一種靶向hif低毒性的磁性納米棒的制備方法
【專利摘要】本發明一種靶向HIF低毒性的磁性納米棒的制備方法，屬于靶向腫瘤細胞治療磁性納米。在氨基功能化磁性納米離子(Fe3O4)表面修飾了溴化4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯（ILs)獲得帶正電荷的磁性納米離子(Fe3O4-ILs)，接著這種納米離子通過靜電吸附結合HIF的識別序列，該磁性納米顆粒大小為8nm。細胞毒性實驗顯示該納米棒是一種低毒性的納米材料。磁共振成像實驗顯示納米棒能顯著區別腫瘤肝細胞與正常肝細胞，我們的發明為構建新型系列核酸誘導的靶向性磁性納米載體奠定了基礎。
【專利說明】一種靶向HIF低毒性的磁性納米棒的制備方
法
【技術領域】
[0001]本發明屬于祀向腫瘤細胞治療磁性納米材料制備領域,特指一種納米Fe3O4表面改性的修飾、組裝的方法及其在靶向腫瘤細胞磁性成像中的運用。
【背景技術】[0002]四氧化三鐵磁性顆粒廣泛應用于生物醫藥和生物技術行業，例如，作為藥物載體、MR成像劑、蛋白純化劑、吸附劑和生物傳感器。表面修飾磁性納米顆粒可以通過外部磁場將其集中到特定位置，激活藥物靶向性，用于可控腫瘤特異性納米傳輸載體。納米顆粒藥物傳輸體、診斷劑必須具有對靶點的特異性結合作用，可以區分正常細胞和疾病細胞，有效避免治療的系統毒性。
[0003]缺氧誘導因子(HIFs)是缺氧條件下觸發線粒體從氧化磷酸化向厭氧糖酵解轉換的開關，在實現能量代謝適應性調節的過程中起關鍵性作用。厭氧的糖酵解過程是它通過增加編碼糖酵解酶和糖轉運體基因的表達激活的。HIFs是細胞氧代謝、細胞惡性繁殖和癌細胞代謝變化之間普遍鏈接(G.L.Semenza, Hypoxia-1nducible Factors: Mediatorsof Cancer Progression and Targets for Cancer Therapy.Trends Pharmacol.Science2012，33，207 - 214; N.God, M.Kanai，Hypoxia-1nducible Factors and their Rolesin Energy Metabolism.1nt J Hematol，2012，95，457 - 463.)。作為一個轉錄激活因子，HIF與編碼酶基因中的缺氧反應原件(HRE)的結合是在胞內O2濃度降低時細胞正常代謝的關鍵。Semenza 等人(G.L Semenza, ; G.L Wang, A Nuclear Factor Inducedby Hypoxia via De Novo Protein Synthesis Binds to the Human ErythropoietinGene Enhancer at a Site Required for Transcriptional Activation.Mol.Cell.Biol.1992，12，5447 - 5454.)發現，在人血紅蛋白(EPO)基因中HIF的結合位點為5’ -TACGTGCT-3，序列，還推測這種結合主要是兩個鳥嘌呤的殘基嵌入到HIF的大溝中，并且這個推測被Forsythe 等證實(J.A.Forsythe, B.H.Jiang, N.V.1yer, F.Agani，S.W.Leung, R.D.Koosj G.L Semenza, Activation of Vascular EndothelialGrowth Factor Gene Transcription by Hypoxia-1nducible Factorl.Mol cell.biol.1996，16，4604 - 4613.)。隨后，在許多不同代謝相關酶基因的HRE中鑒定出作為HIF的識別位點5’ -RCGTG-3’序列，這些酶包括編碼轉鐵蛋白、血管生長因子(VEGF)和糖酵解酶縮醛酶A、乳酸脫氫酶A、乳酸轉運體、烯醇酶1、磷酸果糖激酶L、磷酸甘油酸激酶I等(G.L Semenza, B.H.Jiang, S.W.Leung, R.Passantino，J.-P.Concordeti，P.Mairei， A.Giallongo， Hypoxia Response Elements in the Aldolase A， Enolase 1，and Lactate Dehydrogenase A Gene Promoters Contain Essential Binding Sites forHypoxia-1nducible Factor 1.Biochem.Mol.Biol.1nt.1996，32529 - 32537; M.S.Ullah， A.J.Davies, A.P.Halestrap， The Plasma Membrane Lactate TransporterMCT4，but Not MCTlj Is Up-regulated by Hypoxia through a HIF-1 a -dependentMechanism.J.Bi0.Chem.2006, 281，9030 - 9037.)因此，HIF 在大多數癌細胞中高表達。高表達的HIF是一項正常細胞與癌細胞不同的指標，可以作為靶向癌細胞的靶點。我們將磁性納米顆粒經過表面修飾制備了一種可附載HIF靶向核酸適配體的新型磁性納米棒，該納米棒能借助磁共振成像技術識別腫瘤細胞，可望運用與腫瘤診斷和靶向藥物輸送體。
[0004]
【發明內容】
