀態的蛋白質的儲存裝置（以及材 料）。
[0011] 此外，之前，水性介質中的經冷凍干燥的蛋白質的重組作為實際施用之前的額外 的步驟是必要的，并且有不當處理/劑量和污染的風險。如果水性介質的pH值、或溫度不 是最佳的或者適當的再水合的時間太短，則重組步驟本身可能觸發蛋白質聚合。因此，也可 能需要考慮和適當地研發合適的重組介質的配方。總體而言，從經濟角度來看，與液體制劑 相比，經冷凍干燥的蛋白質的工藝和配方研發涉及大量的時間、精力和成本（Wang, W.，Int. J. Pharm. , 2000, 203, 1) 〇
[0012] 制定蛋白質療法制劑的另一種選擇是使用有機溶劑作為載體介質。然而，應當 注意的是，這些溶劑可能不總是對蛋白質的結構有穩定作用，在某些情況下，反而有相 反作用。例如，較高濃度的諸如DMS0或DMF等強極性溶劑和諸如甲醇或乙醇之類的醇 類通常通過與內酰胺氫鍵競爭可以充當變性劑，該競爭會導致三級結構的喪失；甚至可 以導致二級結構的比率改變，可能導致得到非天然結構（Stevenson, C. L.，Curr. Pharm. Biotech.，2000, 1，165)。因此，這些溶劑可能對蛋白質療法制劑的長期貯存不理想。類似 地，這些類型的溶劑的生理耐受性可能較低，并且需要考慮有關蛋白質的釋放和吸收（還 取決于其在這樣的溶劑體系中的溶解性的狀態）的其它因素。
[0013] 在水性介質中的溶液形式的蛋白質治療制劑往往簡單易得。另一方面，使用有機 溶劑的制劑需要進一步考慮，因為蛋白質在這樣的介質中的總的非溶解性或部分溶解性， 具體取決于溶劑的極性和蛋白質的物理性質。疏水性的有機溶劑和無水的（經冷凍干燥 的）蛋白質的組合通常會產生分散體或懸浮體。在這種情況下，在制劑的研發期間，除了 蛋白質本身的長期穩定性之外，懸浮體的長期物理穩定性也是重要的考慮因素。雖然已 有報道為了腸外應用而使用諸如油和脂類之類的非極性溶劑作為蛋白質或多肽的懸浮載 體，但是這些載體在生理溫度下在延長的時間期間的穩定性已受到質疑（Knepp，V. M. et al, Pharm. Res. 1998, 15, 1090)。此外，這些化合物可能會引起如注射部位疼痛之類的副作 用。此外，油和脂類往往強烈地使治療劑的釋放變緩。這可能是實現較長期的持續釋放或 倉庫型注射制劑的有用的特征，但如果期望得到更迅速和即時的生物利用性，則不是有用 的特征。
[0014] 已描述了基于聚合物的組合物，例如，已經報道包含作為聚合物成分的聚乙烯基 吡咯烷酮以及作為溶劑的乳酸月桂酯（或月桂醇）的適合與可植入裝置結合使用的蛋白質 或肽試劑的粘性非水懸浮制劑（US7258869和EP1152749)。這樣的組合物被認為適合于這 樣的治療劑的持續釋放。
[0015] 全氟化合物也已被用作蛋白質、多肽和其它生物活性劑的非水的液體載體。例如， 在US6458376中描述了建議用于眼科應用（如局部應用的眼藥水）的組合物，其中包括寡 肽和蛋白生長因子的治療/診斷化合物懸浮于全氟化碳并且存在至少一種表面活性劑。然 而，它對能夠適于在含有蛋白質或肽治療化合物的組合物中使用的特定的表面活性劑的選 擇的問題保持沉默，并且沒有討論隨著時間的推移，這樣的特定的化合物在這些制劑中的 長期的化學穩定性和物理穩定性。
