中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法及應用的制作方法
【專利摘要】一種中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法，該方法以乙酸乙酯、正丁醇和0.5%乙酸水溶液按體積比3:1.5:5組成高速逆流溶劑體系，對中藥百合提取物進行高速逆流色譜分離，制備得到中藥百合中3個酚酸甘油酯苷化合物，同時對該些化合物的生物活性進行研究，該3個化合物對DPPH自由基具有一定的清除作用，對脂質過氧化有一定的抑制作用，并對α-淀粉酶活性均具有一定的促進作用。
【專利說明】中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的分離方法，具體涉及一種以高速逆流色譜法從中藥百合中分離制備酚酸甘油酯苷化合物的方法。
【背景技術】
[0002]百合(LiIiaceae)是多年生草本植物，全世界約有百合90多種，我國約有46種18個變種，其中卷丹(Lilium lancifolium Thunb)、百合(Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker)或細葉百合(L.pumilum DC.)的干燥肉質鱗莖是我國藥典中記載的藥用品種，也是民間廣泛藥食同源植物，具有養陰清肺、清心安神之功。現有技術中一般通過硅膠反復柱層析、凝膠色譜及制備薄層色譜等多種聯用技術從不同品種百合植物中分離出酚酸甘油酯苷、酚酸甘油酯、留體皂苷、生物堿、甘油苷、黃酮等多種化學成分。但我國三個藥用品種中的化學成分及其生物活性鮮有報導。
[0003]高速逆流色譜(HSCCC)是近年來發展的一種廣泛用于天然產物分離制備的液-液分配色譜技術，具有操作簡便、重現性好、制備量大的特點，廣泛用于天然活性物質的制備。但以該高速逆流色譜法從中藥百合分離制備酚酸甘油酯苷化合物的方法未見報導。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是:針對上述現有技術的不足，提供一種中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法及應用。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:一種中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法，該方法步驟如下:
[0006]a.制備百合提取物:取百合粉，加入為5-10倍質量的質量濃度為40-60%的乙醇于50-7(TC水浴浸提3次，每次0.5-lh,合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味；將該提取液以l_3BV/h流速通過裝有DlOl大孔吸附樹脂的層析柱，吸附后靜置0.5-lh，用蒸餾水以2-4BV/h流速淋洗除去雜質，再用70%質量濃度的乙醇以2-4BV/h流速洗至洗脫液無顏色，將乙醇洗脫液減壓濃縮后冷凍干燥，即得百合提取物；
[0007]b.高速逆流色譜法分離:將乙酸乙酯、正丁醇和0.5%乙酸水溶液按體積比3:1.5:5組成高速逆流溶劑體系，充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，上相為固定相，下相為流動相，超聲脫氣10-20min ;將制得的百合提取物按每200mg-250mg加10_20mL下相的比例用下相溶解作為樣品溶液，將上相溶劑以20mL/min的流速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿后，在800-900rpm/min的轉速下將剩余下相以1.5-2mL/min的流速注入，檢測波長為280nm，平衡后將樣品溶液進樣，SO-1OOmin后進行圖譜采集(根據流速不同采集時間有所不同)，根據峰形手動分段收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮后冷凍干燥，得粉末狀化合物regaloside A、化合物Acetylregaloside C及化合物regaloside B。
[0008]上述百合粉是取新鮮中藥百合于50_60°C烘箱中干燥至含水量為7-9%，粉碎至粒徑為10-20目。該中藥百合是指百合中的卷丹(Lilium lancifolium Thunb)、百合(Liliumbrown ii F.E.Brown var.viridulum Baker)和細葉百合(L.pumilum DC.)三個藥用品種中的百合(Lilium brown ii F.E.Brown var.viridulum Baker)。
[0009]本發明利用HSCCC技術從中藥百合中制備分離得到3個化合物，該方法簡便、高效，適宜化合物的大量制備；同時，對該3種化合物的抗氧化性及對淀粉酶活性的影響進行了研究，Regaloside A與Regaloside B對脂質過氧化具有一定的抑制作用；Acetylregaloside C對二者的作用均較強，且三種化合物對α -淀粉酶活性均具有一定的促進作用，顯示中藥百合可能具有消食的功能，為中藥百合進一步藥理研究及質量控制奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是百合提取液HPLC譜圖。
[0011]圖2是百合提取物采用HSCCC分離的色譜圖和HSCCC分離的3個化合物的HPLC色譜圖。
[0012]其中:Α為HSCCC分離的色譜圖；B_C為HPLC色譜圖，B表示化合物I ;C表示化合物2 ;D表示化合物3。
[0013]圖3是3個化合物對淀粉酶的促進作用。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例中用到的原料與儀器、及HPLC分析條件:
[0015]百合購于湖南省龍山縣百合種植基地，品種Lilium brown ii F.E.Brown var.viridulum Baker。
[0016]LCIOAT-VP Plus高效液相色譜系統(日本島津公司)，配有:LC-10AT高壓泵，SPD-10A VP 紫外檢測器，wondasil? C18 反相色譜柱(150mmX 4.6mm, 5 μ m)。
[0017]TBE-300A型高速逆流色譜(HSCCC)儀(聚四氟乙烯柱，內徑1.6mm，柱容積280mL，轉速0-1000r/min)(中國上海同田生化技術有限公司)，配有:TBD_2000紫外檢測儀，LX-300恒溫器，TBP-50A恒流泵(北京長流科技儀器公司)。
