一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，按如下步驟制得：菌種準備及細菌的增殖；制備滅活菌苗；產蛋雞的免疫；高免蛋的收集；提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥；效價、安全檢驗，形成產品。本發明用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌的滅活菌苗免疫產蛋母雞，從雞蛋黃中提取蛋白質，對水貂綠膿桿菌性肺炎具有特異性的預防和治療作用，不僅不產生耐藥性，在體內不存在藥物殘留，而且該藥物藥效期長，使用成本低，治愈率高，存活數大。
【專利說明】一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及水貂獸藥的制備方法，尤其涉及預防和治療水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法。
【背景技術】
[0002]水貂綠膿桿菌性肺炎是由綠膿桿菌引起的嚴重危害2~7周齡小水貂的一種細菌性傳染病，發病率高(5~90%)，死亡率高(I~80%)，即便沒有死亡的小水貂也會體重減輕，生長遲緩，給水貂飼養業造成嚴重的經濟損失。該病呈世界性分布，在所有養水貂國家和地區流行且危害嚴重。我國獸醫專家郭玉璞于1982年在北京首次確認此病以來，現在全國許多省區(如四川、重慶、北京、上海、浙江等)都相繼有本病的報道。
[0003]抗菌藥物防治是當前防治水貂綠膿桿菌性肺炎的一項最重要的措施，但其存在許多不足:由于綠膿桿菌對抗菌藥物易產生耐藥性，各地分離的菌株對抗菌藥物的敏感性不完全相同，甚至差別很大，致使抗菌藥的應用受到一定的限制。
[0004]要想獲得針對某一水貂飼養場或地區的水貂綠膿桿菌性肺炎具有很好療效的藥物，必須從該地區或飼養場的病死水貂中分離出病原(綠膿桿菌)，再進行體外藥物敏感性試驗，操作復雜和費時，在我國基層獸醫工作中基本不能實現。另外，用藥物治療水貂綠膿桿菌性肺炎需要連續反復給藥，治療成本高，如用高霉素治療水貂綠膿桿菌性肺炎，每只水貂的藥物費用在0.25~0 .35元。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是:提供一種療效好，成本低的抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥的制備方法。
[0006]本發明的技術解決方案是:一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥的制備方法，其步驟是:
1、一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:按如下步驟制得:
(I)菌種準備及細菌的增殖
將真空凍干保存的綠膿桿菌用生理鹽水(生理鹽水為重量體積比為0.9%的氯化鈉水溶液)按體積比1:1稀釋，接種于NAC瓊脂培養基，在37°C的培養箱中培養18~24小時，經純度檢驗沒有雜菌生長后，用生理鹽水制成菌懸液接種于LB瓊脂培養基，37°C的培養箱中培養36~48小時后，收集細菌。
[0007]所述LB培養基的配制按如下所需組分重量稱取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12.0g/L，加700_800ml蒸餾水溶解，然后加蒸餾水補至1000ml，116°C高壓滅菌30min后備用。
[0008](2)制備滅活菌苗
將收集的細菌用生理鹽水懸浮成菌懸液，即把在培養基上生長的細菌菌落加入到生理鹽水中混勻，使每毫升菌懸浮含150~200億個細菌，用終濃度重量體積比為0.3%的甲醛在37°C下滅活24小時，即為制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳劑滅活菌苗，并進行滅活菌苗的安全檢驗；
(3)產蛋雞的免疫
選25周齡的健康產蛋母雞用安全檢驗合格的滅活菌苗進行免疫，免疫程序為:
第1次免疫:每只雞腿肌注射0.2ml，頸部皮下注射0.2ml,
第2次免疫:2周后每只雞頸部皮下注射1.0ml,
第3次免疫:2周后，每只雞頸部皮下多點注射1.5ml ；
(4)高免蛋的收集
產蛋雞第3次免疫后14天，開始抽樣測定高免雞蛋黃中抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體效價，蛋黃與生理鹽水按體積比1: 3稀釋后，加入等體積三氯甲烷萃提，上清液瓊擴效價> I: 16即為合格，之后收集雞蛋；
(5)提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥
A、蛋殼消毒:將雞蛋浸入加熱至42°C的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒25~35分鐘，取出涼干或吹干備用；
B、打蛋分離蛋黃:采用手工或機械打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；
C、萃提:先充分攪拌蛋黃呈均勻膏狀，然后加入3倍體積的高壓的滅菌生理鹽水，再次充分攪拌混勻，使成為蛋`黃液；在該蛋黃液中加入等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合，靜置60分鐘后以3500~4000rpm用離心機離心30分鐘，收集離心管中的上清液；
D、加入滅活劑和穩定劑:上清液按終濃度體積比為0.05%加入甲醛，充分攪拌混合，密封30~60分鐘后加入終濃度重量體積比為0.02%的穩定劑吐溫-20，混勻；