[0016] EP0939655(和US6730328)公開了一些熱穩定制劑，在這些熱穩定制劑中，諸如礦 物油、全氟萘烷、甲氧氟烷（methoxyfluorane)、全氟三丁胺或十四烷之類的非水性的、疏水 性的、非反應性的賦形劑中用于含有蛋白質、蛋白質化合物與核酸的懸浮組合物。提出了這 些制劑的腸外給藥方法、透皮給藥方法、粘膜給藥方法、口服給藥方法和經腸給藥方法，以 及提出了它們經由可植入裝置長期連續給藥和輸送的用途。然而，沒有公開在長時間之后 這些懸浮體組合物保持物理穩定的能力，即均勻地分散或再分散的能力。也尚未證實這些 類型的組合物的實際的組織兼容性。
[0017] US2010/0008996中提到作為輸送活性物質到患者的肺膜/肺部區域的載體的 SFAs的吸入或滴注使用。更具體地說，該文獻教導在SFAs中表現出的足夠的溶解性以及 其具有1?0. lnm范圍內的分子尺寸的活性物質的膠束膠體溶液，以便促進穿過肺膜運輸 至血流。它公開了被描述為對吸入或滴注有用的小分子藥物的基于SFA的組合物：布洛芬、 α -生育酚、視黃醇棕櫚酸酯、5-氟尿嘧啶、溴己新、奧司他韋、和氨溴索。與此相反，它并 沒有公開諸如蛋白質之類的為較大分子的活性物質的任何具體組合物，也沒有公開不溶于 SFAs的活性物質的任何具體組合物。
[0018] W02011/073134類似地公開了包括環孢素（一種在半氟化烷烴中分子量為 1202.61的環狀多肽）的任選地在諸如乙醇之類的共溶劑的存在下的溶液。同時也提到懸 浮體和乳液作為任選的替代物，但是沒有具體公開這種類型的組合物。
[0019] Kociok等（Graefe，s Arch Clin Exp 0phthalmol2005, 243, 345-358)探討了巨噬 細胞的穿過細胞膜附著物的活性是否可由一定水泡尺寸的乳化液滴填塞支撐。為此目的， 他們通過擠壓半氟化烷烴使其穿過聚碳酸酯過濾膜進入PBS溶液中制備在水連續相中的 F6H8的乳化液滴（稱為單層水泡）。為了確定人血清白蛋白（HSA)是否對血嗜中性粒細胞 的活化有影響，通過將HSA包含到水性的PBS溶液中使一些液滴包被有HSA。
[0020] 本發明的目的是引入克服與目前已知的制劑相關的局限性和缺點的新的蛋白質 或多肽組合物。


【發明內容】

[0021] 在第一方面中，本發明提供了在包含式RFRH的半氟化烷烴的液體賦形劑中的生 物活性多肽或蛋白質的新的組合物，其中RF是具有4至12個碳原子的直鏈全氟烴段，并且 其中RH是具有4至8個碳原子的直鏈烷基。
[0022] 生物活性多肽或蛋白質優選具有至少約l，500Da的分子量，特別是具有至少約 2000Da的分子量，并且被摻入到組合物中，以形成分散體或懸浮體。多肽或蛋白質優選是治 療劑或診斷劑或疫苗。
[0023] 生物活性化合物優選是對降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白質。本發明人已經發 現相比于其它有機溶劑，使用半氟化烷烴提供了諸如胰島素之類的蛋白質的更穩定的分散 體或懸浮體。結合起來，也已確定，半氟化烷烴對這種化合物具有顯著的穩定作用，并且諸 如胰島素之類的敏感的蛋白質甚至可以經受顯著升高的溫度而不會通過聚合和/或降解 損失生物活性。
[0024] 特別有用的半氟化烷烴是選自根據如本文下面所定義的F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、 F6H6、F6H8和F6H10。這些半氟化烷烴有良好的組織耐受性，能夠溶解在藥物組合物中可能 需要的大范圍的其它賦形劑，并且可能由于它們固有的兩親性而與多肽和蛋白質形成藥學 有利的分散體或懸浮體。
