用于治療胰功能異常的方法

用于治療胰功能異常的方法
【專利摘要】用于在有需要的對象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-I+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。本發明的方法可用于治療和/或預防和/或延緩由胰功能異常引起的或與其相關的疾病的發作，例如，由胰不正常的內分泌或外分泌功能引起的疾病。
【專利說明】用于治療胰功能異常的方法
[0001]本申請是申請日為2009年11月19日的申請號為200980155054.2標題為“用于治療胰功能異常的方法”的申請的分案申請
發明領域
[0002]本發明涉及在有需要的對象中改善胰功能的方法。是方法可用于治療和/或預防和/或延緩病癥的發病或進展，其中所述病癥由胰功能異常導致或與胰功能異常相關聯，例如，由不正常的胰內分泌或外分泌功能所導致。
發明背景
[0003]胰是脊椎動物的消化和內分泌系統中的多功能的腺體器官。其既是內分泌腺體(產生若干激素胰島素、胰高血糖素、和促生長素抑制素)，也是外分泌腺體(分泌胰液，其含有傳遞至小腸的消化酶)。胰液中的酶幫助進一步分解食糜(chyme)中的碳水化合物、蛋白、和脂肪。
[0004]胰具有內分泌功能的部分由眾多的細胞簇構成稱作朗格漢斯胰島。根據其分泌在胰島中主要由四類細胞類型:α細胞分泌胰高血糖素、β細胞分泌胰島素、δ細胞分泌促生長素抑制素、以及PP細胞分泌胰多肽。胰島是內分泌細胞的緊湊集合，其排列成簇和線狀(cord)并且還含有毛細血管網。胰島的毛細血管以直接與血管接觸的內分泌細胞的層進行排列，并且大部分內分泌細胞直接與血管接觸，這是通過細胞質的過程或者或者通過直接的并置(apposition)。
[0005]與分泌激素至血液的內分泌胰相反，外分泌胰產生消化酶(例如，胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶、和淀粉酶)以及堿性液體，并響應小腸激素而通過外分泌管道系統分泌蘇`和膽囊收縮素將這些分泌至小腸。消化酶是由外分泌胰的腺泡細胞產生和分泌的。沿胰排列的特定細胞，稱作泡心細胞，將碳酸氫鹽-和鹽-富集的溶液分泌至小腸內。
[0006]胰功能異常可導致胰所產生的激素和/或酶過量生產或生產不足。與胰功能異常相關或由其引起的病癥包括糖尿病、極性或慢性胰炎、胰酶缺乏或胰腫瘤。
[0007]糖尿病(DM)是一種最常見的慢性內分泌疾病，遍及所有的年齡組和人群，并且由胰功能異常所引起。DM在全世界影響超過一億人。單單在美國，就有超過一千二百萬對象被診斷為患有DM，每年新增診斷600，000例。
[0008]DM是一組疾病的診斷術語，該組疾病特征在于不正常的碳水化合物(例如，葡萄糖)內穩態或代謝，導致血糖升高。這些疾病包括互相關聯的代謝、血管、和神經病性組分。DM的各種組分由胰的內分泌和/或外分泌功能所引起。例如，代謝組分，通常特征是高血糖，包括由激素(特別是胰島素)分泌的缺失或顯著降低引起的碳水化合物、脂肪和蛋白代謝的改造(即，內分泌功能)和/或胰島素作用無效。在外分泌水平，胰產生各種涉及食物消化的酶。例如，胰產生淀粉酶，而在DM中可能分泌不足量的此種酶來消化碳水化合物，導致外分泌胰機能不全、營養不良和體重減輕。因此，胰的內分泌和外分泌功能都對DM的代謝組分有貢獻。DM的血管組分包括血管畸形，導致心血管、視網膜、和腎臟的并發癥。外周和自主神經系統的畸形也是DM的組分。
[0009]DM在遺傳上由循環胰島素的量的減少和/或對象中對胰島素相應的細胞的減少而引起。胰島素在碳水化合物、脂肪、和蛋白質的代謝中是必須的。胰島素通過使葡萄糖進入肌肉細胞和脂肪細胞以及通過刺激葡萄糖轉化成糖原(糖原生成)作為碳水化合物的儲存，從而降低血液葡萄糖水平。胰島素還抑制所儲存的葡萄糖從肝糖原釋放(糖原分解)，并減緩了脂肪降解成甘油三酸酯、游離脂肪酸、和酮。此外，胰島素減緩了蛋白分解產生葡萄糖(糖原異生)。胰島素是由胰的胰島中的β細胞生成和分泌的。
[0010]有若干種類型的糖尿病，包括I型(也稱作胰島素-依賴型糖尿病或IDDM)和II型(也稱作非胰島素-依賴型糖尿病或NIDDM)、妊娠糖尿病和糖尿病前期(或者受損的葡萄糖代謝)。當然，糖尿病最常見的兩種形式是I型和II型糖尿病。I型糖尿病(或胰島素-依賴型糖尿病；IDDM)是由胰β細胞的缺失、破壞或損失所引起的，導致胰島素的絕對缺乏。II型糖尿病(非胰島素-依賴型糖尿病；NIDDM)是特征在于胰島素抗性的異型的疾病。
[0011]I型糖尿病
[0012]I型糖尿病的總發病率單單在美國大約是每100，000人15例。在美國大約所有糖尿病病例中5-15%是I型糖尿病病例，醫師診斷每年新增病例約10，OOOnew例。國際上來說，I型糖尿病的分辨率從中國的每100，000人約0.61例至撒丁島的每100，000人約34.5例，而在芬蘭每100，000人 超過40例。許多國家也報道在過去20年I型糖尿病的分辨率
已經翻番。
[0013]I型糖尿病的急性臨床發作的特征在于一些癥狀如高血糖、多尿癥、煩渴、體重降低、或視力模糊，單獨的或組合的癥狀，隨后幾天或幾周有酮酸中毒。通常，該疾病的急性發作被認為之前是長期的無癥狀潛伏期，期間分泌胰島素的β-cells日益被對象的免疫系統所破壞。
[0014]在健康個體中，胰通常含有1-1.5百萬個胰島；并且大約80%的胰島細胞islet是產胰島素的β-細胞。當少于10%的這些β-細胞殘存時，糖尿病的臨床癥狀開始顯現。
[0015]由胰細胞的損失所導致的胰島素供應和需求之間的失諧會引起不正常的葡萄糖、脂質、和蛋白質的代謝。胰島素缺乏可以引起高血糖和血糖過多性脫水(hyperglycemic dehydration)、游離脂肪酸的水平升高、血清酮的水平升高、甘油三酸酯的水平升高、極低密度脂蛋白(VLDL)的水平升高、支鏈氨基酸水平的升高、蛋白合成的降低、以及酮酸中毒。具有I型糖尿病的對象可能會患有任何的一或多種不同的血管和神經性的并發癥。例如，I型糖尿病患者心臟病發作的幾率是非糖尿病患者的兩倍；他們患壞疽的幾率是5倍；患有完全腎衰竭的幾率是17倍，失去視力的幾率是25倍。
[0016]I型糖尿病的治療/預防
[0017]目前，通過施用外源胰島素、鍛煉和飲食控制來治療I型糖尿病。這些形式的治療并不糾正對胰的損害(即，替換被破壞的胰島細胞)，而是替換胰島細胞所產生的生長因子或者嘗試避免對這些因子的需求。
[0018]大部分患有I型糖尿病的患者需要某種形式的胰島素治療。那時，此種治療通常需要監測對象的血液葡萄糖和/或胰島素水平，并在需要的時候注射重組的或純化的胰島素。新形式的胰島素也在開發中以使得能夠鼻部或口服施用。然而，此種形式的治療需要對象連續不斷地監測以及需要在對象的一生中每天至少施用一次胰島素。如果對象忘記施用胰島素或者施用了過多的胰島素，就會有發展出例如，高血糖、低血糖或酮酸癥的風險。
[0019]目前用于治療I型糖尿病的另外的化合物包括例如，磺酰脲、雙縮胍，α-葡糖苷酶抑制劑或噻唑烷二酮。然而，每個這些化合物也具有明顯的缺陷。例如，磺酰脲引起低血糖和超高胰島素血癥；雙縮胍引起乳酸性酸中毒；α -葡糖苷酶抑制劑引起腸胃副作用；而噻唑烷二酮具有長期存在的作用，與體重之間相關聯并且需要頻繁的測試肝功能。
