褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了褪黑素的新用途，褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用。通過實驗表明：褪黑素協同細胞外基質生物材料體系能促進間充質干細胞體外增殖，保持細胞良好的成纖維形狀，降低胞內ROS及促進外基質鈣沉積的產生，提高成骨基因表達，確定了褪黑素協同細胞外基質生物材料促進間充質干細胞體外成骨分化及機制，為褪黑素協同細胞外基質生物材料用于治療骨關節炎，骨缺損，骨創傷等疾病的修復材料奠定了基礎。
【專利說明】褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織工程修復與再生領域，具體涉及褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化(Osteogenesis)藥物中的應用及褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，包括胚胎干細胞、間充質干細胞和多能誘導干細胞，可以進一步分化為各種不同的組織，構成各種復雜的機體器官，已被廣泛地應用于再生醫學與組織工程領域。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在發育、生長、組織器官自體再生、維持體內微環境平衡等方面發揮著重要的作用，由于其具有容易提取、較強的自我更新能力和多向分化能力、較強的免疫抑制效果等特點，已經廣泛應用于再生醫用、基因治療、組織工程、細胞因子替代療法等領域。
[0003]骨關節炎，骨損傷，骨創傷是影響人類健康最常見疾患之一。以骨關節炎為例，在超過50歲以上人群中，骨關節炎在導致長期殘疾的疾病中僅次于心血管疾病排名第二，骨關節炎致殘比例在人群中約占2%-6%。根據1994年統計，在美國，骨關節炎的消耗為5億美元，其中一半以上消耗緣于工作能力喪失。骨關節炎較其他疾病更易于影響老年患者的行走、上下樓梯和其他下肢功能。骨關節炎及骨損傷是導致50歲以上人群功能殘疾、造成經濟損失和影響社會發展的主要疾 病之一，醫學及臨床急需開發優良的治療骨關節疾病的方法迫在眉睫。
[0004]褪黑素是松果體產生的一種吲哚胺類激素，褪黑激素的生物合成受光周期的制約，在剛出生的嬰兒體內也能檢出很少量的褪黑激素，直到三月齡時分泌量才增加，并呈現較明顯的晝夜節律現象，3~5歲幼兒的夜間褪黑激素分泌量最高，青春期分泌量略有下降，以后隨著年齡增大而逐漸下降，到青春期末反而低于幼兒期，到老年時晝夜節律漸趨。多項研究表明，褪黑素可以促進睡眠，調節免疫作用以及抗衰老抗腫瘤等多項功能。同時，褪黑素具有抗氧化抗炎癥的作用，調節細胞內活性氧和一氧化氮誘導酶產生。近幾年褪黑素作用于細胞增殖及分化研究深入，特別是成骨分化研究。最新研究報道指出褪黑素能提高間充質干細胞堿性磷酸酶(ALP);—些體內研究表明褪黑素在藥理學劑量上能促進小鼠骨密質形成。
[0005]褪黑素已被證明通過減少活性氧保護神經系統且能阻止過氧化氫引起的骨髓間充干細胞凋亡。然而，褪黑素協同細胞外基質生物材料促進間充質干細胞成骨分化的潛在保護作用及機制的報道非常少。
【發明內容】
[0006]本發明的發明目的在于公開一種褪黑素的新應用，填補現有技術空白。
[0007]褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，所述細胞外基質生物材料的制備步驟為先在普通細胞培養基材上體外培養外源細胞并誘導外源細胞分泌基質，再脫細胞處理；所述外源細胞為骨髓間充質干細胞。
[0008]優選的，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞(MSCs)。種子細胞研究是骨組織工程學的重要內容。理想的骨種子細胞應該具有以下特點:結構比較簡單，是不具有特定機能的原始細胞；取材容易，對機體損傷小；體外培養時增殖力強；自我更新，一定的條件下能向特定的方向分化；穩定表達成骨細胞表型；植入體內后能繼續產生成骨活動；無致瘤性。目前，做為骨組織工程的種子細胞有4種來源:骨、骨外膜、骨髓和骨外組織。比較而言，骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)是骨髓內存在的一類非造血干細胞，其在體內外具有支持和調控造血的作用，并且在體內可分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能，能夠向成骨系細胞、成纖維系細胞、網狀細胞、脂肪細胞和內皮細胞等分化，是目前應用較廣泛的重要種子細胞之一。