[0025] 在一個方面中，本發明的蛋白質或多肽組合物在室溫下，甚至在高溫（例如，約 37°C，或生理溫度）下是化學穩定和物理穩定的，因此保留了蛋白質或肽試劑的生物活性 以及有微不足道的治療劑的聚合。在進一步的方面，本發明中的蛋白質或多肽懸浮體組合 物在高溫（例如，約37°C，或生理溫度）保存后也保持單分散和/或可以很容易再分散。
[0026] 此外，本發明提供了這種組合物的醫療用途以及穩定對降解和/或聚合敏感的多 肽或蛋白質的方法，該方法包括將多肽或蛋白質摻入包括如上所定義的半氟化烷烴的液體 賦形劑中。

【具體實施方式】
[0027] 在第一方面中，本發明提供了包含生物活性化合物和液體賦形劑的組合物。生物 活性化合物選自屬于多肽和蛋白質的治療劑或診斷劑或疫苗。優選地，多肽或蛋白質具有 至少約1，500Da的分子量，特別是具有至少約2000Da的分子量。液體賦形劑包括式RFRH 的半氟化烷烴，其中RF是具有4至12個碳原子的直鏈全氟烴段，并且其中RH是具有4至8 個碳原子的直鏈烷基。此外，將生物活性化合物摻入組合物中以形成分散體或懸浮體；即， 生物活性化合物分散或懸浮在液體賦形劑中。
[0028] 從醫藥角度來看，半氟化烷烴是非常有利的賦形劑：首先，它們基本上是無毒的， 艮P，各種類型的人體和動物組織在局部給藥或注射后的良好的耐受性。其次，它們是化學惰 性的，并且沒有表現出與藥物制劑中活性成分或非活性成分之間的有害的相互作用。第三， 可能由于它們固有的兩親性的程度，它們能溶解大范圍的化合物，例如小分子的活性成分 或許多常見的在藥物制劑中有用的賦形劑。第四，當摻入不溶于或只是很少溶于半氟化烷 烴（如許多多肽和蛋白質）的化合物時，它們形成具有非常有用的物理或藥學性質的分散 體或懸浮體，即，很少或往往不形成固體的、非分散的沉積物。
[0029] 本發明人發現，在半氟化烷烴中的蛋白質分散體和懸浮體令人驚奇地穩定。它們 保持良好的分散性和均勻性，并且如果發生浮動或沉積時，它通常會緩慢地發生，留下足夠 的時間使患者或護理人員在搖晃容納該制劑的容器（例如小瓶）之后撤回劑量。沒有觀察 到大的很難再分散的聚合體的形成，并且在浮動或沉積之后，通過輕輕搖晃很容易使蛋白 質顆粒再分散而無顯著的損失，并且似乎在很大程度上保留其原始顆粒尺寸分布。
[0030] 與此形成鮮明對比的是諸如全氟化碳之類的其它化學惰性液體賦形劑，全氟化碳 在US5, 518, 731和US6, 458, 376中已被提議作為藥物的賦形劑。本發明人已經發現，當諸如 全氟辛烷或全氟萘烷之類的全氟化合物或如辛烷等其它有機溶劑被用作液體賦形劑時，懸 浮體往往顯著地更不穩定，即它們通過分散相的浮動或通過它的沉積非常迅速地分離，具 體取決于分散相與連續相的相對密度。這伴隨著顆粒聚合體的快速形成，該顆粒聚合體可 能是致密的并且很難再分散。即使快速浮動或沉積沒有使得精確和可重復的劑量給藥變得 不可能，也會使得其非常具有挑戰性。例如，如果可注射或眼用懸浮體在振搖后沉淀很快， 則滿裝容器（例如，小瓶）中的首次劑量給藥在振搖時沒有立即撤回的情況下將含有數量 比預期數量少的藥物顆粒，除非保持容器倒置，這這種情況下，將分配數量比預期數量多的 藥物顆粒。如果每單位體積撤回的藥物劑量在開始時是低的，則當相同的容器幾乎是空的 并且分配最后的劑量時，每單位體積撤回的藥物劑量將會太高，并且反之亦然。
[0031 ] 此外，在全氟化載體或類似辛烷等其它有機溶劑中的蛋白質的大的和很難再分散 的聚合體的形成可能導致諸如那些用于皮下注射的細注射針頭的堵塞。大顆粒有引起體內 不良反應的危險，特別是炎癥性突起（inflammation processes)。
