石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞mfc細胞增殖藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用及石椒草咳喘片的制備方法。本發明的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。
【專利說明】石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用及石椒草咳喘片的制備方法。
【背景技術】
[0002]石椒草咳喘顆粒標準號WS-10449 (ZD-0449) -2002，記載于國家中成藥標準匯編內科脾胃分冊。由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，具有清熱化痰、止咳平喘的功效。用于肺熱引起的咳嗽痰稠、口干咽癢，以及急慢性支氣管炎引起的痰濕咳喘。 [0003]現有技術中，尚未有石椒草咳喘顆粒在在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用的報道，也未見有石椒草咳喘顆粒提取制備方面采用超臨界和微波技術的報道，而揮發油提取，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發明內容】
[0004]發明目的:本發明的目的在于提供一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用。
[0005]本發明的另一個目的在于提供一種石椒草咳喘片的制備方法。
[0006]本發明的目的是通過如下的方案實現的:
[0007]石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時間180_220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0008]優選的，上述的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力
15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0009]現有技術中，石椒草咳喘顆粒每次8_16g，一日3-4次。石椒草咳喘顆粒服藥量大，且顆粒劑制備需要加大量的糖，糖尿病患者不適宜，不加糖的話味道不佳，患者不容易服下，依從性差。采用本發明方法制備成的石椒草咳喘片每片重0.5g，每次僅需2-4片，一日服用3-4次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0010]試驗一、不同方法制備的石椒草咳喘片中橙皮苷含量的比較
[0011]1、儀器及試藥本發明石椒草咳喘片:按實施例1方法制備，使用3007g原料藥，經提取制成250片，每片重0.5g。原石椒草咳喘顆粒，按照WS-10449 (ZD-0449)-2002標準方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0014]色譜條件與系統 適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(24: 76)為流動相，檢測波長為283nm。理論板數按橙皮苷峰計算應不低于4000。
[0015]對照品溶液的制備取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml含60yg的溶液，即得。
[0016]供試品溶液的制備取本發明的石椒草咳喘片，研細，取0.25g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，取續濾液，即得。
[0017]對照產品供試品溶液的制備取本對照的石椒草咳喘顆粒，研細，取4g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，濾過，取續濾液，即得。
[0018]供試品溶液的制備取本品裝量差異項下的內容物，研細，混勻，測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得
[0019]3、結果
[0020]結果表明，本發明石椒草咳喘片中橙皮苷的含量為15_30mg/片；而原石椒草咳喘顆粒中橙皮苷的含量為3.2mg/袋，每次服用量2片的橙皮苷含量為原顆粒劑含量的5-10倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本發明制備方法制備的石椒草咳喘片，有效成分含量遠遠高于WS-10449 (ZD-0449) -2002標準記載的方法制備的石椒草咳喘顆粒。
【具體實施方式】[0022]下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0023]實施例1
[0024]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度401:，0)2流量2ml/g生藥.π?η，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0025]經檢測，成品中橙皮苷的含量為59.6mg/片。
[0026]實施例2
[0027]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎， 加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0028]經檢測，成品中橙皮苷的含量為32.9mg/片。
[0029]實施例3
[0030]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.π?η，萃取時間220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0031]經檢測，成品中橙皮苷的含量為44.7mg/片。
[0032]實施例4:石椒草咳喘片抑制小鼠胃癌細胞MFC細胞增殖的實驗研究資料
[0033]1.實驗材料
[0034]1.1實驗用細胞株[0035]小鼠胃癌細胞MFC細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規培養。
[0036]1.2實驗藥物
[0037]研究藥物:本發明石椒草咳喘片:按實施例1方法制備。
[0038]藥液儲液:稱取IOOmg石椒草咳喘片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0039]1.3實驗試劑
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經貿有限公司)；MTT (Biosharp 批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0041]1.4實驗器材
[0042]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);lcm 培養皿(NEST 公司)、96孔培養板(NEST公司)；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.實驗方法`
[0044]I) MFC細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規培養(IOcm培養皿)，當細胞生長至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中，1000rpm離心5min，調整細胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0045]2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液180 μ 1，培養板放入細胞培養箱中(37°C，5%C02)常規培養。
[0046]3)根據細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入石椒草咳喘片溶液，繼續培養24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續培養 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0049]6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0050]7)結果以藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0051]3.統計處理
[0052]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關分析和Student t檢驗，數據以mean+ S.D.表不。
[0053]4.實驗結果[0054]MTT法實驗后統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對MFC細胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0055]表1石椒草咳喘片對MFC細胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0056]
【權利要求】
1.石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，其特征在于，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C(V流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時間180_220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
2.根據權利要求1所述的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細胞MFC細胞增殖藥物中的應用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，其特征在于，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚腥草，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DiaionHP-1O大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述 超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
【文檔編號】A61P11/14GK103751661SQ201310670788
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】孫波 申請人:濟南新起點醫藥科技有限公司