[0009]褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述細胞外基質生物材料的制備步驟為先在普通細胞培養基材上體外培養外源細胞并誘導外源細胞分泌基質，再脫細胞處理；所述外源細胞為骨髓間充質干細胞。
[0010]所述骨疾病為骨關節炎癥、骨缺損或骨創傷。
[0011]由于細胞外基質(extracellular matrixc, ECM),是由動物細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖。細胞外基質影響細胞的存活、生長與死亡決定細胞的形狀，決定細胞的形狀參與細胞的遷移，它對細胞的形狀、結構、功能、存活、增殖、分化、遷移等一切生命現象具有全面的影響，因而無論在胚胎發育的形態發生、器官形成過程中，或在維持成體結構與功能完善(包括免疫應答及創傷修復等)的一切生理活動中均具有不可忽視的重要作用。
[0012]本發明將褪黑素與細胞外基質生物材料協同使用，通過實驗發現褪黑素與細胞外基質生物材料組成的調控體系能促進間充質干細胞體外增殖，保持細胞良好的成纖維形狀，降低胞內ROS及促進外基質鈣沉積的產生，提高成骨基因表達，效果明顯由于褪黑素或細胞外基質生物材料的單獨使用。
[0013]本發明所述細胞外基質生物材料的制備步驟為先在普通細胞培養基材上體外培養外源細胞并誘導外源細胞分泌基質，再脫細胞處理、干燥、滅菌消毒。上述步驟中體外培養外源細胞、誘導外源細胞分泌基質、脫細胞處理、干燥、滅菌消毒等步驟均采用本領域常規操作，采用的培養液等試劑也為本領域常規選擇，所述外源細胞為骨髓間充質干細胞。
[0014]出于獲取難度和成本考慮，優選地，本發明所述骨髓間充質干細胞取自人源、豬源、鼠源或兔源。
[0015]作為一種實施方案，所述細胞外基質的制備步驟如下:
S1.從人源、豬源、鼠源或兔源組織獲取骨髓間充質干細胞；
S2.配置誘導培養液；
S3.在普通細胞培養基材上體外培養骨髓間充質干細胞并誘導其分泌細胞外基質，培養疒20天，隔日換液；
S4.脫細胞處理；
步驟S3所述普通細胞培養基材為商用細胞培養皿、培養板或培養瓶。
[0016]步驟S2中所述誘導培養液的組成為:普通商用培養基a -MEM 80^90%體積比，胎牛血清10-20%體積比，抗生素1(T200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25禮，刺激因子組分。
[0017]所述刺激因子組分由抗壞血酸10-?00 μ g/mL,脯氨酸20-60 μ g/mL,地塞米松IOOnM~I μ M中的一種或幾種組成。
[0018]步驟S4中所述脫細胞處理為先加入含有氨水和Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)的脫細胞處理液處理，再加入脫氧核糖核酸酶處理。
[0019]所述脫細胞處理液由pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton Χ-100 1~5%體積比和氨水0.8~5%體積比。
[0020]所述脫氧核糖核酸酶溶液由ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有50(T800 U/mL脫氧核糖核酸酶。
[0021]本發明所述細胞外基質生物材料脫細胞處理后，可直接與褪黑素協同使用或干燥、滅菌消毒后備用，所 述滅菌消毒采用6ciCo或環氧乙烷滅菌。
[0022]本發明將間充質干細胞培分別培養于四種不同培養體系:傳統培養板體系(TCPS)，傳統培養板與褪黑素體系(TCPS+MT)，細胞外基質生物材料體系(ECM)，褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系(ECM+MT)，研究比較褪黑素協同細胞外基質生物材料促進間充質干細胞體外增殖及成骨化及機制，進一步將褪黑素協同細胞外基質生物材料用于臨床對骨關節炎，骨缺損，骨創傷等疾病修復治療奠定基礎，為骨組織工程相關治療提供一種有效的方法。
[0023]本發明的檢測內容包括:(I)細胞外基質生物材料對褪黑素吸附檢測(2 )DNA檢測細胞增殖；(3)流式細胞儀檢測間充質干細胞胞內活性氧(ROS) ； (4)成骨鈣沉積檢測；(5)實時熒光定量RT-PCR在mRNA水平檢測I型膠原及OPN成骨目標基因表達水平。