[0032] 還觀察到，懸浮在全氟化合物或辛烷中的顆粒往往粘附到用于撤回劑量的玻璃小 瓶容器和/或針頭注射器的壁上。這也將導致干擾劑量的精確。
[0033] 基于SFA的懸浮體的有利性質導致優秀的藥品質量和性能特點。對患者和/或健 康護理提供者的便利水平大大提高。更重要的是，相比于其它類型的藥物懸浮體，大大提高 了劑量給藥的準確性（即給藥的精度和再現性）。這將帶來更可靠的治療效果并且減少了 由過量給藥帶來的不良反應的風險。
[0034] 同時，半氟化烷烴對多肽和蛋白質有顯著的穩定作用。它們基本上防止或抑制蛋 白質聚合并且顯著地減少化學降解。事實上，已發現，一些敏感的蛋白質穩定到當摻入到半 氟化烷烴中時可以將它們暴露在諸如50°C的高溫下而無生物活性的損失的程度。本發明的 主要優點是由用作液體賦形劑的半氟化烷烴存在于組合物中所帶來的。半氟化烷烴是氫原 子的一些已被氟取代的直鏈或支鏈烷烴。在本發明中使用的半氟化烷烴（SFA's)中，存在 一個線性非氟化的烴段和一個線性全氟化烴段。因此，這些化合物遵循通式F (CF2) n (CH2) mH。根據本發明，η選自4至12的范圍，以及m選自4至8的范圍。
[0035] 經常用于SFA的命名法將全氟化烴段命名為RF并且將非氟化段命名為RH。替代 地，該化合物可以分別地被稱為FnHm和FnHm，其中F表示全氟化烴段，Η表示非氟化段。再 次，m定義各個段的碳原子的數目。例如，F3H3用于全氟丙基丙烷。此外，這種類型的命名 法通常用于具有直鏈段的化合物。因此，除非另有說明，否則應當認為F3H3是指1-全氟丙 基丙烷，而不是指2-全氟丙基丙烷、1-全氟異丙基丙烷、2-全氟異丙基丙烷。
[0036] 在本發明的背景中有用的SFA也在EP-A965334、EP-A965329和EP-A2110126中有 描述，該文件的公開內容并入本文。
[0037] 優選的 SFA 特別包括化合物 F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8 和 F6H10。實施 本發明特別優選的是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8。在另一個特別優選的實施方式中，本發明 的組合物包含F6H8。
[0038] 任選地，組合物可以包含一個以上的SFA。例如，為了實現諸如一定的密度或粘度 之類的特定的目標性能，組合SFA可能是有用的。如果使用SFA的混合物，則該混合物進一 步優選包含F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一種，以及特別是包含F4H5、 F4H6、F6H6和F6H8中的一種。在另一個實施方式中，所述混合物包含選自F4H5、F4H6、F6H4、 F6H6、F6H8和F6H10中的至少兩個成員，以及特別是選自F4H5、F6H6和F6H8中的至少兩個 成員。
[0039] 液體SFA在化學上和生理上是惰性的、無色的和穩定的。它們通常的密度范圍為 1. 1至1. 7g/cm3,以及它們的表面張力可以低至19mN/m。RFRH類型的SFA是不溶于水但也 有些兩親性，親脂性的增加與非氟化段的尺寸增大相關聯。