[0020]胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)也被鑒定為糖尿病可能的治療劑。此種肽誘導胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達，PDX-1是在胰發育、β-細胞分化、和β -細胞功能保持中發揮重要作用的轉錄因子(Babu et al.，MolEndocrinol.20:3133-3145, 2006)。PDX-1涉及誘導葡萄糖感受和代謝的表達，如GLUT2，葡糖激酶和胰島素。GLP-1被建議為潛在的治療劑是因為其可以誘導胰β細胞在對象中擴展，以及刺激膜島素表達(Buteau, Diabetes and Metabolism, 34: S73-S77, 2008)。然而，使用臨床可用的能夠提高GLP-1細胞內可用性的物質，如口服的活性二肽基肽酶-4(DPPIV)抑制劑或可注射的GLP-1類似物，已被局限于治療輕度的II型糖尿病。這些物質相對較短的半衰期、需要頻繁的施用、以及在嚴重的β細胞損失的病例中相對缺乏效力，已經排除了他們被用作胰島素節約劑用于I型糖尿病或其它胰島素依賴性患者的可能。即使是可口服的GLP-1類似物也具有短的半衰期并需要每日高劑量施用。
[0021]其它治療選擇包括胰島移植，其已顯示可降低胰島素依賴性(Shapiro etal., New Eng.J.Med.，343:230-238，2000)。然而，此種治療的應用受到了來自捐獻者的原代人胰島非常有限的可用性的局限，在移植過程中必須具有心跳以確保細胞存活(Burnset al., J.Endocrinology, 103:437-443, 2004)。
[0022]干細胞，例如，胚胎干細胞(ES)已被建議作為適宜的來源用于產生治療相應量的產胰島素細胞。然而，分泌`胰島素的細胞還未從干細胞中產生，更不要說所需的水平了，估計每次移植需要2-4χ109個β-細胞。此種基于細胞的療法必須克服這樣的困難，即替代細胞的增殖能力必須受到嚴格控制以確保它們不會擴展至某種水平會引起超高胰島素血癥或低血糖，而移植的細胞也必須避免受體免疫系統的破壞。此外，在基于ES細胞的療法中，必須去除任何殘留的ES細胞以避免形成畸胎瘤的風險。
[0023]II型糖尿病
[0024]II型糖尿病占糖尿病病例的約90-95%，并且僅在美國每年就導致約193，000人死亡。II型糖尿病在所有死亡原因中排名第7位。在西方社會，II型糖尿病目前影響成年人群的6%并且全世界的分辨率預計每年增加6%。盡管存在某些遺傳性特點可能使得某些特定個體會偏向于發展出II型糖尿病，但是該疾病發病率目前增長的主要原因是日益增加的久坐的生活方式、飲食以及目前在發達國際中普遍存在的肥胖癥等。II型糖尿病目前在國際上被認為是人類健康的主要威脅之一。
[0025]II型糖尿病，在肌肉、脂肪、肝細胞不能正常響應胰島素的時候發展出來。此種不能響應(稱作胰島素抗性)可能是由于這些細胞上胰島素受體的減少，或者這些細胞內信號通路的功能異常，或者二者兼而有之。β_細胞起初通過提高其胰島素輸出來彌補此種胰島素抗性。隨著時間的推移，這些細胞變得不能夠產生足夠的胰島素以維持正常的葡萄糖水平，表明進展至 II 型糖尿病(Kahn et al，Am.J.Med.108: 2S-8S)，2000)。
[0026]II型糖尿病的治療
[0027]對于II型糖尿病的常規治療是非常有限的，并集中于嘗試控制血液葡萄糖水平以使并發癥最小化或者延遲。目前的治療目標是胰島素抗性(二甲雙胍，噻唑烷二酮("TZD"))，或者細胞釋放胰島素(磺脲，依澤那太(exanatide))。磺脲，以及其它通過使β_細胞去極化的化合物，具有低血糖的副作用，因為它們引起不依賴于循環葡萄糖水平的胰島素分泌。目前療法的其它副作用包括體重增加、隨時間推移對治療無反應、胃腸問題、以及水腫。
[0028]—種目前經許可的藥物，Januvia(sitagliptin)提高了腸降血糖素激素的血液水平，其可以增加胰島素分泌，降低胰高血糖素分泌并且具有其它未經有效表征的作。然而，Januvia和其它二肽基肽酶-1V抑制劑也可以影響其它激素和肽的組織水平，并且此類廣泛的效果的長期結果還未經完整的研究。此外，此化合物不解決與胰島素抗性相關的問題。
[0029]與I型糖尿病類似，GLP-1已被建議作為潛在的治療劑用于II型糖尿病，這是由于其誘導胰島素分泌、誘導β_細胞擴展和恢復葡萄糖抗性細胞中的葡萄糖耐受的能力。然而，如上所述，GLP-1及其類似物由于其非常短的半衰期而具有有限的治療潛力。
[0030]由前文可知，現有技術中需要用于對與胰功能相關的疾病的發作或進展進行治療或預防或延緩的方法和/或用于改善胰功能的方法。
[0031]發明概述
[0032]在導致本發明的工作中，發明人想要確定間充質前體細胞(MPC)的特定亞集對胰功能異常的發展和/或進展的作用。本發明人使用了已知的模型，其中通過對小鼠施用鏈脲菌素(STZ)來誘導胰功能異常。此化合物誘導胰島的炎癥和免疫細胞滲入，最終導致細胞死亡和胰功能異常。STZ在胰的內分泌功能(例如，降低胰島素產生)和胰的外分泌功能(例如，降低淀粉酶產生)均引起功能異常。此模型也是葡萄糖代謝病的被接受的模型，例如，I型糖尿病和II型糖尿病。
[0033]如本文所示例的，本發明人證明了向經過STZ處理的小鼠施用STRO-1+細胞提高了血清胰島素水平以及減低了血液葡萄糖水平(與經過STZ處理的但未接受STRO-1+細胞的小鼠相比)。本發明人也證明了 STRO-1+細胞在胰中誘導或增加表達rox-1的細胞的數目，和/或增加對象中胰β細胞和/或胰島的數目(例如，促進胰β細胞再生)。本發明人也發現STRO-1+細胞通過提高β細胞數目和/或降低α細胞從而恢復了胰β細胞對胰α細胞的比率。本發明人此外還發現用STRO-1+細胞治療可在對象的胰中誘導血管形成。這些數據一起，表明了 STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或由其所分泌的因子誘導或促進胰再生和/或改善胰功能。因此，所述STRO-1+細胞或其后代細胞或源自其的因子能夠治療和/或預防和/或降低胰的STZ毒性作用。因此這些數據表明所述STRO-1+細胞或其后代細胞或源自其的一或多種因子能夠治療或預防或延緩胰功能異常的發作或者降低胰功能異常的嚴重性和/或改善胰功能和/或誘導胰或其細胞的再生和/或醋精葡萄糖代謝(例如，通過提高循環胰島素水平)。
[0034]本發明人的發現為用于治療和/或預防和/或延緩胰功能異常的發作和/或延緩胰功能異常的進展的方法提供了基礎，所述胰功能異常如糖尿病。[0035]因此，本發明提供了用于在有需要的對象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0036]本發明另外或者作為選擇還提供用于促進或者誘導對象中胰再生的方法(例如，在患有胰功能異常的對象中)，所述方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。例如，該方法誘導或促進新的β細胞和/或胰中微血管的產生。
[0037]本發明另外或者作為選擇還提供用于誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0038]本發明另外或者作為選擇還提供用于在對象中降低的血液葡萄糖水平和/或增加血液/血清胰島素水平的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0039]本發明另外或者作為選擇還提供用于在對象中增加胰β細胞的數目和/或用于增加胰β細胞相對于胰α細胞的數目和/或用于降低胰α細胞的數目和/或用于增加胰島的數目的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0040]本發明另外或者作為選擇還提供用于在對象的胰中增加胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達和/或用于增加表達的PDX-1的細胞的數目的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0041]本發明另外或者作為選擇還提供用于在對象的胰中誘導或促進動脈發生或血管發生的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0042]本發明另外或者作為選擇還提供用于在對象中增加胰β細胞前體的數目或者誘導或促進胰β細胞前體的增殖的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
