從泥炭中制備靶向性前藥的方法、靶向性前藥及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從泥炭中制備靶向性前藥的方法，以及由該方法得到的靶向性前藥和該前藥的用途。所述的方法包括下述步驟：（1）制備生物活性組分和印跡分子；（2）將分別含有生物活性組分和印跡分子的兩種反應液混合，進行偶聯反應，偶聯反應結束后對產物進行提純，即得靶向性前藥。本發明的靶向性前藥能夠抗病毒細胞，或抑制胃癌、肺癌腫瘤、抗關節炎、白血病；與阿昔洛韋、5-氟尿嘧啶、環磷酰胺或雷公藤相比，效果相當甚至更佳。
【專利說明】從泥炭中制備靶向性前藥的方法、靶向性前藥及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從泥炭中制備靶向性前藥的方法，以及由該方法得到的靶向性前藥和該靶向性前藥的用途。
【背景技術】
[0002]泥炭(peat)又稱草炭、泥煤，是植物殘體腐殖化初期階段的產物。云南省石屏縣寶秀鎮的泥炭產地為洼地，具有植物蘆葦、苔草、睡菜、拂子茅、席草等低等植物的特征，以草炭為主，也有木炭高等植物的遺骸特征，該泥炭含有纖維素、木質素、腐植酸、蛋白質、浙
主雄
冃寺?
[0003]以目標分子(稱為印跡分子)為模板合成藥物的方法，可追溯到Pauling提出的以抗原為模板合成抗體的設想；分子印跡技術發端于20世紀70年代，在90年代得到較快發展。分子印跡法制藥具有:構效預定性、特異識別性、實用性、穩定性等優點，能夠識別生物分子和化學分子，如氨基酸(蛋白質的單體主要有脂族氨基酸，也有少量芳香族氨基酸，如色氨酸、組氨酸等，肽鍵(-NH-CO-)、硫醚鍵(-S-S-)、脒鍵(-N=C-)，酯鍵、氫鍵連接起來，形成具有三維網狀分子特征的蛋白質)和蛋白質(王戰勇，蘇婷婷.泥炭固體發酵生產單細胞蛋白的研究.氨基酸和生物資源2007.29(3):12~15)、核苷酸衍生物、藥品和食品等。分子印跡法在分離純化、固相萃取、膜分離、化學傳感器、酶催化及藥物分析等領域有開發和應用，但尚未見有對礦物源泥炭(草炭)活性組分與印跡分子偶聯生物制藥的示例。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術中缺乏礦物源泥炭(草炭)活性組分與印跡分子偶聯生物制藥的方法，而提供了一種從泥炭中制備靶向性前藥的方法以及由此得到的靶向性前藥及其應用。
[0005]本發明提供了一種從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其包括下述步驟:
[0006]( I)制備生物活性組分和印跡分子；
[0007]其中，制備生物活性組分的方法包括:在有氧條件下，將泥炭與橘青霉菌及其 內酰胺酶混合，和/或與放線菌及其乙酰膽堿酶混合，所述泥炭在所述內酰胺酶
和/或所述乙酰膽堿酶的作用下，于5-75°C發生酶解反應和發酵反應，得含有生物活性組分的反應液a，所述酶解反應和發酵反應的時間為5-70小時；所述的放線菌為灰色鏈絲菌(Streptomyces griseus)、金色鏈絲菌(Streptomyces auraofaciens)和刺抱小單抱菌(Micromonospora echinospora)中的一種或多種；
[0008]其中，制備印跡分子的方法包括:在無氧條件下，將泥炭和枝鏈霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，和/或酵母菌及其淀粉酶混合，所述泥炭在所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的作用下，于5-50°C發生酶解反應和發酵反應，得含有印跡分子的反應液b，所述酶解反應和發酵反應的時間為5-50小時；
[0009]制備生物活性組分和制備印跡分子時所使用的泥炭的質量比為(1-5):(2-10)；[0010](2)將反應液a與反應液b混合,使反應液a中的生物活性組分和反應液b中的印跡分子進行偶聯反應，偶聯反應結束后對產物進行提純，即得靶向性前藥。
[0011]步驟(1)中，所述的泥炭較佳地包含纖維素2.1-7.5%、木質素7.5-10.5%、腐植酸35.0-45.5%、灰分20.10-23.81%和水分11.39-15.89%，所述的百分比為各成分相對于干燥無灰基(又稱daf或可燃基)的質量百分比。
[0012]步驟(1)中，所述的泥炭較佳地為礦物源泥炭，更佳地為石屏泥炭。
