一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞mltc-1細(xì)胞增殖藥物中 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、梔子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，采用超微粉碎、超臨界萃取、微波萃取和大孔樹(shù)脂吸附制備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本發(fā)明還提供了膽石通利片在制備抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞
瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膽石通利膠囊標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10324 (ZD-0324) -2002，記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肝膽分冊(cè)。由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成,具有清熱利膽，化瘀排石的功效。用于肝膽濕熱所致的急、慢性膽囊炎，膽結(jié)石等。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有膽石通利膠囊在提取制備方面采用超微粉碎、CO2超臨界萃取、微波技術(shù)和大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道，而中藥直接打粉取、水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種膽石通利片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種膽石通利片在制備抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃岑45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白帆超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間180-220min,得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘洛與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥,壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0010]上述的膽 石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0011]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.min。[0012]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
[0013]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0014]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0015]上述的膽石通利片在制備抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0016]現(xiàn)有技術(shù)中，膽石通利膠囊口服，一次5粒，一日3次。膽石通利膠囊服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的膽石通利片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。 [0017]試驗(yàn)一、不同方法制備的膽石通利片中橙皮苷含量的比較
[0018]1、儀器及試藥本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備，使用IOSOg原料藥，經(jīng)提取制成500片，每片重0.3g。原膽石通利膠囊，按照WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備，作為對(duì)照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
[0019]2、方法
[0020]照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VD)測(cè)定。
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇一水(40: 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm;理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
[0022]對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含38μ g的溶液，即得。
[0023]本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的膽石通利片,研細(xì)，取0.06g，，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0024]對(duì)照品供試品溶液的制備取本對(duì)照的膽石通利膠囊，混勻，研細(xì)，取0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，并用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0025]測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0026]3、結(jié)果
[0027]結(jié)果表明，本發(fā)明膽石通利片中橙皮苷的含量為6-10mg/片；而原膽石通利膠囊中橙皮苷的含量為1.45mg/粒，每片橙皮苷含量相當(dāng)于原膠囊劑含量的4-6倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0028]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的膽石通利片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10324 (ZD-0324) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的膽石通利膠囊。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0030]實(shí)施例1[0031]取金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0032]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為9.86mg/片。
[0033]實(shí)施例2
[0034]取金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0035]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為6.42mg/片。
[0036]實(shí)施例3
[0037]取金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時(shí)間220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0038]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為8.26mg/片。
[0039]實(shí)施例4:膽石通利片抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0040]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0041]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株[0042]小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常
規(guī)培養(yǎng)。
[0043]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0044]研究藥物:本發(fā)明膽石通利片:按實(shí)施例1方法制備。
[0045]藥液儲(chǔ)液:稱取IOOmg膽石通利片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0046]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0047]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100-061 Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810-033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESCO 公司)；EDTA (AMRESCO 公司)！Penicillin G SodiumSalt (AMRESCO公司I );Streptomycin Sulfate (AMRESCO);無(wú)水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp批號(hào):0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0048]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0049]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORM型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào):SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào) :ΚΑ-1000) ;0.2μπι濾器(MILLIP0RE型號(hào):SLGP033RB) ; Icm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0050]2.實(shí)驗(yàn)方法
[0051 ] I) MLTC-1 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個(gè)/ml。
[0052]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0053]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入膽石通利片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0054]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0055]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0056]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0057]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0058]3.統(tǒng)計(jì)處理
[0059]采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean + S.D.表不。[0060]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0061]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)MLTC-1細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0062]表1膽石通利片對(duì)MLTC-1細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
【權(quán)利要求】
1.一種膽石通利片的制備方法，由金錢(qián)草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒(méi)藥35g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細(xì)粉備用；取乳香、沒(méi)藥，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_501:，0)2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180_220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒(méi)藥殘?jiān)c其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的 膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為200min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
9.權(quán)利要求1所述的膽石通利片在制備抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞MLTC-1細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K33/04GK103768509SQ201310669930
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫波 申請(qǐng)人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司