[0043]在一個實例中，對象患有胰功能異常。
[0044]在一個實例中，所述胰功能異常與胰的內分泌功能和/或胰的外分泌功能的功能異常相關或由其所引起。優選地，所述胰功能異常導致胰功能降低或與胰功能降低相關，例如，胰的內分泌功能減低或胰的外分泌功能降低。
[0045]在本發明的一個實例中，胰功能異常關聯或引起碳水化合物代謝病。此種碳水化合物代謝病可由胰的內分泌和/或外分泌功能異常所引起。在一個實例中，所述碳水化合物代謝病由胰的胰島素生產降低所引起。在另一個實例中，所述碳水化合物代謝病是由胰高血糖素水平升高所引起(例如，α細胞的數目增加和/或胰高血糖素的表達和/或產生和/或分泌增加)。在另一個實例中，所述碳水化合物代謝病是由胰的淀粉酶生產降低所引起。技術人員根據本文的說明會意識到，碳水化合物代謝病(或胰功能異常)未必僅由胰的功能來表征。例如，碳水化合物代謝病也可以由胰島`素抗性和/或由血管組分和/或由神經病變的組分來進行表征。在本發明的一個實例中，所述胰功能異常是糖尿病，例如，I型糖尿病或II型糖尿病。
[0046]優選地，本發明的方法包括施用有效量的或者治療有效量的或者預防有效量的STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。在一個實例中，該方法包括施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的量足以誘導對象中胰島素生產，優選誘導胰島素的生產至少約I周或2周或3周或4周。
[0047]在一個實例中，將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子直接施用至對象的血流中，然而并不排除其它的施用部位。優選地，將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子全身性地施用。例如，將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子靜脈內、動脈內、施用至大動脈內、至心臟的心房或心室內或者至與胰相連的血管內，例如，腹部大動脈、上腸系膜動脈、胰十二指腸動脈或脾動脈。在優選的實例中，將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子經動脈內施用，例如，施用至股動脈內或腹腔動脈內，例如，施用導管。
[0048]作為選擇，或者此外，將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子施用至對象的胰或其部分。
[0049]在一個實例中，施用于對象的STRO-1+細胞是STRO-1bn、和/或表達組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)。本文描述了另外的STRO-1+細胞群體，其特征在于特定的細胞表面標記物或其組合。根據此實例，后代細胞和/或可溶因子也可以源自表達STRO-1的細胞或STRO-1b"細胞和/或表達TNAP的細胞。此類后代細胞也可以表達STRO-1或者是STRO-1b"細胞和/或表達TNAP。
[0050]根據本發明用于治療或延緩胰功能異常的進展的的實例，優選在對病癥進行診斷之后再施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子，例如，使用本領域已知的標準技術。對于那些用于預防或延緩胰功能異常的發作的實例，優選在病癥的臨床診斷前施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子，例如，當對象患有受損葡萄糖耐受和/或受損的禁食糖血時，和/或在自身免應答之前的或伴有自身免應答的I型糖尿病的情況，如由T細胞群體和/或B細胞群體的擴展所指示出的和/或由自身抗體的產生所指示出的`(例如，在I型糖尿病的發作或進展中針對胰β_胰島細胞的細胞毒T細胞的擴展和/或針對一或多種胰β-胰島細胞標記物的自身抗體的擴展)。
[0051]優選地，本文根據任何實例所描述的方法另外包括監監測或探測胰功能異常的發病和/或進展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰島素水平、和/或β細胞的數目、和/或α細胞的數目、和/或胰島的數目、和/或rox-1表達細胞的數目、和/或PDX-1表達的量和/或血管的數目。例如，該方法另外包括葡萄糖耐受測試和/或禁食糖血測試和/或測量由胰所產生的激素或酶的水平和/或獲得胰的樣品以確定β-細胞的數目和/或α細胞的數目和/或胰島的數目和/或表達rox-1的細胞的數目和/或rox-1表達的量和/或血管的數目。此類監測可以指示出隨后施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子是必須的或期望的。
[0052]技術人員從前面的段落會了解到，本文根據任何實例所描述的方法不應被認為是將STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子限制為單次施用。本發明清楚地涵蓋了多次施用，施用于相同的或不同的部位或通過相同的或不同的途徑施用。本發明也涉及了 STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子的單次施用。
[0053]在一個實例中，將STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子以組合物的形式施用，例如，包含所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子以及載體和/或賦形劑的組合物。適宜的載體和/或賦形劑對技術人員而言將是顯見的和/或在本文中有描述。
[0054]此種組合物可以包含另外的可用于治療或預防碳水化合物代謝病的因子，例如，胰島素或淀粉酶和/或與正常胰功能相關的肽或多肽，例如，膽囊收縮素辛肽(cholycystokinin octapeptide)或促生長素抑制素或胰高血糖素或胰蛋白酶原或胰凝乳蛋白酶原或彈性蛋白酶或羧肽酶或胰脂肪酶。作為選擇，或者此外，STRO-1+細胞或其后代細胞可以經遺傳改造以表達(以及優選分泌)，此種另外的因子，例如，胰島素或淀粉酶和/或與正常胰功能相關的肽或多肽例如，膽囊收縮素辛肽或促生長素抑制素或胰高血糖素或胰蛋白酶原或胰凝乳蛋白酶原或彈性蛋白酶或羧肽酶或胰脂肪酶。
[0055]本發明還提供了對STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的使用，或者含有上述的組合物的使用:
[0056](i)治療胰功能異常；和/或
[0057](ii)改善胰功能；和/或
[0058](iii)誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生；和/或