[0013]步驟(1)中，所述的酶解反應的酶解模型為本領域常規的酶解模型，較佳地按照下
式所示的酶解模型進fi卜S^^ES^^E + P，式中的E代表酶，S代表底物，ES代表中間產物，P代表最終產物。
[0014]步驟(1)中，在制備生物活性組分時，所述橘青霉菌和/或所述放線菌按照本領域常規方法，以含有所述橘青霉菌和/或所述放線菌的培養基的形式加入。所述的培養基較佳地包括紅糖水和胡蘿卜汁；所述的紅糖水與胡蘿卜汁的質量比較佳地為(5-30):(1-5)，所述的紅糖水的質量百分濃度較佳地為5% ;所述的胡蘿卜汁的質量百分濃度較佳地為5%。所述的培養基中，所述橘青霉菌和/或所述放線菌的活菌數較佳地為(1-9) X 107cfu/mL。
[0015]其中，當所述的培養基中同時含有橘青霉菌和放線菌時，所述的橘青霉菌和所述放線菌的活菌數的比例較佳地為(1-6.5):(0.1-3.5);所述的β-內酰胺酶和所述的乙酰膽堿酶的質量比較佳地為(6-15):(1-3)。
[0016]步驟(1)中，在制備生物活性組分和印跡分子時，所述的泥炭較佳地以泥炭懸浮液的形式加入。所述的泥炭懸浮液中泥炭與水的質量比較佳地為(0.05-20):(0.5-5)。所述的泥炭懸浮液中的培養基較佳地包括紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁；所述的紅糖水的質量百分濃度較佳地為5% ;所述的胡蘿卜汁的質量百分濃度較佳地為5% ;紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁的質量比較佳地為(0.05-1.5):0.01:3。
[0017]其中，含有所述橘青霉菌和/或所述放線菌的培養基與所述泥炭懸浮液的質量比較佳地為(0.1:15)- (0.7:1)，更佳地為(0.1:10)- (0.5:1)。
[0018]步驟(1)中，在制備生物活性組分時，所述酶解反應和所述發酵反應的溫度較佳地為25-70°C。在制備生物活性組分時，所述酶解反應和發酵反應的時間較佳地為10-50小時。
[0019]步驟(1)中，在制備生物活性組分時，所述的有氧條件可按照本領域常規方法實現，較佳地為通空氣實現有氧條件。
[0020]步驟(1)中，所述的生物活性組分較佳地為萜類、留類和醌-酚類物質。所述生物活性組分的濃度較佳地為l-100g/L反應液a。
[0021]步驟(1)中，在制備印跡分子時，所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌按照本領域常規方法，以含有所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的培養基的形式加入。所述的培養基中，所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的活菌數較佳地為(1-9) X107cfu/mL。當所述的培養基中同時含有枝鏈霉菌和所述酵母菌時，所述枝鏈霉菌和所述酵母菌的活菌數的比例較佳地為(0.3-2 ):(1-10 )，所述的活菌數的單位為億個/ml。
[0022]本發明中，所述的酵母菌較佳地包括熱帶假絲酵母菌(C.shehatae)、樹干畢赤酵母菌(P.stipitis)和乳克魯維氏酵母菌(Kluveromyces mar xi anus)中的一種或多種。
[0023]其中，含 有所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的培養基與所述泥炭懸浮液的質量比較佳地為(0.1:10)- (0.5:1)，更佳地為(0.1:6)- (0.3:1)。
[0024]步驟(1)中，在制備印跡分子時，所述酶解反應和所述發酵反應的溫度較佳地為10-50°C。在制備印跡分子時，所述酶解反應和發酵反應的時間較佳地為10-30小時。
[0025]步驟(1)中，所述印跡分子較佳地為氨基酸、蛋白質和核苷酸類印跡分子。
[0026]步驟(2)中，所述偶聯反應的條件為本領域常規條件。所述偶聯反應的反應溫度較佳地為30-38°C。所述偶聯反應的時間較佳地為30-90小時。所述偶聯反應較佳地在攪拌條件下進行，所述攪拌的速率為本領域常規，較佳地為60-180r/min。
[0027]步驟(2)中，所述提純為本領域常規操作，較佳地為采用膜分離技術進行提純，更佳地為采用微濾膜、超濾膜或納濾膜進行提純。所述的超濾膜較佳地采用華東理工大學化學工程膜分離研究所提供的聚砜平板膜。所述的納濾膜較佳地采用華東理工大學化學工程膜分離研究所提供的聚砜平板膜，或采用華東理工大學生物工程平臺提供的陶瓷中空膜。所述的微濾膜較佳地采用華東理工大學生物工程平臺提供的陶瓷中空膜。所述的提純的目的是去除酵母菌、放線菌等絲質體以及NaCl等小分子的鹽。