[0024]為了證明上述應用的實用性，本發明通過如下技術方案予以證明:
(A)采用上述細胞外基質的制備方法制備細胞外基質生物材料。
[0025](B)取用骨髓來源的間充質干細胞P3代分別培養于傳統培養板(TCPS)與細胞外基質生物材料培養板(ECM)中，分別更換基礎培養基或含IOOuM褪黑素的基礎培養基，依次創建四種培養體系:傳統培養板體系(TCPS)，傳統培養板與褪黑素體系(TCPS-MT)，細胞外基質生物材料體系(ECM)，褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系(ECM-MT)，置于5%C02, 37°C恒溫培養箱中，隔天更換一次培養基，培養5~7天。
[0026](C)檢測以下結果:細胞外基質生物材料對褪黑素的吸附、間充質干細胞增殖及細胞內活性氧(R0S)、細胞外基質鈣沉積量及I型膠原與OPN成骨目標基因檢測，驗證褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系對間充質干細胞成骨分化促進作用。
[0027]具體分析步驟如下:
(O高效液相色譜儀檢測上清液褪黑素量，分析細胞外基質生物材料對褪黑素的吸
附；
(2)DNA量檢測分析不同培養體系對間充質干細胞增殖影響；
(3)流式細胞術檢測分析，不同培養體系對間充質干細胞內活性氧影響；
(4)成骨誘導14天后，細胞外基質鈣沉積量檢測及實時熒光定量RT-PCR分析成骨目標基因表達，分析不同培養體系對間充質干細胞在成骨分化影響。
[0028]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
本發明公開了褪黑素的新用途，褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用。通過實驗設計四種不同的培養體系，研究褪黑素生物材料調控體系對人來源的間充質干細胞體外增殖及成骨分化的促進作用研究，研究表明:細胞外基質生物材料對褪黑素具有一定程度的吸附作用，與褪黑素協同使用構成褪黑素生物材料調控體系，褪黑素生物材料調控體系能促進間充質干細胞體外增殖，保持細胞良好的成纖維形狀，降低胞內ROS及促進外基質鈣沉積的產生，提高成骨基因表達。本研究確定了褪黑素協同細胞外基質生物材料促進間充質干細胞體外成骨分化及機制，為褪黑素協同細胞外基質生物材料用于治療骨關節炎，骨缺損，骨創傷等疾病的修復材料奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1為生物材料對褪黑素吸附檢測結果圖；
圖2為四種不同培養體系中，骨髓間充質干細胞細胞形態及增殖研究；
圖3為四種不同培養體系中，骨髓間充質干細胞細胞胞內活性氧研究；
圖4為四種不同培養體系中，骨髓間充質干細胞成骨分化鈣沉積量檢測；
圖5為四種不同培養體系中，骨髓間充質干細胞體外成骨分化COL 1、OPN成骨目標基因表達研究。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0031]實施例1細胞外基質`生物材料的制備 制備步驟為:
51.從人源組織獲取骨髓間充質干細胞；
52.配置誘導培養液:培養基a-MEM 80體積比，胎牛血清20%體積比，抗生素10-200U/mL,腺嘌呤0.25 mM,脯氨酸50 μ g/mL,地塞米松IOOnM ；
53.按照20，000個細胞/cm2的密度在普通商用細胞培養板上體外培養骨髓間充質干細胞并誘導其分泌細胞外基質，于37° C的5%的CO2培養箱中培養7~20天，隔日換液；
54.脫細胞處理:先用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次，接著加入含有Triton X-1005%體積比和氨水4%體積比的脫細胞處理液，于37°C的5%的CO2培養箱中靜置5分鐘，用PH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次，再加入含有800U/mL脫氧核糖核酸酶溶液于37° C的5%的CO2培養箱中靜置60分鐘，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3次。
[0032]實施例2細胞外基質生物材料對褪黑素的吸附檢測