[0059](iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或
[0060](V)提高胰β細胞的數目和/或用于相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或用于減少胰α細胞的數目和/或用于提高胰島的數目；和/或
[0061](vi)提高胰和十 二指腸同源異型框因子-1(rox-1)表達和/或用于提高胰中的PDX-1表達細胞的數目；和/或
[0062](vii)誘導或促進胰中的動脈發生或血管發生。
[0063]本發明還提供了 STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子在制備藥物中的用途，所述藥物用于:
[0064]⑴治療胰功能異常；和/或
[0065](ii)改善胰功能；和/或
[0066](iii)誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生；和/或
[0067](iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或
[0068](V)提高胰β細胞的數目和/或用于相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或用于減少胰α細胞的數目和/或用于提高胰島的數目；和/或
[0069](vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1 (rox-1)表達和/或用于提高胰中的PDX-1表達細胞的數目；和/或
[0070](vii)誘導或促進胰中的動脈發生或血管發生。
[0071]本發明適用于廣闊范圍的動物。例如，所述對象是哺乳動物如人、狗、貓、馬、牛、或綿羊，優選所述對象是人。在一個實施例中，所述對象是人。在另一個實施例中，所述對象是非人哺乳動物。
[0072]附圖簡述
[0073]圖1描述了天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細胞對血液葡萄糖水平(BGL)的影響。血液葡萄糖水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細胞(CM)的糖尿病小鼠中確定，所述小鼠在STZ-療法后第10天被注射。血液葡萄糖值為平均葡萄糖(mM) +/-SEο 斯氏 t 檢驗(Student，s t-test)以顯著性 ρ〈0.05 來進行。[0074]圖2顯示了處理后的第7天、14天和21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細胞對血液葡萄糖水平(BGL)的影響，與STZ-處理后第10天的基準相比較。血液葡萄糖水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細胞(CM)的糖尿病小鼠中確定。結果表示為BGL相對于第10天細胞治療起始的％變化。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0075]圖3顯示了細胞治療劑量21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中STRO-1+細胞對胰島素水平的影響。血清小鼠胰島素水平在左心室注射了媒介物(CV)或STRO-1+細胞(CM)的糖尿病小鼠中確定。小鼠胰島素值為yg/L+/-SE。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0076]圖4A顯示了細胞治療劑量21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰微血管密度的影響。由抗-平滑肌肌動蛋白(SMA)抗體染色的微血管的總數目是基于胰切片的大小分布/橫切面面積來確定的。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0077]圖4B是顯微照片(200x)的復印，顯示了經STRO-1細胞處理的小鼠的胰組織中由小鼠抗-平滑肌肌動蛋白IgG2a-FITC染色的不同直徑的微血管。
[0078]圖5A顯示了細胞治療劑量21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰mRNA譜的影響。從媒介物組(CV)和STRO-1治療組(CM)的胰組織提取RNA,反轉錄并PCR擴增與β細胞再生相關的轉錄因子:1&^&、呢113、？(11-1。將總RNA含量針對持家基因β_肌動蛋白來進行歸一化。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0079]圖5B顯示了細胞治療劑量21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對PDX-1陽性細胞的作用。對由抗-PDX-1抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的PDX-1陽性細胞。數`據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對照組(無STZ)N=3只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0080]圖5C是一系列顯微照片(400x)的復印件，顯示了經抗原恢復、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由小鼠抗-PDX-1 (IgG2b)染色并由山羊抗-小鼠IgG2b-Alexa555綴合物檢測。
[0081]圖6A顯示了細胞治療21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰島特性的作用。對由H&E染色的胰組織分析胰島密度，其被針對所檢驗的切片面積而進行歸一化。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0082]圖6B顯示了細胞治療21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰島特性的作用。對由H&E染色的胰組織分析平均胰島直徑，其被針對所檢驗的切片面積而進行歸一化。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動物。
[0083]圖6C顯示了細胞治療21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰島特性的作用。對由H&E染色的胰組織分析平均胰島面積，其被針對所檢驗的切片面積而進行歸一化。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、以及STRO-1治療組N=6只動物。[0084]圖7A顯示了細胞治療21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰島特性的作用。對由抗胰島素抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的胰島素陽性細胞。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對照組(無STZ)N=3只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0085]圖7B是一系列顯微照片(200x)的復印件，顯示了經抗原恢復、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由豚鼠抗-胰島素抗體染色并由抗豚鼠IgG-羅丹明綴合物檢測。處理組在每張顯微照片的底部標出。