[0028]步驟(2)中，所述提純之前，體系中的主要成分包括泥炭黃腐酸1.2-5%，棕腐酸
0.8-5.0%，黑腐酸3.0-10.0%，灰分21.0-25.0%和水45.0-67.0% ;所述的百分比為質量百分比。
[0029]本發明還提供了一種由上述方法制備得到的靶向性前藥，其包括生物活性組分與印跡分子偶聯的產物；本發明的靶向性前藥的數均分子量一般為200-1000Da，重均分子量一般為 1100-2000Da。
[0030]本發明還提供了所述靶向性前藥在用于制備抑制胃癌、肺癌、抗關節炎或白血病的藥物中的應用。
[0031]本發明還提供了所述靶向性前藥在抗病毒細胞中的應用，其中所述的病毒細胞較佳地為單皰疫病毒細胞。
[0032]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0033]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0034]本發明的積極進步效果在于:
[0035](I)本發明開創性地采用泥炭進行靶向性前藥的制備，通過分子印跡反應制得了能夠抗病毒細胞，或抑制胃癌、肺癌腫瘤、抗關節炎、白血病的靶向性前藥。
[0036](2)本發明的靶向性前藥與阿昔洛韋、5-氟尿嘧啶、環磷酰胺、雷公藤相比，效果相當甚至更佳。
【具體實施方式】
[0037]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0038]下述實施例中，所述的超濾膜采用華東理工大學化學工程膜分離研究所提供的聚砜平板膜。所述的納濾膜采用華東理工大學化學工程膜分離研究所提供的聚砜平板膜，或采用華東理工大學生物工程平臺提供的陶瓷中空膜。所述的微濾膜采用華東理工大學生物工程平臺提供的陶瓷中空膜。[0039]實施例1
[0040]本實施例中使用的石屏泥炭包括下述物質:纖維素7.3%、木質素7.5%、腐植酸45.5%的、灰分23.81%和水分15.89%。所述的百分比為各成分相對于干燥無灰基(又稱daf或可燃基)的質量百分比。
[0041]所述的泥炭以泥炭懸浮液的形式加入。所述的泥炭懸浮液中泥炭與水的質量比為20:0.5。所述的泥炭懸浮液中的培養基包括紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁；所述的紅糖水的質量百分濃度為5% ;所述的胡蘿卜汁的質量百分濃度為5% ;紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁的質量比較佳地為1.5:0.01:3。
[0042](I)制備生物活性組分和印跡分子；
[0043]生物活性組分按下述步驟制備:取石屏泥炭懸浮液100g、柑橘或橙皮中篩選的橘青霉菌及其β -內酰胺酶，以及放線菌(灰色鏈絲菌(Streptomyces griseus))及其乙酰膽堿酶，混合均勻，其中，橘青霉菌及其內酰胺酶、放線菌及其乙酰膽堿酶以培養基的形式加入，該培養基與石屏泥炭懸浮液的質量比為0.1:10，培養基中橘青霉菌和放線菌的活菌數的比例為1:0.1，β-內酰胺酶和乙酰膽堿酶在培養基中的質量比為15:3 ；
[0044]所述泥炭在所述β -內酰胺酶和所述乙酰膽堿酶的作用下，以
五 + S^^KS^^五+ P的酶解模型，在溫度37°C下通空氣進行酶解和發酵反應50hr，
得含有濃度為15.2g/L的生物活性組分的反應液a，所述生物活性組分包括游離的萜類、甾類和醌-酚類物質。
[0045]印跡分子按下述步驟制備:在無氧條件下，取石屏泥炭懸浮液lOOOg，上海亞太釀酒有限公司提供的酵母菌(Hansenisa Pora)及其淀粉酶，枝鏈霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，所述酵母菌(Hansenisa Pora)及其淀粉酶,枝鏈霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶以培養基的形式加入，該培養基與石屏泥炭懸浮液的質量比為0.1:10，在溫度50°C下、經時間30hr發酵，得含有濃度為12.5g/L的印跡分子的反應液b ;所述的酵母菌為熱帶假絲酵母菌(C.shehatae)；