[0040] RFRH類型的液體SFA商業上用于展開和重新應用視網膜，用于作為玻璃體替代物 的長期填塞物（H.Meinert et al·，European Journal of Ophthalmology, Vol. 10(3)，ρρ· 189-197, 2000)，和用作玻璃體視網膜手術后殘余硅油的洗出溶液。在實驗上，它們也被用 作血液替代物（H. Meinert et al. , Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology, Vol. 21 (5)，pp. 583-95, 1993)。這些應用已經證實了 SFA為生理耐受性良 好的化合物。在另一方面，截至今日SFA沒有被用作已批準的藥品中的賦形劑。
[0041] 本發明的組合物包含選自多肽或蛋白質的生物活性化合物。多肽和蛋白質代表通 過肽鍵相互連接的氨基酸單元的聚合物。由于通常用于區分多肽和蛋白質的大小邊界有些 隨意，這些分子的兩種表達方式（本發明的上下文中）不應被理解為相互排斥的：多肽也可 以稱為蛋白質，反之亦然。通常，術語"多肽"僅指單個聚合物鏈，而表達方式"蛋白質"還 可以指通過非共價鍵彼此連接的兩個或多個多肽鏈。優選地，根據本發明的生物活性化合 物應該具有至少約1，500Da的分子量，特別是具有至少約2000Da的分子量。
[0042] 如上面更詳細描述的，多肽和蛋白質的生物活性不僅依賴于它們的主要化學結 構，即它們的氨基酸序列，而且還依賴于其二級和三級結構，也常常依賴于它們的四級結 構。通常，多肽或蛋白質對降解的敏感性還涉及到它的二級結構、三級結構或甚至四級結 構。將會從本發明獲益的多肽和蛋白質都包括化學性質不穩定的化合物，如容易水解的化 合物，以及具有迅速失去其二級或更高的結構和/或變性的傾向的化合物。特別是，組合物 包含對降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白質。
[0043] 這種敏感性通常意味著相應的化合物不能在常見的水性介質中被配制成液體制 劑（例如，準備通過注射使用），即使在摻入穩定賦形劑（例如緩沖劑等）的情況下也如此， 以及不能在正常條件下儲存。因此，為了得到可接受的保質期（通常為至少2年），敏感的 化合物的藥物制劑在儲存期間或者必須被冷藏，或者它們必須以干燥形式提供，在使用前 從它們的干燥形式重新配制。特別是，"敏感"意味著相應的化合物當被配制在優化的水性 賦形劑中時，于正常條件下在少于1年的儲存時間內就失去至少約5%的生物活性。
[0044] 在優選的實施方式中，多肽或蛋白質是治療性或診斷性化合物或疫苗。如本文所 用，治療性化合物是對防止疾病或病癥、減輕疾病或病癥的任何癥狀、改善任何疾病或病 癥、推遲疾病或病癥的發展或類似的情況有用的化合物。診斷性化合物是對確定生物體的 狀態有用的或者對診斷疾病、病癥、癥狀或患者的表型有用的。治療性化合物必須對患者施 用，而診斷劑則根據具體情況可在體內或體外使用。為免生疑問，將治療性化合物或診斷性 化合物并入治療或診斷有效量的本發明的組合物中。
[0045] 本發明人還發現，半氟化烷烴對化學或生物活性的穩定效果是非常顯著的，前提 為生物活性化合物是在這類治療劑和診斷劑的分子大小的低至中檔范圍內的多肽或蛋白 質。在一個具體的實施方式中，生物活性劑的分子量范圍為從約2, 000至約100, OOODa。在 進一步的實施方式中，該分子量范圍為從約1，〇〇〇至約60, OOODa。在進一步的實施方式中， 該分子量范圍分別為從約2, 000至約60, 000Da，或從約5, 000至約50, 000Da。另一方面， 使用諸如血清白蛋白（大約67kDa)，或甚至超過10萬Da的蛋白質之類的相對大的分子大 小的多肽和蛋白質也容易獲得分散體或懸浮體的物理穩定性和/或容易再分散的益處。