將實施例1中脫細胞后細胞外基質生物材料細胞培養板及傳統未經任何處理的商用培養板孵育于IOOuM褪黑素磷酸緩沖液，至于37°C 5%C02恒溫箱中，分別收集0，0.5，1,2,4,6,12，24，48，72小時上清液進行高效液相色譜儀檢測。采用55/45體積比甲醇和水的流動相，流速為lml/min222um紫外檢測,上清液褪黑素含量同原始含量比值如圖1所示。TCPS組上清液褪黑素含量為95.4%-97.9%，而生物材料組僅含有71.1%_87.4%，表明生物材料組對褪黑素有明顯吸附作用，可構建細胞外基質生物材料協同褪黑素調控體系。
[0033]實施例3四種培養體系中骨髓間充質干細胞增殖及胞內活性氧研究P3代骨髓間充干細胞按3000cell/cm2接種6孔板中，包括有未經任何處理的傳統商用培養板和實施例1制得含有細胞外基質生物材料的培養板，加入基礎培養基(α -MEM,10%FBS, 100 U/mL 青霉素，100 μ g/mL 鏈霉素，0.25 μ g/mL 二性霉素 B)或含有 IOOuM 褪黑素基礎培養基，隔天換液，依次創建四種培養體系:傳統培養板體系(TCPS)，傳統培養板與褪黑素體系(TCPS-MT)，細胞外基質生物材料體系(ECM)，褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系(ECM-MT)。
[0034]I)使用0.25%胰酶收集培養5天后孔板的細胞。收集細胞采用125 μ g/mL木瓜蛋白酶60°C消化4小時，木瓜蛋白酶溶解于含有10 mM L-半胱氨酸PBE緩沖液(100 mM磷酸鹽，10 mM EDTA，pH 6.5)中。消化的細胞 DNA 量采用 Quant-1T? PicoGreen? dsDNAassay kit照試劑說明書操作，最后多功能酶標儀檢測讀數。如圖2所示。從圖2可以看出，與TCPS相比，僅加入褪黑素組細胞增殖無明顯的差異性，但含有細胞外基質生物材料組的細胞增殖效率明顯提高，其中ECM組DNA含量達49.1 ± 5.5 ng/孔，而ECM+MT組DNA增加到64.2 ± 7.9 ng/孔。
[0035]2)使用0.25%胰酶收集培養7天后孔板的細胞，步驟同上。細胞內ROS采用2' ’7' - 二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)檢測。10 μ M DCFH-DA 37°C孵育IOmin孵育細胞后，采用BD雙波長激光流式細胞儀進行檢測細胞內的熒光強度，每個樣品收集10000個細胞。結果 如圖3所示，從圖3可以看出，傳統培養板中加入褪黑素后，胞內活性氧明平均值顯下降30.1%，ECM組及ECM+MT組胞內活性氧達到最低水平。
[0036]實施例4四種培養體系中骨髓間充質干細胞體外成骨分化研究
P3代骨髓間充干細胞按15000cell/cm2接種6孔板中，包括有未經任何處理的傳統商用培養板和實施例1制得含有細胞外基質生物材料的培養板，待細胞密度大95%以上換成骨培養基(成骨培養基:基礎培養基，0.2 mM抗壞血酸，10_7 M地塞米松，10 mM β-甘油磷酸酯)或含有IOOuM褪黑素成骨培養基，隔天換液，依次創建四種培養體系:傳統培養板體系(TCPS)，傳統培養板與褪黑素體系(TCPS-MT)，細胞外基質生物材料體系(ECM)，褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系(ECM-MT)。
[0037]I)圖4為成骨誘導14天后,細胞外基質的?丐沉積采用0.5%菌草素紅液進行染色I小時，PBS洗滌后采用500ul 1%氯化氫孵育，采用多功能酶標儀在420nm處檢測吸光值分析成骨分化細胞外基質鈣沉積量結果。從圖4可以看出，與TCPS組相比，ECM組鈣沉積量提高61.9%，而加入褪黑素的生物材料體系，鈣沉積量比僅生物材料組提高30.5%，存在極
顯著性差異。
[0038]2)四種不同培養體系中，間充質干細胞成骨分化的分子水平機制解釋。分組同本實施例步驟1)，成骨誘導14天后，Trizol法提取總RNA、逆轉錄，用實時熒光定量定量RT-PCR鑒定成骨相關基因(C0L I，0ΡΝ)，結果如圖5所示，ECM-MT組中，COL I表達量比TCPS組提高了 69.1%，比僅生物材料組表達量提高40.5%，存在極顯著性差異。其中OPN基因的表達同COL I趨勢相同，褪黑素生物材料組能明顯提高OPN的表達。
[0039]綜上實驗表明，褪黑素，特別是褪黑素協同細胞外基質生物材料調控體系可用于促進間充質干細胞體外大規模增殖，促進間充質干細胞體外成骨分化，可作為骨組織工程中治療修復骨關節炎，骨損傷，骨創傷等疾病優良的材料體系。