[0086]圖7C顯示了細胞治療21天后在STZ誘導的糖尿病NOD/scid小鼠中動脈內STRO-1+細胞對胰島特性的作用。對由抗胰高血糖素抗體染色的胰組織分析每mm2胰島面積的胰高血糖素陽性細胞。數據表示為平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理對照組(無STZ)N=3只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0087]圖7D是一系列顯微照片(200x)的復印件，顯示了經抗原恢復、福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，其由小鼠抗-胰高血糖素抗體染色并由山羊抗-小鼠IgG-FITC綴合物檢測。處理組在每張顯微照片的底部標出。
[0088]圖7E顯示了胰島內β細胞的數目作為總α+β細胞的比例。所示出的數據是從胰島素陽性細胞數目/mm2胰島面積以及胰高血糖素陽性細胞數目/mm2胰島面積而計算的。該數據表示平均+/-sem;且媒介物組N=8、STRO-1治療組N=6以及未處理的對照組(無STZ)N=3只動物。斯氏T檢驗以顯著性p〈0.05來進行。
[0089]優選實施方案詳述
[0090]一般技術和經選擇的定義
[0091]在整個本發明書中，除非另有具體說明或者背景另有要求，涉及的單一步驟、物質的組合物，成組的步驟或成組的物質組合物，應當被理解為涵蓋了一個以及多個(即一或多個)的那些步驟、物質的組合物、成`組的步驟或成組的物質組合物。
[0092]本文所描述的每個實施方案或者實施例經必要的修改后會適用于每個其它的實施方案，除非另有具體說明。例如，本文所述的專注于治療和/或預防和/或延緩對象中胰功能異常的發作和/或延緩對象中胰功能異常的進展的每個實施方案或實施例經必要的修改后會適用于改善胰功能的方法和/或誘導或促進胰再生的方法，就好像那些實施方案已明確地記載于本文中。
[0093]本文所述的關于治療胰功能異常的每個實施例應被理解為經必要的修改后會適用于碳水化合物代謝病的治療，就好像那些實施方案已明確地記載于本文中。
[0094]本文所述的關于治療胰功能異常的每個實施例應被理解為經必要的修改后會適用于糖尿病的治療，例如I型糖尿病或II型糖尿病，就好像那些實施方案已明確地記載于本文中。
[0095]本領域技術人員會理解，本文所述的發明可接受本文所具體描述的之外的變化和修改。應理解為本發明包括所有此類的變化和修改。本發明也單獨地或共同地包括本說明書中所提及和指出的所有的步驟、特征、組合物和化合物，以及任意的和所有的組合，或者任意的二或更多個所述的步驟或特征。
[0096]本發明在范圍上不受本文所述的具體實施方案的限制，所述實施方案僅僅是用于例證的目的。功能上等價的產品、組合物和方法如本文所述也清楚地在本發明的范圍之內。
[0097]本發明的施行中無過度的實驗，除非另有明示，其中使用常規技術分子生物學、微生物學、病毒學、重組DNA技術、溶液中的肽合成、固相肽合成、以及免疫學。此類過程例如在如下中有描述Sambrook, Fritsch & Maniatis, MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, SecondEdition (1989)，整個 Vols 1、II^[IDI;DNA Cloning: A Practical Approach，Vols.1 和II (D.N.Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford,全文；Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach (M.J.Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford,全文，以及特別是其中的文章 Gait，ppl-22;Atkinson et al, ρρ35~81;Sproat et al，pp83_115;和Wu et al,pp135-151;4.Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.，1985)IRL Press,Oxford,全文;Immobilized Cellsand Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press, Oxford,全文;Perbalj B., APractical Guide to Molecular Cloning(1984);Methods In Enzymology(S.Colowickand N.Kaplan, eds.，Academic Press, Inc.)，全系 列；J.F.Ramalho Ortigaoj 〃TheChemistry of Peptide Synthesis〃In:Knowledge database of Access to VirtualLaboratory website(Interactiva, Germany);SakakibarajD.，TeichmanjJ.，Lien,E.Land Fenichelj R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342 ;Merrifield, R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85, 2149-2154 ; Baranyj G.and Merrifieldj R.B.(1979)in The Peptides (Gross, E.and MeienhoferjJ.eds.)，vol.2，pp.1-284，AcademicPress, New York.12.Wiinschj E., ed.(1974) Synthese von Peptiden in Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie (Miller, E., ed.), vol.15, 4th edn.,第 I 和第 2 部7Jf , Thiemej Stuttgart; Bodanszkyj Μ.(1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg;Bodanszkyj M.& Bodanszkyj A.(1984)The Practice of PeptideSynthesis, Springer-Verlagj Heidelberg;Bodanszkyj M.(1985)Int.J.Peptide ProteinRes.25, 449-474;Hand book of Experimental Immunology, Vols.1-1V(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications);以及 Animal CellCulture!Practical Approach, Third Edition(John R.W.Masters, ed., 2000), ISBN0199637970，全文。