在 另一個【具體實施方式】中，生物活性劑是單個結構域的蛋白質或兩個結構域的蛋白質。這是 基于本發明人的發現，即半氟化烷烴的穩定效果在與這種僅有一個結構域的蛋白質或者有 兩個結構域的蛋白質結合時也是非常顯著的。如本文所用，蛋白質結構域是氨基酸序列的 部分，該部分形成能在某種程度上獨立于蛋白質鏈的其余部分發展、發揮功能以及存在的 緊密的、三維的結構。然而，結構域在長度方面可能顯著不同，在大多數情況下，它們包含的 氨基酸單體從約25個至約500個。
[0046] 任選地，生物活性劑可以是酶、激素、或生長因子或結構蛋白質。組合物可包括治 療性荷爾蒙，其用于代替或補充患者體內缺乏的天然激素。組合物可以進一步任選地包括 一個以上的生物活性多肽或蛋白質。
[0047] 在進一步任選的實施方式中，生物活性劑可以是重組的蛋白質或者可以是來自天 然衍生的源的蛋白質或者是合成的肽。蛋白質還可以是天然和/或內源性蛋白質的蛋白質 綴合物或類似物。
[0048] 根據進一步的實施方式，組合物包括作為生物活性劑的胰島素，特別是重組人胰 島素。令人驚奇地發現，分散在半氟化烷烴中的胰島素是極其穩定的，并且甚至當儲存在例 如在約50°C之類的顯著升高的溫度時也不聚合。
[0049] 如所提到的，將多肽或蛋白質摻入組合物中以形成分散體或懸浮體。換句話說，多 肽或蛋白質分散或懸浮在液體載體中。在將蛋白質分散于液體載體中時是否懸浮液取決 于，例如，蛋白質的性質、蛋白質在載體中的濃度以及所選擇的一種或多種SFA。
[0050] 如本文所用，可以將懸浮體定義為一種類型的分散體，即具有至少一個連續（或 連貫的）相和分散在連續相中的至少一個不連續（或內部的）相的系統。在懸浮體中，分 散相是固態。對實施本發明有用的懸浮體至少在生理溫度下是液體，這意味著連續相是液 體。通常，懸浮體在室溫下也是液體。除了懸浮體，術語分散體應理解為包括膠體系統，在 該膠體系統中，蛋白質和多肽均勻分散在液相中。在一些實施方式中，多肽或蛋白質也至少 部分是溶劑化的。
[0051] 在一個【具體實施方式】中，組合物僅僅包含生物活性多肽或蛋白質和一種或多種 SFAs，即該組合物由如上所定義的生物活性多肽或蛋白質和一種或多種SFAs組成。
[0052] 與現有技術中已知的一些其它的懸浮體相比，本發明的制劑的物理穩定性不需要 表面活性劑，或僅需要少量的表面活性劑。這是顯著的優點，因為表面活性劑特別是當通 過皮下或肌內注射或通過滴注到眼睛中給藥時具有相當大的刺激性和局部毒性。根據優 選的實施方式之一，本發明的組合物基本上不含表面活性劑。在另一個實施方式中，如果 摻入一種或一種以上的表面活性劑，則表面活性劑或各種表面活性劑的總量分別不超過 約10wt.-%，特別是不超過約5wt.-%，或者優選地不超過約2wt.-%。在進一步優選的 實施方式中，表面活性劑或各種表面活性劑的總量分別不超過約lwt.-%，或者不超過約 0.5wt.-%。在此背景下，本文描述的SFA盡管由于它們的包括以不同程度的親脂性為特征 的氟化和非氟化的烷基（或亞烷基）基團的化學結構而具有兩親性，但是不應被理解為落 入表面活性劑的范圍內。