【權利要求】
1.褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述細胞外基質生物材料的制備步驟為先在普通細胞培養基材上體外培養外源細胞并誘導外源細胞分泌基質，再脫細胞處理；所述外源細胞為骨髓間充質干細胞。
2.根據權利要求1所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述間充質干細胞為骨髓間充質干細胞。
3.根據權利要求1或2所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述骨髓間充質干細胞取自人源、豬源、鼠源或兔源。
4.根據權利要求1或2所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述誘導外源細胞分泌基質時使用的誘導培養液組成為:培養基α-ΜΕΜ 80~90%體積比，胎牛血清10~20%體積比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2^0.25禮，刺激因子組分；所述所述刺激因子組分由抗壞血酸10-100 μ g/mL，脯氨酸20~60 μ g/mL,地塞米松1OOnm-l μ M中的一種或幾種組成。
5.根據權利要求1或2所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備促進間充質干細胞成骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述脫細胞處理為先加入含有氨水和TritonX-100的脫細胞處理液處理，再加入脫氧核糖核酸酶處理，所述脫細胞處理液由pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton X-100 1-5%體積比和氨水0.8~5%體積比，所述脫氧核糖核酸酶溶液由ΡΗ7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有500-800 U/mL脫氧核糖核酸酶。
6.褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述細胞外基質生物材料的制備步驟為先在普通細胞培養基材上體外培養外源細胞并誘導外源細胞分泌基質，再脫細胞處理；所述外源細胞為骨髓間充質干細胞。
7.根據權利要求6所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述骨髓間充質干細胞取自人源、豬源、鼠源或兔源。
8.根據權利要求6或7所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述骨疾病為骨關節炎癥、骨缺損或骨創傷。
9.根據權利要求6或7所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述誘導外源細胞分泌基質時使用的誘導培養液組成為:培養基a -MEM 80~90%體積比，胎牛血清10~20%體積比，抗生素10^200 U/mL,腺嘌呤0.2~0.25mM，刺激因子組分；所述所述刺激因子組分由抗壞血酸10-100μ g/mL，脯氨酸20-60 μ g/mL,地塞米松100nΜ- μ M中的一種或幾種組成。
10.根據權利要求6或7所述褪黑素協同細胞外基質生物材料在制備治療骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述脫細胞處理為先加入含有氨水和Triton X-100的脫細胞處理液處理，再加入脫氧核糖核酸酶處理，所述脫細胞處理液由PH7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有Triton X-100 1-5%體積比和氨水0.8~5%體積比，所述脫氧核糖核酸酶溶液由ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液配制，含有500-800 U/mL脫氧核糖核酸酶。
【文檔編號】A61L27/38GK103736150SQ201310747944
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月31日 優先權日:2013年12月31日
【發明者】龔逸鴻, 何帆, 曾易, 劉小珍, 蔣慶 申請人:中山大學