[0098]在整個說明書中，除非前背景中另有要求，措辭〃包含〃或其變體如〃包括〃或〃含有〃等，將被認為是表示包括了所述的步驟或元件或整體或者步驟或元件或整體的組，但卻并不排除包括任何其它的步驟或元件或整體或者步驟或元件或整體的組。
[0099]如本文所用，術語"源自"應被認為是表示具體的整體可以得自特定的來源但卻未必是直接來自該來源。對于源自STRO-1+細胞和/或其后代細胞的可溶因子的情況，此術語應被認為是指一或多種因子例如蛋白質、肽、碳水化合物等，是在STRO-1+細胞和/或其后代細胞的體外培養期間所產生的。
[0100]如本文所用，術語“改善胰功能”應被認為是指對象中胰的一或多種功能與未經本發明所述那樣處理的對象中的同一功能相比得到了增強(優選是與處理前的對象相比)。此術語涵蓋了，例如在患有或者未患有葡萄糖代謝病的對象中提高胰島素分泌的水平或改善胰島素分泌的調節。該術語還涵蓋了在具有升高的水平的胰高血糖素(例如，由于分泌胰高血糖素的腫瘤)的對象中和/或在患有低血糖的對象中降低例如胰高血糖素的分泌.[0101]如本文所用，術語“胰功能異常”應被認為是指任何這樣的狀況，其中對象中胰的一或多種功能與正常和/健康個體中同一功能不同。例如，術語“胰功能異常”涵蓋了其中對象中胰的內分泌功能和/或外分泌功能與正常和/或健康個體相比增強了或降低了。例如，“胰功能異常”的特征可以在于，與異常(即，增加了或減少了)水平的胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶相關或由其所引起。根據前文對于技術人員而言顯見的是，術語“治療胰功能異常”涵蓋了使胰的功能正常化(例如，治療對象以使胰的一或多種不正常的功能減弱或增強，從而使它們更類似于正常和/或健康個體的同一功能)。例如，此種治療可以在具有異常降低水平的胰島素和/或胰β細胞和/或胰島的對象中導致胰島素水平升高和/或胰β細胞和/或胰島的數目增加。此種治療可以同樣地降低異常升高的胰高血糖素水平，例如，分泌胰高血糖素的胰腫瘤的情況，例如通過降低分泌胰高血糖素的α細胞的數目和/或通過降低胰高血糖素的表達、產生和/或分泌。在前文的基礎上，術語“預防或延緩胰功能異常”的含義對于技術人員來說是顯見的。
[0102]胰功能異常可以與導致營養(例如，碳水化合物、脂質或蛋白質)吸收障礙的病癥相關或引起該病癥，例如是因為由胰所產生的消化酶的水平降低，如脂肪酶或淀粉酶，和/或通過降低胰液的產生。此類病癥包括胰炎、胰機能不全、獲得性自身免疫缺陷綜合癥、癌癥、囊性纖維化或Zollinger-Ellison綜合癥。在優選的實例中，所述病癥是由胰所產生的淀粉酶或脂肪酶的降低而引起的或者與其相關。
[0103]胰功能異常還可以關聯或引起與對象對營養的異常使用或代謝相關的病癥，例如，導致高血糖或低血糖、降低的血清氨基酸水平、蛋白尿、壞死松解性游走性紅斑(necrolytic migratory erythema)。此類病癥包括碳水化合物代謝病如糖尿病。其它病癥包括，例如腫瘤(如分泌胰高血糖素的腫瘤，其可引起高血糖)。示例性的腫瘤包括胰高血糖素瘤。
[0104]如本文所用，術語“碳水化合物代謝病”應被理解為是指對象不能夠(或者能力降低)降解或代謝或者吸收或使用一或多種形式的碳水化合物的病征，通常導致該對象的血流中所述碳水化合物的水平升高。`優選所述碳水化合物代謝病與涉及碳水化合物降解的激素在胰中生產的降低相關或者由其所引起，例如淀粉酶的生產。更優選地，所述碳水化合物代謝病與涉及碳水化合物攝取的激素在胰中生產的降低相關或者由其所引起，例如胰島素的生產。示例性的碳水化合物代謝病包括I型糖尿病、II型糖尿病、先天性I型糖尿病(Ib型)、早發性II型糖尿病(EOD)、青年發作性非典型糖尿病(YOAD)、青年的成年發作性糖尿病(MODY)、營養不良相關性糖尿病、妊娠糖尿病、葡萄糖耐受受損(IGT)的病癥、禁食血漿葡萄糖受損的病癥、代謝性酸中毒、酮病、X綜合癥、高血糖、低胰島素血癥、胰島素抗性、α甘露糖苷病、β甘露糖苷病、果糖不耐受、巖藻糖苷累積病、半乳糖血癥、Leigh病、粘脂質累積、粘多糖累積病、或者任何一或多種前述病癥的并發癥。優選所述碳水化合物代謝病是糖尿病，例如I型糖尿病或II型糖尿病。
[0105]優選患有糖尿病的對象具有臨床可接受的糖尿病標記，如:
[0106].禁食血漿葡萄糖高于或等于7nmol/L或126mg/dl;[0107].臨時血衆葡萄糖(在一天的任何時間獲取)高于或等于11.lnmol/L或200mg/dl并具有糖尿病的癥狀。
[0108].以；2小時的時間間隔測量的口服糖尿病耐受測試(OGTT)值高于或等于
11.lnmol/L或200mg/dl。OGTT以2或3小時的時間跨度給出。
[0109]如本文所用，術語“有效量”應被理解為是指STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子的量足以改善其所施用的對象的胰功能(與施用前相比和/或與未施用其的對象相比)。例如，有效量的STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子可以降低基礎或休眠葡萄糖水平(糖血)和/或改善葡萄糖耐受和/或提高血液胰島素水平和/或提高血清中或胰中或消化系統中胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶的水平。有效量的STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子還可以增加胰或其區域的血液供應，例如通過增加胰或其區域內或周圍的脈管系統。技術人員會意識到此種量會根據一些因素而變化，例如STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子、和/或特定的對象、和/或胰功能異常的類型或嚴重性。因此，此術語不應理解為是將本發明限制為具體的量，例如細胞或可溶因子的重量或數目，而本發明涵蓋了足以改善對象中胰功能的任何量的所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因。用于確定胰功能的方法和/或用于確定STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子足以改善胰功能的量的方法的技術人員是顯見的和/或在本文中有描述。有效量未必治療或防止胰功能異常。
[0110]如本文所用，術語“治療有效量”應被理解為是指STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子的量足以減少或抑制與胰功能異常相關或由其引起的臨床病癥的一或多種癥狀，達到低于所觀測的水平或者接受為該病癥的臨床診斷的水平。例如，治療有效量的STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子可以將對象的葡萄糖耐受從糖尿病對象中所觀測的水平降低到癥狀發生前的對象(例如患受損的葡萄糖耐受或受損的休眠糖血)中或者正`常或健康對象中所觀測到的水平。
[0111]如本文所用，術語“預防有效量”應被理解為是指STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子的量足以防止或抑制與胰功能異常相關或由其引起的臨床病癥的一或多種可探測癥狀的發作。例如，預防有效量STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子可以防止對象的葡萄糖耐受變為受損至該對象被臨床診斷為糖尿病的程度。