[0005]本發明設計了一種表面修飾靶向細胞缺氧誘導因子(HIF)核酸序列的新型Fe3O4納米磁性棒^ESFe3O4-1Ls-DNAX其特點為在氨基功能化磁性納米離子(Fe3O4)表面修飾了溴化4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯(ILs)獲得帶正電荷的磁性納米離子(Fe3O4-1Ls),接著這種納米離子通過靜電吸附結合HIF的識別序列(DNA1:5’ CTACGTGCT3)或DNAl的互補序列(DNA2:5’ -AGCACGTAG-3’ )形成納米立方體 Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)，該磁性納米顆粒大小為8 nm。將Fe3O4-1Ls-DNAl和Fe304-1Ls_DNA2混合組裝形成新型Fe3O4納米磁性棒(標記為Fe3O4-1Ls-DNAX該納米棒為40~50 nm,寬為8 nm的棒狀結構。磁共振成像實驗表明該納米離子能選擇性識別腫瘤細胞；細胞毒性試驗表明磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)和 Fe3O4-1Ls-DNAl 和 Fe304-1Ls_DNA2 對 H印G-2 細胞的毒性很小，適用于做癌細胞靶向HIF治療的藥物載體。這是國際上第一個靶向HIF的磁性藥物載體。
[0006]一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，按照下述步驟進行:
(I)Fe3O4 表面修飾制備(Fe3O4-1Ls)
將氨基功能化磁性納米離子Fe3O4和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按質量比為18: f 18:3(最佳比為18:2)混合溶解于二甲基二乙酰胺(DMF)后轉入三口燒瓶中，加入乙醇(按與混合液體積比為4:3-4:10,最佳為4:6),攪拌6~20 h (最佳12 h后),轉入60°C水浴中回流2-6 h (最佳6h)。分別加入與反應液體積比為1: f 4:1的丙酮(最佳為2:1)促降，離心分離，得到溶解性好的Fe304-1Ls。
[0007](2) Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制備
1)配制2mg/mL Fe3O4-1Ls磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，分散均勻
2)按與Fe3O4-1Ls質量比為1:500~4:500(最佳為500:2)，向其中滴加DNAl(或DNA2)(100 uM) PBS溶液，攪拌均勻。
[0008]3)將混合溶液置于搖床室溫搖動1~4 h,最佳2 ho
[0009]4)離心分離得黑色納米顆粒 Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)。
[0010](3)磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制備
將制備好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L_DNA2以質量比(1:2~2: 1，最佳比例1:1)混合均勻，于水浴中加熱到廣60°C (最佳30 °C)，穩定廣6 min (最佳3min)，緩慢冷卻到室溫(T3 h,最佳3h)，離心分離得磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)15樣品放于冰箱中4°C儲存。
[0011]其中所述的DNAl的序列為5’ -CTACGTGCT-3’。
[0012]其中所述的DNA2的序列為5 ’ -AGCACGTAG-3 ’。
[0013]本發明利用HIF與特定核酸序列的特異結合，將這種結合作為癌細胞中的靶點，來實現靶向性磁性材料的構建，是一種簡便，直觀的構建方法。磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)是國際上第一個具有HIF靶向性磁性納米載體。TEM成像顯示該納米棒為4(T50 nm，寬為8 nm的棒狀結構(附圖1)。細胞毒性實驗(實施例10)顯示該納米棒是一種低毒性的納米材料(圖2)。磁共振成像實驗顯示納米棒能顯著區別腫瘤肝細胞與正常肝細胞(圖3，實施例11)，我們的發明為構建新型系列核酸誘導的靶向性磁性納米載體奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為組裝后的磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的透射電鏡圖；
圖2磁性棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的細胞毒性實驗結果，納米顆粒的濃度分別為20mg/ml，40mg/ml, 60 mg/ml。
[0015]圖3為磁性納米棒-錳基造影劑復合納米粒子(10 ug/ml)對正常肝細胞WRL-68(a, 0 min; b, 10 min; c; 30; d, 60 min)和腫瘤肝細胞 HepG-2 細胞(a, 0 min; b,10 min; c; 30; d, 60 min)的 Tl 磁共振成像。
[0016]【具體實施方式】:
試劑和原料:氨基功能化磁性納米顆粒根據文獻方法合成和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯(ILs)根據文獻方法合成(Qiu-Yun Chen, Zh1-ffei Wang, Xia Yang, Li Wang,Indole conjugated silica and magnetic nanoparticles as inhibitors of HIF.Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 114 (2014) 158 - 163.),溶劑為分析純試劑。DNAl和DNA2核酸序列由我們自己設計，DNAl和DNA2委托上海生物生工公司根據我們提供的核酸序列合成。其中所述的DNAl的序列為5’ CTACGTGCT3。其中所述的DNA2的序列為 5’ -AGCACGTAG-3’。
