一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制肥大細胞瘤細胞p815細胞增殖藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及應用。本發(fā)明的膽石通利片的制備方法，由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、梔子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成，采用超微粉碎、超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。本發(fā)明還提供了膽石通利片在制備抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種膽石通利片的制備方法及其在制備抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]膽石通利膠囊標準號WS-10324 (ZD-0324) -2002，記載于國家中成藥標準匯編內科肝膽分冊。由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成,具有清熱利膽，化瘀排石的功效。用于肝膽濕熱所致的急、慢性膽囊炎，膽結石等。
[0003]現(xiàn)有技術中，尚未有膽石通利膠囊在提取制備方面采用超微粉碎、CO2超臨界萃取、微波技術和大孔樹脂吸附技術提取的報道，而中藥直接打粉取、水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發(fā)明內容】
[0004]為了解決上述的技術問題，本發(fā)明提供了一種膽石通利片的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種膽石通利片在制備抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應用。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0007]—種膽石通利片的制`備方法，由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃岑45g、乳香35g、芒硝80g、白帆35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白帆超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min,萃取時間180-220min,得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒藥殘洛與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W,萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥,壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0008]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0009]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0010]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0011]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生藥.min。[0012]上述的膽石通利片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
[0013]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0014]上述的膽石通利片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
[0015]上述的膽石通利片在制備抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應
用。
[0016]現(xiàn)有技術中，膽石通利膠囊口服，一次5粒，一日3次。膽石通利膠囊服藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的膽石通利片每片重0.3g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
[0017]試驗一、不同方法制備的膽石通利片中橙皮苷含量的比較
[0018]1、儀器及試藥本發(fā)明膽石通利片:按實施例1方法制備，使用IOSOg原料藥，經提取制成500片，每片重0.3g。原膽石通利膠囊，按照WS-10324 (ZD-0324) -2002標準方法制備，作為對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
[0019]2、方法
[0020]照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄V D)測定。
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇一水(40: 60)為流動相；檢測波長為284nm;理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于3000。
[0022]對照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成每Iml含38μ g的溶液，即得。
[0023]本發(fā)明產品供試品溶液的制備取本發(fā)明的膽石通利片，研細，取0.06g,，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，并用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0024]對照品供試品溶液的制備取本對照的膽石通利膠囊，混勻，研細，取0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，密塞，超聲處理(功率250w，頻率30kHz)40分鐘，放冷，稱定重量，并用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0025]測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0026]3、結果
[0027]結果表明，本發(fā)明膽石通利片中橙皮苷的含量為6-10mg/片；而原膽石通利膠囊中橙皮苷的含量為1.45mg/粒，每片橙皮苷含量相當于原膠囊劑含量的4-6倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0028]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的膽石通利片，有效成分含量遠遠高于WS-10324 (ZD-0324) -2002標準記載的方法制備的膽石通利膠囊。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發(fā)明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
[0030]實施例1[0031]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0032]經檢測，成品中橙皮苷的含量為9.86mg/片。
[0033]實施例2
[0034]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0035]經檢測，成品中橙`皮苷的含量為6.42mg/片。
[0036]實施例3
[0037]取金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g:將芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.min，萃取時間220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
[0038]經檢測，成品中橙皮苷的含量為8.26mg/片。
[0039]實施例4:膽石通利片抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖的實驗研究資料
[0040]1.實驗材料
[0041]1.1實驗用細胞株
[0042]小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。[0043]1.2實驗藥物
[0044]研究藥物:本發(fā)明膽石通利片:按實施例1方法制備。
[0045]藥液儲液:稱取IOOmg膽石通利片，溶于5ml無水乙醇中，0.2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0.2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0046]1.3實驗試劑
[0047]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇(溜博亞杜蘭經貿有限公司)；MTT (Biosharp 批號:0793) =PBS (實驗室自配)；
[0048]1.4實驗器材
[0049]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號:SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號:DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:ΚΑ-1000);0.2μπι 濾器(MILLIP0RE 型號:SLGP033RB);Icm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0050]2.實驗方法
[0051 ] I) P815細胞用DMEM +10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中，1000rpm離心5min，調整細胞懸液濃度3X IO4個/ml。
[0052]2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0053]3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入膽石通利片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0054]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0055]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0056]6)同時設置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0057]7)結果以藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(%)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)、對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0058]3.統(tǒng)計處理
[0059]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0060]4.實驗結果
[0061]MTT法實驗后統(tǒng)計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對P815細胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0062]表1膽石通利片對P815細胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0063]
【權利要求】
1.一種膽石通利片的制備方法，由金錢草225g、茵陳225g、郁金90g、陳皮150g、黃芩45g、乳香35g、芒硝80g、白礬35g、大黃45g、三棱45g、桅子45g、甘草25g、沒藥35g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成:芒硝、白礬超微粉碎成粒度范圍5-45 μ m的細粉備用；取乳香、沒藥，粉碎成細粉，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_501:，0)2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時間180_220min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的乳香、沒藥殘渣與其他九味藥材，粉碎，加入3.6L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹脂柱上，70%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超微粉碎后的芒硝、白礬、超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.3g。
2.根據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
4.根據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中CO2 流量 2ml/g 生藥.min。
6.據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為200min。
7.根據(jù)權利要求1所`述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為700W。
8.根據(jù)權利要求1所述的膽石通利片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃取時間為8分鐘。
9.權利要求1所述的膽石通利片在制備抑制小鼠肥大細胞瘤細胞P815細胞增殖藥物中的應用。
【文檔編號】A61K36/9066GK103768508SQ201310669700
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫波 申請人:濟南新起點醫(yī)藥科技有限公司