[0112]如本文所用，術語“治療”應被理解為是指施用治療有效量的可溶因子和/或細胞，并且減少或抑制與胰功能異常相關或由其引起的臨床病癥的至少一種癥狀。
[0113]如本文所用，術語“預防”或“防止”應被理解為是指施用預防有效量的可溶因子和/或細胞，并且停止或阻礙與胰功能異常相關或由其引起的臨床病癥的至少一種癥狀的發展。
[0114]〃延緩胰功能異常的進展〃是指治療降低了對象中胰功能異常的嚴重性。此種嚴重性的降低可以是，例如防止胰功能異常的一或多種并發癥，如營養吸收障礙、低血糖、高血糖、酮酸癥、視網膜病變、白內障、高血壓、腎衰竭、冠狀動脈病、外周血管病、神經病(如外周神經病或自主神經病)或者感染的風險增加。作為選擇，或者此外，胰功能異常嚴重性降低的特征在于，對象對治療性處理(如胰島素施用)的需求降低，或者對治療性處理規律性的需求降低(與未使用本發明的方法接受治療的對象相比)。作為選擇，或者此外，"降低胰功能異常進展"是指，與未使用降低胰功能異常的進展的化合物進行治療的糖尿病對象相比，延遲了胰功能異常的一或多種可檢測癥狀的發作。
[0115]如本文所用，術語“可溶因子”應被理解為是指由STRO-1+細胞和/或其后代所產生的任何可溶于水的分子，例如蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。此類可溶因子可以是細胞內的和/或由細胞所分泌的。此類可溶因子可以是復雜的混合物(如上清液)和/或其部分、和/或可以是純化的因子。在本發明的一個實例中，可溶因子是上清液或包含在上清液內。因此，本文中要施用一或多種可溶因子的任何實例應被理解為，經必要修改后將會適用于施用上清液。
[0116]如本文所用，術語“上清液”是指在適宜的培養基(優選液體培養基)中體外培養間充質前體細胞和/或其后代細胞后，所產生的非細胞材料。通常，所述上清液的產生是通過在適宜的條件和時間于培養基中培養細胞，隨后由離心等方法去除細胞材料。所述上清液在施用前可以經過或者未經過進一步的純化步驟。在游戲的實例中，所述上清液含有少于IO5個活細胞、更優選少于104、更優選少于IO3以及更優選沒有活細胞。
[0117]如本文所用，術語〃正常或健康個體〃應被理解為是指，經任何本領域已知的方法和/或本文所述的方法評估，未患有胰功能異常的個體。
[0118]STRO-1iM胞或后代細胞，以及源自其的上清液或一或多種可溶因子
[0119]STRO-1+細胞是在骨髓、血液、齒髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結、胸腺、骨骼、韌帶、腱、骨骼肌、真皮、和骨膜中發現的細胞；并且能夠分化成種系如中胚層和/或內胚層和/或外胚層。
[0120]在一個實施方案中，STRO-1+細胞是多能細胞，其能夠分化成很多細胞類型，包括但不限于，脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織、和纖維結締組織。這些細胞所進入的具體的譜系定型以及分化途徑取決于來自以下的各種影響，機械影響和/或內源生物活性因子如生長因子、細胞因子和/或宿主組織所確立的局部微環境條件。STRO-1+多能細胞是非造血先祖細胞，其分化以產生子細胞，所述子細胞是會不可逆地分化以產生表型細胞的干細胞或者前體細胞。
[0121]在優選的實例中，STRO-1+細胞在得自對象的樣品中富集，例如要治療的對象或相關的對象或不相關的對象(相同或不同的物種)。術語“富集”或其變體在本文用于描述細胞群體中一種特定的細胞類型的比例或者多種特定細胞類型的比例與未經處理的群體相比是增加了的。
[0122]在優選的實例中，用于本發明的細胞表達一或多種標記物，其單獨地或共同地選自由以下組成的組:TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-1、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+、或其任意組合。
[0123]〃單獨地〃是指本發明個別地涵蓋所述的標記物或標記物的組，而且，盡管單獨的標記物或標記物的組在本文中可能不是個別列出的，所附的權利要求可以分別限定此類標記物或標記物組并使其彼此可以分開。
[0124]〃共同地〃是指本發明涵蓋了任何數目或組合的所述標記物或標記物組，而且，盡管此類數目或組合的標記物或標記物組可能未在本文中具體列出，所附的權利要求可以分別限定此類組合或亞-組合并且使其與其它組合的標記物或標記物組可以分開。
[0125]優選所述STRO-1+ 細胞是 STRO-1bnght (syn.STRO-1b")。優選所述 STRO-1bnght 細胞又是 TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-I~、STR0-2+ 和 / 或 CD146+ 的一或多種。
[0126]在一個實例中，所述間充質前體細胞是如W02004/85630中所定義的血管周間充質前體細胞(perivascular mesenchymal precursor cell)。
[0127]細胞對于給定的標記物被稱作是〃陽性"，其可以表達低水平(1或dim)或高(bright, bri)的該標記物，這取決于該標記物出現在細胞表明的程度，其中所述術語涉及熒光的強度或者用于細胞分選過程的其它標記物。lo(或dim或dull)與bri的區別可以根據正在分選的細胞上所使用的標記物來理解。細胞對于給定的標記物被稱作是〃陰性〃，其未必在該細胞中缺失。此術語是指該標記物由該細胞以相對非常低的水平表達，并且當其經可探測地標記時產生非常低的信號或者在背景水平上不可探測。
[0128]術語〃bright〃在用于本文時是指，細胞表面上的標記物，當其經可探測地標記時產生相對高的信號。雖然并非要用理論來進行限制，但是據提議來說〃bright〃細胞比樣品中的其它細胞表達更多的靶標記物蛋白(例如由STRO-1識別的抗原)。例如，當用FITC-綴合的STRO-1抗體標記由熒光激活細胞分選術(FACS)分析時，STRO-1b"細胞比非-bright細胞(STR0-ldull/dim)產生更高的熒光信號。優選"bright〃細胞構成起始樣品中所含有的最明亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%。在其它的實例中，"bright"細胞構成起始樣品中所含有的最明亮標記的骨髓單核細胞的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%、或至少約2%。在優選的實例中，STRO-1fcight細胞相對于〃背景〃(即STRO-F細胞)具有STRO-1表面表達的21og幅度的更高的表達。經比較，STRO-1dim和/或STR0-產—te細胞與〃背景〃相比具有stro-〗表面表達的少于21og幅度的更高的表達，通常約Ilog或更低。
[0129]如本文所用的術語"TNAP"是要涵蓋組織非特異性堿性磷酸酶的所有同種型。例如，該術語涵蓋了肝同種型(LAP)、骨骼同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在優選的實例中，所述TNAP是BAP。在特別優選的實例中，本文所用的TNAP是指可以結合STR0-3抗體的分子，其中所述抗體是由如下雜交瘤細胞系所產生的，即2005年12月19日根據布達佩斯條約的規定保藏于ATCC的雜交瘤細胞系，其保藏號為PTA-7282。
[0130]此外，在優選的實例中，所述STRO-1+細胞能夠引起產克隆CFU-F。