[0017]一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，按照下述步驟進行:
實施例1.Fe3O4表面修飾制備(Fe3O4-1Ls)的最佳實施方案
稱取氨基功能化磁性納米離子(Fe3O4) 70.2 mg與4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(4mL 0.089M)混合溶解后轉入三口燒瓶中，加入6 mL乙醇，攪拌12 h后，轉入60°C水浴中回流6 ho分別加入20 mL丙酮促降，離心分離，得到Fe3O4-1ls 93 mg。
[0018]實施例2.Fe3O4表面修飾制備(Fe3O4-1Ls)
稱取氨基功能化磁性納米離子(Fe3O4) 70.2 mg與4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(2 mL 0.045M)混合溶解后轉入三口燒瓶中，加入3 mL乙醇，攪拌6 h后，轉入60°C水浴中回流2 ho分別加入IOmL丙酮促降，離心分離，Fe3O4-1Ls, 45 mg。
[0019]實施例3.Fe3O4表面修飾制備(Fe3O4-1Ls)
稱取氨基功能化磁性納米離子(Fe3O4) 70.2 mg與4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(6 mL 0.13M)混合溶解后轉入三口燒瓶中，加入10 mL乙醇，攪拌20 h后，轉入60°C水浴中回流2 ho分別加入40 mL丙酮促降，離心分離，得Fe3O4-1ls 67 mg。
[0020]實施例4.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制備(最佳實施方案)
稱取10 mg Fe3O4-1Ls分散于5 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加160 uLDNAl (或DNA2) (100 uM)PBS溶液。將混合溶液于搖床室溫搖動2 h。
[0021]離心分離得黑色納米顆粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 9 mg。
[0022]實施例5.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制備
稱取IOmgFe3O4-1Ls分散于5mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加320 uLDNAl (或DNA2) (200 uM) PBS溶液。將混合溶液于搖床室溫搖動4h。[0023]離心分離得黑色納米顆粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 6mg。
[0024]實施例6.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制備
稱取IOmgFe3O4-1Ls分散于5 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加80 uLDNAl (或DNA2) (50 uM) PBS溶液。將混合溶液于搖床室溫搖動lh。
[0025]離心分離得黑色納米顆粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 4 mg。
[0026]實施例7磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制備(最佳實施方案)
將10 mg Fe3O4-1L-DNAl和10 mg Fe304-1L_DNA2混合均勻，于水浴中加熱到30°C，穩定
3min,緩慢冷卻到室溫(2 h)，離心分離得磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，18 mg。
[0027]實施例8磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制備
將10 mg Fe3O4-1L-DNAl和5 mg Fe304-1L_DNA2混合均勻，于水浴中加熱到60°C，穩定I min,緩慢冷卻到室溫(3 h)，離心分離得磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，9 mg。
[0028]實施例9磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制備
將IOmg Fe3O4-1L-DNAl和15 mg Fe304-1L_DNA2混合均勻，于水浴中加熱到10°C，穩定6 min,緩慢冷卻到室溫(I h)，離心分離得磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，12 mg。
[0029]實施例10細胞毒性實驗