[0053] 不存在或僅少量存在的表面活性劑包括非離子型、陽離子型、陰離子型和兩性離 子型表面活性劑，如在各種類型的藥物組合物中常用作賦形劑，例如用作潤濕劑、乳化劑、 分散劑、增溶劑及類似物的表面活性劑。被認為潛在有用的表面活性劑的實施例包括四丁 酌醒，諸如 Pluronic F68LF 或 Lutrol F68、Pluronic L-G2LF 和 Pluronic L62D 之類的泊 洛沙姆，諸如聚山梨酯20和聚山梨酯80之類的聚山梨醇酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，脫水 山梨醇酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、卵磷脂、純化的或合成的磷脂、及其兩種或多種的混合物。
[0054] 例如，為了改變該液體賦形劑的諸如粘度之類的性質，本發明的組合物可以任選 地包括非氟化的有機液體。這樣的其它液體可以是選自甘油酯油、液體蠟、和液體石蠟的 油，或者是表現出高度生物相容性的有機溶劑，或者是一種以上的液體賦形劑的混合物。
[0055] 可以與一種或多種SFA結合使用的可能有用的油性賦形劑的實施例包括甘油三 酯油（即，大豆油、橄欖油、芝麻油、棉子油、蓖麻油、甜杏仁油）、礦物油（即，凡士林和液體 石蠟）、中鏈甘油三酯（MCT)、油脂肪酸、肉豆蘧酸異丙酯、油脂肪醇、山梨糖醇脂肪酸酯類、 油性蔗糖酯、或任何眼睛生理上耐受的其它油性物質。
[0056] 可能有用的有機溶劑的實施例包括甘油、丙二醇、聚乙二醇和乙醇。共溶劑的濃度 相對于SFA或SFA混合物的濃度應優選為低濃度。如果使用諸如乙醇之類的有機溶劑，則 可推薦保持乙醇的含量低于約5wt. 。更優選地，乙醇的含量為從約0. 1至約2wt. -%， 以及最優選不超過約lwt.-%。
[0057] 當然，組合物根據需要或效用可以包含另外的藥物賦形劑。可能有用的賦形劑包 括酸、堿、抗氧化劑、穩定劑、增效劑、著色劑、增稠劑、和在特定的情況下需要的防腐劑。然 而，一般來說，本發明提供了配制微生物學上穩定的非水性組合物的方法。這是緣于SFA通 常不容易產生微生物污染的事實。因此，可以配制不含防腐劑的將要填充在多用容器中的 組合物。許多患者對不含防腐劑的組合物具有較好的耐受性，并且使最終產品的成本降低。
[0058] 本發明的液體懸浮體可以通過常規的方法來制備。原則上，包含活性成分的固體 顆粒可以分散在含有SFA的液態賦形劑中。替代地，在受控條件下通過添加（通常是有機 的）活性成分的溶液（以及，任選地，一種或多種固體賦形劑）到基于SFA的賦形劑中可以 使顆粒原位沉淀。
[0059] 可以在顆粒與液體賦形劑結合之前或者之后調整分散相的粒徑。在優選的實施方 式之一中，提供了已經具有適當所選粒徑的活性成分的顆粒。可以通過晶體工程直接從相 應的化合物的合成來獲得具有這種所選粒徑的粉末，或者在合成后使用諸如球磨機、錘磨 機、輥磨機、膠體磨、噴射磨或類似磨機之類的標準設備通過常規的研磨或制粉獲得具有這 種所選粒徑的粉末。如果制備懸浮體后將要減小粒徑，則可以使用超聲以及各種類型的勻 漿器，諸如膠體磨、高壓均化器等。
[0060] 根據本發明的懸浮體的優秀的物理性質使得這些組合物對患者的眼睛、耳朵、鼻 子或肺部的局部給藥或通過注射不經腸道的給藥特別有用。優選的注射方式包括經皮、皮 下、肌內和局部注射。最優選的注射方式是皮下和肌肉給藥途徑。
[0061] 下面以本發明的一些主要方面說明的實施例將使進一步的實施方式變得明顯。 實施例 實施例1 : α -胰凝乳蛋白酶原A的穩定
[0062] 從蛋白質的儲備溶液制備30小瓶經冷凍干燥的α -胰凝乳蛋白酶原A(CHY)的等 分試樣。向10個等分試樣中的每一個加入2. 5mL磷酸鉀緩沖液（PPB，50mM，pH8. 0)，向另 10個等份試樣中的每一個加入2. 5mL F6H8。剩下的10小瓶作為對照。用氮氣吹掃這些小 瓶，輕輕搖晃并于50°C下儲存。在預定的間隔時間，取出這些小瓶，提取它們的內含物并通 過圓二色性和酶測定法進行分析。