E、除菌過濾:用0.2~0.3um微孔濾膜過濾除菌，即得到抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，主要成分是卵黃抗體；
(6)效價、安全檢驗，形成產品
效價用含8%Nacl的1%瓊脂，即用8%氯化鈉溶液配制的瓊脂，瓊脂的含量是1%，1%為重量體積比，為載體的瓊擴試驗檢測，檢測用抗原為綠膿桿菌脂多糖抗原，抗原含量為150~200mg/ml ； 18~20g小鼠3只做安全性檢驗，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，觀察7天，無任何異常反應為合格。
[0009]在上述步驟(1)的菌種準備及細菌的增殖中，所述NAC瓊脂培養基的配制方法:按如下所需組分重量稱取，蛋白胨20.0g/L,硫酸鎂0.2g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.2g/L，磷酸氫二鉀0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，瓊脂12.0g/L，然后將蛋白胨、硫酸鎂、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸氫二鉀、萘啶酮酸、瓊脂混合成NAC瓊脂混合物，稱取所述NAC瓊脂混合物33克，加蒸餾水1000ml，加熱煮沸直至混合物全部溶解，搖勻，傾注平板，用于假單胞菌屬分離培養；所述LB培養基的配制按如下所需組分重量稱取，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉 5g/L，瓊脂 12.0g/L。
[0010]在上述步驟(2)的制備滅活菌苗中，乳化是指先分別制備油相和制備水相，再按體積比1:3混合乳化，其中:制備油相，取94ml的10號白油，6ml的司本_80，硬脂酸鋁2g,先將硬脂酸鋁與20~30ml白油混合加熱到70~80°C熔化后，再補足剩余10號白油及加入司本-80充分攪拌分裝，在溫度116°C下滅菌30分鐘，最后在10°C冷藏備用；制備水相，取96ml滅活菌抗原懸液，4ml的吐溫-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速組織搗碎機缸內，在30~50轉/分鐘的慢速下攪拌，緩緩加入水相之后在180~200轉/分鐘的高速下攪拌2~5分鐘，在終止攪拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液終濃度為萬分
之一 O
[0011]本發明的技術效果是:本發明提供一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，通過用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌(綠膿桿菌)的滅活菌苗免疫產蛋母雞，從雞蛋黃中提取的一種蛋白質，將該蛋白質用于防治水貂綠膿桿菌性肺炎，來解決用抗菌藥物防治水貂綠膿桿菌性肺炎存在的易產生耐藥菌株、需連續反復給藥及成本高的問題。
[0012]另外，用水貂綠膿桿菌性肺炎病原菌(綠膿桿菌)的滅活菌苗免疫產蛋母雞，從雞蛋黃中提取的一種蛋白質，它對水貂綠膿桿菌性肺炎具有特異性的預防和治療作用及綠膿桿菌不對它產生耐藥性。感染綠膿桿菌性肺炎病的水貂用本發明抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥治療后，其體內不存在藥物殘留，該藥物藥效期長，可達5~7天，一般患病水貂用藥一次即可治愈，使用成本低，每只病水貂的治療成本在0.08~0.12元。因此，本發明抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥在水貂綠膿桿菌性肺炎的防治中具有特效，無殘留，不產生耐藥性，藥效期長，價格低的特點，是一種“綠色”藥物，在獸醫公共衛生學上有重要意義。
[0013]本發明經實驗證明取得顯著成功，完全達到了發明的目的。它不僅不產生耐藥性，在體內不存在藥物殘留，該藥物藥效期長，使用成本低，而且，治愈率高，存活數大。
[0014]下面是用本發明獸藥對水貂傳染性肺炎的預防和治療試驗情況說明: 試驗一:400只14日齡小水貂，用不含抗菌藥物的飼料飼喂，隨機分成2組，每組200只；第I組試驗水貂每只腿部肌注1.0 ml抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥，第2組試驗水貂每只腿部肌注1.0 ml生理鹽水:分別于注射后24小時，72小時，120小時及168小時從各組中隨機抽取50只試驗水貂用于攻毒試驗，結果表明第I組試驗水貂在24小時，72小時，120小時及168小時攻毒后存活率為100%。
[0015]試驗二:用不含抗菌藥物的飼料飼喂400只14日小水貂，隨機分成4組，每組100
只，在實驗室條件下人工感染水貂綠膿桿菌性肺炎。第1、2、3組試驗水貂分別在感染后
12小時，24小時，36小時每只水貂腿部肌肉注射抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥1.0
ml治療，第4組為空白對照，其結果為--第1、2、3組的治愈比分別為98/100 (98%)、85/92
(92.4%)、49/70 (70%)，第4組的存活數為O (0/1 00)。詳見下表:
【權利要求】