以實施例7得到的磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)為受試化合物將H印G-2細胞在含10%熱滅活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養液中，于CO2培養箱(37 °C，5%C02、飽和濕度)內連續培養。取對數生長期細胞，消化、計數，以2X104/ml的密度接種于96孔培養板中，每孔100 ill。培養24 h后，分別用濃度為20 ug/ml, 40 u g/ml,和60 U g/ml的(Fe3O4-1Ls-DNA)水溶液加入培養基中作用24h。吸取去上清液，每孔加入100 mM MTT (lmg/ml),繼續培養4h，吸取上清液，用酶標儀在570 nm處測定吸光度值，數據見附圖2。數據顯示我們制備的(Fe3O4-1Ls-DNA)具有低毒性。
[0030]實施例11:磁共振成像檢測腫瘤靶向實驗
將WRL-68細胞和IfepG2細胞在含10%熱滅活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養液中，于CO2培養箱(37 °C, 5%C02、飽和濕度)內連續培養。取對數生長期的WRL-68細胞和IfepG2細胞，消化、計數，以2X104/ml的密度接種到96孔培養板中，每孔100 yl。培養24 h后，分別用不同濃度的實施例1得到的磁性納米棒為受試化合物處理腫瘤細胞。為得到清晰的Tl圖像，每克磁性納米棒負載IOOmg錳基造影劑(二吡啶甲醇氯化錳即MnDPDP)(負載量為100 mg/g磁性納米棒)。連續培養4 h后，于室溫在匪120磁共振成像儀(0.53 T)上進行Tl加權成像測試，見圖3。設置參數為重復采樣次數(NS)為8，反轉恢復序列循環采樣次數(TlIRCount)為300，每次增加的步長(AddDl)為2000，90。脈寬(P90)為4.5，180°脈寬(P180)為9。
[0031]圖3數據顯示磁性納米棒顯著增強腫瘤細胞的磁共振成像清晰度，而正常細胞中含量較低。目前臨床運用的錳基磁共振成像劑二吡啶甲醇氯化錳不穩定且沒有腫瘤靶向性。本發明磁性納米棒能提高負載的錳基造影劑的靶向性，納米棒負載錳基造影劑后顯著區別腫瘤細胞和正常細胞，所以磁性納米棒可作為新型低毒性多功能腫瘤靶向型藥物輸送體。
【權利要求】
1.一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)Fe3O4表面修飾制備Fe3O4-1Ls 將氨基功能化磁性納米離子Fe3O4和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按質量比為18: f 18:3混合溶解于二甲基二乙酰胺后轉入三口燒瓶中，按與混合液體積比為4:3-4:10加入乙醇，攪拌6~20 h，轉入60°C水浴中回流2-6 h ；分別加入與反應液體積比為1: f 4:1的丙酮促降，離心分離，得到溶解性好的Fe3O4-1Ls ；
(2)Fe3O4-1Ls-DNAl 或 Fe304-1Ls_DNA2 的制備: 1)配制2mg/mL Fe3O4-1Ls磷酸鹽緩沖溶液(10 mM, pH=7.4)中，分散均勻 2)按與Fe3O4-1Ls 質量比為 1:500~4:500，向其中滴加 DNAl (或 DNA2) (100 uM) PBS溶液，攪拌均勻； 3)將混合溶液置于搖床室溫搖動f4 h， 4)離心分離得黑色納米顆粒Fe3O4-1Ls-DNAl或Fe304-1Ls_DNA2； (3)磁性納米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制備: 將制備好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L_DNA2以質量比1:2~2: 1，混合均勻，于水浴中加熱到廣60°C，穩定廣6 min緩慢冷卻到室溫廣3 h，離心分離得磁性納米棒Fe3O4-1Ls-DNA,樣品放于冰箱中4 C儲存。
2.根據權利要求1所述的一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，其特征在于其中所述的DNAl的序列為CTACGTGCT。
3.根據權利要求1所述的一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，其特征在于其中所述的DNA2的序列為AGCACGTAG。
4.根據權利要求1所述的一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，其特征在于步驟⑴中4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按質量比為18:2，乙醇與混合液體積比為4:6，攪拌12 h，轉入60°C水浴中回流6 h，分別加入與反應液體積比為2:1的丙酮。
5.根據權利要求1所述的一種靶向HIF低毒性的磁性載體的制備方法，其特征在于步驟⑵磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mM, pH=7.4，按與Fe3O4-1Ls質量比為500:2向其中滴加DNAl或DNA2，將混合溶液置于搖床室溫搖動2 h，步驟(3)制備好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L-DNA2的質量比為1:1混合均勻，于水浴中加熱到30°C，穩定3 min, 3h緩慢冷卻到室溫。
【文檔編號】A61K49/08GK103638533SQ201310670483
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】陳秋云, 趙婷婷 申請人:江蘇大學