[0063] 結果發現，儲存在緩沖液中的樣品的酶活性在1天的儲存時間過后顯著降低。可 以觀察到聚合。與此相反，SFA樣品在幾個星期之后保留大量的酶活性。事實上，儲存在 F6H8中的CHY的生物活性與對照小瓶中樣品的生物活性是非常相似的。表1示出了每個測 試樣品中測得的以單位/mL表示的酶活性。
[0064] 就圓二色性的結果來看，儲存在F6H8中的CHY的樣品總是與對照樣品高度相似， 而儲存在PPS中的CHY的樣品顯示出表明明顯變性的顯著變化。 表1

【權利要求】
1. 一種組合物，其包括生物活性化合物和液體賦形劑，其中所述液體賦形劑包括式 RFRH的半氟化烷烴，其中RF是具有4至12個碳原子的直鏈全氟烴段，并且其中RH是具有 4至8個碳原子的直鏈烷基；并且其中所述生物活性化合物是選自多肽和蛋白質的治療劑 或診斷劑或疫苗并且被摻入所述組合物中以形成分散體或懸浮體。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述多肽或所述蛋白質具有至少約1，500Da的 分子量，以及特別是具有至少約2000Da的分子量。
3. 根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述生物活性化合物對降解和/或聚合敏 感。
4. 根據任何前述權利要求所述的組合物，其中所述生物活性化合物是單個結構域的蛋 白質或者兩個結構域的蛋白質。
5. 根據任何前述權利要求所述的組合物，其中所述生物活性化合物是胰島素。
6. 根據任何前述權利要求所述的組合物，其中所述半氟化烷烴選自F4H5、F4H6、F4H8、 F6H4、F6H6、F6H8 和 F6H10。
7. 根據任何前述權利要求所述的組合物，其基本上不含水。
8. 根據任何前述權利要求用作藥物的所述的組合物。
9. 根據權利要求8用作藥物的所述組合物，其中所述藥物是通過皮下、真皮、肌內或局 部注射用于腸外給藥的。
10. 根據權利要求8用作藥物的所述組合物，其中所述藥物是用于局部給藥至患者的 眼睛、耳朵、肺部、皮膚或鼻子。
11. 一種制備包含選自多肽或蛋白質的生物活性治療劑或診斷劑或疫苗的組合物的方 法，其包括將所述生物活性多肽或蛋白質摻入包含式RFRH的半氟化烷烴的液體賦形劑中 以形成分散體或懸浮體的步驟，其中RF是具有4至12個碳原子的直鏈全氟烴段，并且其中 RH是具有4至8個碳原子的直鏈烷基。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述多肽或蛋白質具有至少約1，500Da的分子 量，以及特別是具有至少約2000Da的分子量。
13. 根據權利要求11或12所述的方法，其中所述生物活性多肽和蛋白質對降解和/或 聚合敏感。
14. 根據權利要求11至13中任何一項所述的方法，其中所述組合物是化學穩定的和/ 或是物理穩定的。
【文檔編號】A61K47/06GK104066442SQ201380006417
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2012年1月23日
【發明者】伯恩哈德·金特, 巴斯蒂安·泰辛格, 索尼婭·泰辛格, 迪特爾·謝勒, 克萊夫·威爾遜, 安東尼·佩蒂格魯, 安妮特·休蒂格 申請人:諾瓦利克有限責任公司