[0046](2)將反應液a與反應液b混合,使反應液a中的生物活性組分和反應液b中的印跡分子進行偶聯反應，其偶聯反應的時間為30h，溫度為30°C，偶聯反應結束后對產物進行提純，即得靶向性前藥；
[0047]步驟(2)中，所述提純之前，體系中的主要成分包括泥炭黃腐酸5%，棕腐酸5%，黑腐酸10%，灰分25%和水45%，百分比為質量百分比。
[0048]經酶聯免疫檢測驗證后，實施例1制得的是用于抑制病毒性DNA活動的泥炭活性組分-氨基酸、泥炭活性組分-核苷酸、泥炭活性組分-醌-酚類等的靶向性前藥，其數均分子量:200~lOOODa，重均分子量1100~2000Da。
[0049]效果實施例1實施例1的毒性實驗(抗肺癌、胃癌)
[0050]取健康小鼠(昆明種小鼠，清潔級，6周齡，18_22g，于清潔級動物實驗室內飼養，由復旦動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK (滬)(2009-0019))，適應性飼養觀察120h，禁食不禁水過夜。次日稱重、編號、分組，給藥組(實施例1得到的靶向性前藥)分為3個劑量組，每組90只小鼠，雌雄各半。以“不等濃度等容積”的原則，即給藥分為高、中、低(濃度分別為lg/kg、0.5g/kg、0.25g/kg) 3個劑量組,分別灌胃給予受試藥物32ml/kg,分別進行藥物急性毒性受試實驗。
[0051 ] 上述實驗過程和測試方法參考了張大方主編的《藥理與中藥藥理實驗》。急性毒性受試實驗的實驗結果表明:本發明的靶向性前藥在治療胃癌時的半數致死量LD50=2.78g/kg小鼠，在治療肺癌時的半數致死量LD50=1.48g/kg小鼠。
[0052]效果實施例2實施例1的藥效實驗(抗肺癌、胃癌)
[0053]經I個療程后的動物實驗，實施例1的靶向性前藥與陽性對照藥5-氟尿嘧啶相t匕，在肺癌的實驗中lg/kg的藥劑量比5-氟尿嘧啶的抑制率提高了 16.09%,同時在提高免疫力、提高小鼠肺血清TNFa (腫瘤壞死因子)的含量方面顯著高于空白及陽性對照藥(見表1)。其中，給藥方案PoX 14是指考察周期為14天。
[0054]表1肺藥對C57小鼠血清TNF α含量的影響
[0055]
【權利要求】
1.一種從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，其包括下述步驟: (1)制備生物活性組分和印跡分子；制備生物活性組分的方法包括:在有氧條件下，將泥炭與橘青霉菌及其β -內酰胺酶混合，和/或與放線菌及其乙酰膽堿酶混合，所述泥炭在所述β -內酰胺酶和/或所述乙酰膽堿酶的作用下，于5-75°C發生酶解反應和發酵反應，得含有生物活性組分的反應 液a，所述酶解反應和發酵反應的時間為5-70小時；所述的放線菌為灰色鏈絲菌(Streptomyces griseus)、金色鏈絲菌(Streptomyces auraofaciens)和刺抱小單抱菌(Micromonospora echinospora)中的一種或多種； 制備印跡分子的方法包括:在無氧條件下，將泥炭和枝鏈霉菌及其聚磷酸酯酶和木聚糖酶，和/或酵母菌及其淀粉酶混合，所述泥炭在所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的作用下，于5-50°C發生酶解反應和發酵反應，得含有印跡分子的反應液b，所述酶解反應和發酵反應的時間為5-50小時； 制備生物活性組分和制備印跡分子時所使用的泥炭的質量比為(1-5):(2-10)； (2)將反應液a與反應液b混合,使反應液a中的生物活性組分和反應液b中的印跡分子進行偶聯反應，偶聯反應結束后對產物進行提純，即得靶向性前藥。
2.如權利要求1所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的泥炭包含纖維素2.1-7.5%、木質素7.5-10.5%、腐植酸35.0-45.5%、灰分20.10-23.81%和水分11.39-15.89%，所述的百分比為各成分相對于干燥無灰基的質量百分比；所述的泥炭為礦物源泥炭，較佳地為石屏泥炭；所述的酶解反應的酶解模型為:E + S ES ￡ + Z5，式中的E代表酶，S代表底物，ES代表中間產物，P代表最終產物。