1.一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:按如下步驟制得: (I)菌種準備及細菌的增殖 將真空凍干保存的綠膿桿菌用生理鹽水按體積比1:1稀釋，接種于NAC瓊脂培養基，在37°C的培養箱中培養18~24小時，經純度檢驗沒有雜菌生長后，用生理鹽水制成菌懸液接種于LB瓊脂培養基，在37°C的培養箱中培養36~48小時后，收集細菌； (2)制備滅活菌苗 將收集的細菌用生理鹽水懸浮成菌懸液，使每毫升菌懸液含150~200億個細菌，用終濃度0.3%甲醛在37°C下滅活24小時，即為制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳劑滅活菌苗，并進行滅活菌苗的安全檢驗； (3)產蛋雞的免疫 選25周齡的健康產 蛋母雞用安全檢驗合格的滅活菌苗進行免疫，免疫程序為: 第1次免疫:每只雞腿肌注射0.2ml，頸部皮下注射0.2ml, 第2次免疫:2周后每只雞頸部皮下注射1.0ml, 第3次免疫:2周后，每只雞頸部皮下多點注射1.5ml ； (4)高免蛋的收集 產蛋雞第3次免疫后14天，開始抽樣測定高免雞蛋黃中抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體效價，蛋黃與生理鹽水按體積比1: 3稀釋后，加入等體積三氯甲烷萃提，上清液瓊擴效價> I: 16即為合格，之后收集雞蛋； (5)提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥 A、蛋殼消毒:將雞蛋浸入加熱至42°C的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒25~35分鐘，取出涼干或吹干備用； B、打蛋分離蛋黃:打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃； C、萃提:先充分攪拌蛋黃呈均勻膏狀，然后加入3倍體積的高壓滅菌生理鹽水，再次充分攪拌混勻，使成為蛋黃液；在該蛋黃液中加入等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合，靜置60分鐘后裝入離心管以3500~4000rpm離心30分鐘，收集離心管中的上清液； D、加入滅活劑和穩定劑:上清液按終濃度為0.05%加入甲醛，充分攪拌混合，密封30~60分鐘后加入終濃度為0.02%的穩定劑吐溫-20，混勻； E、除菌過濾:用0.2~0.3um微孔濾膜過濾除菌，即得到抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥； (6)效價、安全檢驗，形成產品 效價用含氯化鈉的瓊脂為載體進行瓊擴試驗檢測，所述含氯化鈉的瓊脂是用8%氯化鈉溶液配制的瓊脂，瓊脂的含量是1%，檢測用抗原為綠膿桿菌脂多糖抗原，抗原含量為150~200mg/ml ；18~20g小鼠3只做安全性檢驗，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，觀察7天，無任何異常反應為合格。
2.根據權利要求1所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:在步驟(1)的菌種準備及細菌的增殖中，所述NAC瓊脂培養基的配制方法:按如下所需組分重量稱取，蛋白胨20.0g/L,硫酸鎂0.2g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.2g/L，磷酸氫二鉀.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，瓊脂12.0g/L,然后將蛋白胨、硫酸鎂、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸氫二鉀、萘啶酮酸、瓊脂混合成NAC瓊脂混合物，稱取所述NAC瓊脂混合物33克，加蒸餾水至1000ml，加熱(不用煮沸)直至混合物全部溶解，搖勻，傾注平板，用于假單胞菌屬分離培養；所述LB培養基的配制按如下所需組分重量稱取混合:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12.0g/L，加700_800ml蒸餾水溶解，然后加蒸餾水補至1000ml，116 °C高壓滅菌30分鐘后備用。
3.根據權利要求1或2所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于:在步驟(2)的制備滅活菌苗中，乳化是指先分別制備油相和制備水相，再按體積比1:3混合乳化，其中:制備油相，取94ml的10號白油，6ml的司本_80，硬脂酸鋁2g，先將硬脂酸鋁與20~30ml白油混合加熱到70~80°C熔化后，再補足剩余10號白油及加入司本-80充分攪拌分裝，在溫度116°C下滅菌30分鐘，最后在10°C冷藏備用；制備水相，取96ml滅活菌抗原懸液，4ml的吐溫-80 ;乳化按3ml油相和Iml水相配制，取油相加入高速組織搗碎機缸內，在30~50轉/分鐘的慢速下攪拌，緩緩加入水相之后在180~200轉/分鐘的高速下攪拌2~5分鐘，在終止攪拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液終濃度為萬分之一。
【文檔編號】A61P31/04GK103690951SQ201310748239
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】趙成新, 李曉麗, 王先德, 欒浩麟, 房超, 鄒德志, 劉懷華 申請人:煙臺金海藥業有限公司