[0018]高效液相色譜(HPLC)分析條件:采用wondasil? C18 (4.6X250mm)色譜柱；流動相為A泵:水，B泵:甲醇，采用梯度洗脫方法洗脫:0-40min (B: 20% — 80%)，流速LOmL/min ;柱溫:30°C，進樣量20 μ L。
[0019]實施例1中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的制備
[0020]1.百合提取物的制備
[0021]取新鮮百合磷莖置50°C烘箱中干燥，粉碎；取83(^干燥百合粉，加入6倍質量的60%質量濃度的乙醇于60°C水浴浸3次，每次lh，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味，得3200mL提取液。將該提取液以2BV/h流速通過裝有800mL DlOl大孔吸附樹脂的層析柱(4.6cmX48cm)，吸附后靜置0.5h，用1600mL蒸餾水以2BV/h流速淋洗除去雜質，再用70%質量濃度的乙醇以2BV/h流速洗至洗脫液無色，將得到的乙醇洗脫液2900mL減壓濃縮后冷凍干燥，即得百合提取物6.5g，置于冰箱中避光保存，作為HSCCC的進樣原料。 [0022]百合磷莖提取物的HPLC分析:制得的百合60%乙醇提取液在上述高效液相色譜分析條件下的HPLC圖見圖1。由圖可見，提取液中含有多種化合物，PDA檢測器對各主要色譜峰的紫外吸收光譜表明，色譜圖中的多個化合物均具有相似的紫外吸收光譜，在3IOnm左右有最大吸收，在220nm有較強吸收，其中化合物1、2、3相對含量較高，作為HSCCC分離目標。
[0023]2.高速逆流色譜(HSCCC)分離過程
[0024]按乙酸乙酯-正丁醇-0.5%乙酸水溶液(3:1.5:5，V/V)配制溶劑體系，將所有溶劑按體積比充分混合，靜置分層過夜后，將上相與下相分離；取制得的百合提取物250mg，用20mL下相溶解作為樣品溶液，超聲脫氣15min后，將上相溶劑以20mL/min的流速泵入主機管路，待上相溶劑充滿管路后，儀器以850rpm/min轉速正向旋轉，柱溫箱25°C，再將下相以2mL/min的流速泵入主機管路,檢測波長280nm。平衡后取樣品溶液進樣,80min后進行圖譜采集，HSCCC分離的色譜圖見圖2A，根據峰形手動分段收集流出液，得到3個化合物，經濃縮、冷凍干燥并進行HPLC分析(分析條件見上)得到4.2mg純度為96.2%的化合物1，2.3mg純度為95.1%的化合物2，5.8mg純度為98.8%的化合物3 (在254nm波長下采用面積歸一法計算)，參見圖2B-圖2D。[0025]實施例2化合物結構鑒定
[0026]采用MS、1!! NMR和13C NMR對3個化合物進行結構鑒定。質譜采用電噴霧電離源ESI，負離子模式，由湖南農業大學分析測試中心完成；核磁共振樣品用CD3OD溶解，頻率為400MHz，由湖南大學化工學院分析測試中心完成。
[0027]確定該3個化合物為酚酸甘油酯苷化合物，其中:
[0028]淺黃色粉末的化合物I為
[0029](2S) -l-O-p-coumaroyl-3-O- β -D-glucopyranosylylycerol (regaloside A),分子式:C18H2401Q ；
[0030]黃色粉末的化合物2為(2S)-l-0_acetyl
[0031]caffeoyl-3-O-β-D-glucopyranosylylycerol,即 Acetylregaloside C,分子式:
。2(^26〇12 ;
[0032]淺黃色粉末的化合物3為
[0033](2S)-1-0-p-coumaroy1-2-0-β -D-glucopyranosyIylycero1-3-0-acetyIglycerο I (regaloside B),分子式 = C20H
26^11 °
[0034]3個化合物的結構如下:
[0035]
【權利要求】
1.一種中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法，其特征在于:該方法步驟如下: a.制備百合提取物:取中藥百合粉，加入5-10倍質量的質量濃度為40-60%的乙醇于50-70°C水浴浸提3次，每次0.5-lh，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味；將該提取液以l_3BV/h流速通過裝有DlOl大孔吸附樹脂的層析柱，吸附后靜置0.5-lh，用蒸餾水以2-4BV/h流速淋洗除去雜質，再用70%質量濃度的乙醇以2-4BV/h流速洗至洗脫液無顏色，將乙醇洗脫液減壓濃縮后冷凍干燥，即得百合提取物； b.高速逆流色譜法分離:將乙酸乙酯、正丁醇和0.5%乙酸水溶液按體積比3:1.5:5組成高速逆流溶劑體系，充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣；將制得的百合提取物按每200mg-250mg加10_20mL下相的比例用下相溶解作為樣品溶液，將上相溶劑以20mL/min的流速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿后，在800-900rpm/min的轉速下將剩余下相以1.5-2mL/min的流速注入，檢測波長為280nm，平衡后將樣品溶液進樣，SO-1OOmin后進行圖譜采集，根據峰形手動分段收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮后冷凍干燥，得粉末狀化合物regaloside A、化合物Acetylregaloside C及化合物regalosideB0
2.如權利要求1所述的中藥百合中酚酸甘油酯苷化合物的高速逆流色譜分離方法，其特征在于:所述中藥百合粉是取新鮮中藥百合于50°C -60°C烘箱中干燥至含水量為7-9%，粉碎至粒徑為10-20目即可。
3.如權利要求1所述方法得到的化合物在DPPH自由基清除作用和脂質過氧化抑制作用中的應用。
4.如權利要求1所述方法得到的化合物在對α-淀粉酶活性的促進作用中的應用。
【文檔編號】A61P39/06GK103641867SQ201310654977
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】陸英, 傅冬和, 張盛, 肖文軍, 劉仲華 申請人:湖南農業大學