3.如權利要求1所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，步驟(1)中，在制備生物活性組分時，所述橘青霉菌和/或所述放線菌以含有所述橘青霉菌和/或所述放線菌的培養基的形式加入；所述的培養基較佳地包括紅糖水和胡蘿卜汁；所述的紅糖水與胡蘿卜汁的質量比較佳地為(5-30):(1-5)，所述的紅糖水的質量百分濃度為5% ;所述的胡蘿卜汁的質量百分濃度為5% ;所述的培養基中，所述橘青霉菌和/或所述放線菌的活菌數較佳地為(1-9) X 107cfu/mL ； 當所述的培養基中同時含有橘青霉菌和放線菌時，所述的橘青霉菌和所述的放線菌的活菌數的比例較佳地為(1-6.5): (0.1-3.5);所述的β -內酰胺酶和所述的乙酰膽堿酶的質量比較佳地為(6-15):(1-3)。
4.如權利要求2或3所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，在制備生物活性組分和印跡分子時，所述的泥炭以泥炭懸浮液的形式加入；所述的泥炭懸浮液中泥炭與水的質量比較佳地為(0.05-20):(0.5-5);所述的泥炭懸浮液中的培養基較佳地包括紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁；所述的紅糖水的質量百分濃度較佳地為5% ;所述的胡蘿卜汁的質量百分濃度較佳地為5% ;紅糖水、硫酸鉀和胡蘿卜汁的質量比較佳地為(0.05-1.5):0.01:3 ； 含有所述橘青霉菌和/或所述放線菌的培養基與所述泥炭懸浮液的質量比為(0.1:15)- (0.7:1)，較佳地為(0.1:10) - (0.5:1)； 在制備生物活性組分時，所述酶解反應和所述發酵反應的溫度為25-70°C ;所述酶解反應和發酵反應的時間為10-50小時；所述的有氧條件為通空氣實現有氧條件；所述生物活性組分的濃度為l-100g/L反應液a。
5.如權利要求2或3所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，步驟(1)中，在制備印跡分子時，所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌以含有所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的培養基的形式加入；所述的培養基中，所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的活菌數較佳地為(1-9) X107cfu/mL ;當所述的培養基中同時含有枝鏈霉菌和所述酵母菌時，所述枝鏈霉菌和所述酵母菌的活菌數的比例較佳地為(0.3-2): (1-10)，所述的活菌數的單位為億個/ml ； 所述的酵母菌包括熱帶假絲酵母菌(C.shehatae)、樹干畢赤酵母菌(P.stipitis)和乳克魯維氏酵母菌(Kluveromyces marxianus)中的一種或多種； 含有所述枝鏈霉菌和/或所述酵母菌的培養基與所述泥炭懸浮液的質量比為(0.1:10)- (0.5:1)，較佳地為(0.1:6)_ (0.3:1)； 在制備印跡分子時，所述酶解反應和所述發酵反應的溫度為10-50°C ;所述酶解反應和發酵反應的時間為10-30小時。
6.如權利要求1所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述偶聯反應的反應溫度為30-38°C;所述偶聯反應的時間為30-90小時；所述偶聯反應在攪拌條件下進行；所述攪拌的速率為60-180r/min。
7.如權利要求1所述的從泥炭中制備靶向性前藥的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的提純為采用膜分離技術進行提純，較佳地為采用微濾膜、超濾膜或納濾膜進行提純；所述的微濾膜較佳地為陶瓷中空膜；所述的超濾膜較佳地為聚砜平板膜；所述的納濾膜較佳地為聚砜平板膜或陶瓷中空膜。
8.一種由權利要求1-7任一項所述的方法制備得到的靶向性前藥。
9.如權利要求8所述的靶向性前藥在用于制備抑制胃癌、肺癌、抗關節炎、白血病或抗病毒細胞的藥物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的病毒細胞為單皰疹病毒細胞。
【文檔編號】A61K47/48GK103690970SQ201310738174
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】呂偉東, 楊俊佳, 劉強, 周霞萍 申請人:云南聯合藥業有限責任公司, 華東理工大學