[0131]優選所述STRO-1+多能細胞的很大一部分能夠分化成至少2種不同的種系。所述多能細胞可以定型的世系的非限制性的例子包括骨前體細胞；多能的用于膽管上皮細胞和肝細胞的肝細胞先祖；神經受限細胞(neural restricted cell),其可產生神經膠質細胞前體(進展為少突膠質細胞和星形膠質細胞)；進展為神經元的神經元前體；心肌和心肌細胞的前體，分泌葡萄糖應答胰島素的胰β細胞系。其它世系包括但不限于，成牙質細胞、產牙本質細胞和軟骨細胞、以及如下細胞的前體:視網膜色素上皮細胞、成纖維細胞、皮膚細胞如角質形成細胞、樹突狀細胞、毛囊細胞、輸尿管上皮細胞、平滑肌和骨骼肌細胞、睪丸先祖、血管內皮細胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞、成纖維細胞、髓基、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細胞、血管、上皮、神經膠質、神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
[0132]在另一個實例中，所述STRO-1+細胞不能在培養后產生造血細胞。
[0133]在一個實例中，細胞取自要治療的對象，用標準技術體外培養并用于獲得上清液或可溶因子或擴展的細胞，用于作為自體同源的或同種異源的組合物施用于所述對象。在另外的實例中，施用已建立的一或多種人細胞系的細胞。在本發明另一個有用的實例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人類，則所用細胞來自另外的物種)。
[0134]本發明還涉及得自或源自從體外培養產生的STRO-1+細胞和/或其后代細胞(后者也被稱為擴展的細胞)的所述上清液或可溶因子的用途。本發明的擴展的細胞可以具有廣泛的不同表型，這取決于培養條件(包括培養基中刺激因子的數目和/或類型)、傳代次數等。在某些實例中，所述后代細胞從親代群體的約2次、約3次、約4次、約5次、約6次、約7次、約8次、約9次、或約10次傳代后所獲得。然而，所述后代細胞可以從從親代群體的任何次數的傳代后所獲得。
[0135]所述后代細胞可以通過在適宜的培養基中培養而獲得術語"培養基"，在用于指細胞培養時，包括細胞周圍環境的組分。培養基可以是固體、液體、氣體、或相和材料的混合。培養基包括液體生長培養基以及不維持細胞生長的液體培養基。培養基還包括膠凝狀培養基如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原基質。示例性的氣態培養基包括細胞在皮氏培養皿上或其它固體或半固體支持物上生長時所暴露于其中的氣相。術語"培養基"也是指要用于細胞培養的材料，即使其還未與細胞接觸。換言之，制備用于細菌培養的營養富集液是培養基。當與水或其它液體混合時就成為適宜于細胞培養的粉末混合物可以被稱作"粉末培養
甘"
[0136]在實例中，可用于本發明方法的后代細胞是通過如下方法獲得的:使用標記有STR0-3抗體的磁珠將TNAP+STRO-細胞從骨髓中分離，然后培養擴展此分離的細胞(對于適宜培養條件的實例，參見Gronthos et al.Blood85:929-940，1995)。
[0137]在一個實例中，此類擴展的細胞(后代)(優選至少5次傳代后)可以是TNAP_、CC9+、HLA I+ 類、HLA Ι 類、CD14' CD19' CD3' CDlla-C' CD31' CD86' CD3[和 / 或 CD80'然而，可能在本文所述的不同培養條件下不同標記物的表達會發生變化。而且，雖然這些表型的細胞可以在所述擴展的細胞中占支配地位，但這不意味著存在少數比例的細胞不具有此表型(例如，少數百分比的所述擴展的細胞可以是CC9—)。在一個優選的實例中，擴展的細胞仍具有分化成不同細胞類型的能力。
[0138]在一個實例中，用于獲得所述上清液或可溶因子、或者細胞本身的擴展細胞群體，包含的細胞其中至少25%、更優選至少50%的細胞是CC9+。
[0139]在另一個實例中，用于獲得所述上清液或可溶因子、或者細胞本身的擴展細胞群體，包含的細胞其中至少40%、更優選至少45%的細胞是STR0-1+。
[0140]在另外的實例中，所述擴展的細胞可以表達一或多種標記物，所述標記物單獨地或共同地選自由如下組成的組:LFA-3、THY-U VCAM-U ICAM-U PECAM-U P-選擇素、L-選擇素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯蛋白 β 6-19、血栓調節蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STR0-2=瘦素-R)、RANKL, STRO-1bnght和CD146或這些標記物的任意組合。
[0141]在一個實例中，所述后代細胞是如W02006/032092中所定義和/或描述的多潛能擴展的STRO-1+多能細胞后代(MEMP)。用于制STRO-1+多能細胞的富集群體(從其中可以衍生出后代細胞)的方法在W001/04268和W02004/085630中有描述。在體外的背景下，STRO-1+多能細胞將很少作為純的制備物存在并且通常將與其它細胞(組織特異性定型細胞(TSCC)) —起存在。W001/04268提及了從骨髓中以大約0.1%至90%的純度水平收獲此類細胞。包含MPC的群體(從其中可以衍生出后代細胞)可以直接地從組織來源收獲，或者其可以是已經被離體擴展的群體。
[0142]例如，所述后代可以得自收獲的、未擴展的基本純化的STRO-1+多能細胞群體，包含其所存在的群體中的至少約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、95%的總細胞。此水平可以例如通過如下方式達到，即選擇對至少一種標記物為陽性的細胞，所述標記物單獨地或共同地選自由如下組成的組:TNAP、STRO-1b "ght、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146 和 STR0-2。
[0143]MEMPS可以與新鮮收獲的STRO-1+多能細胞區分，這是在于它們對標記物STRO-1b"是陽性而對標記物堿性磷酸酶(ALP)是陰性。相反，新鮮分離的STRO-1+多能細胞對于STRO-1b"和ALP均為陽性。在本發明優選的實例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用的細胞具有表型STRO-1bπ、ALP'在另外的優選實例中，MEMPS對一或多種的標記物Ki67、CD44和/或⑶49c/⑶29、VLA-3、α 3 β I是陽性的。在另外的優選實例中，MEMP不展示出TERT活性和/或對標記物CD18是陰性的。
[0144]STRO-1+細胞起始群體可以源自W001/04268或W02004/085630中所述的任意一或多種組織類型，即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚、或者或許是更廣泛地來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、胰、骨骼、韌帶、骨髓、腱、和骨骼肌。
[0145]應理解在實施本發明時，對攜帶有任何給定的細胞表面標記物的細胞所進行的分離，可以通過多種不同的方法實現，然而，優選的方法依賴于結合劑(例如，抗體或其抗原結合片段)對所關注的標記物的結合，隨后分離那些展現出結合的(為高水平結合的、或低水平結合的或未結合的)。最方便的結合劑是抗體或基于抗體的分子，優選是單克隆抗體或者基于單克隆抗體，這是由于后面這些物質的特異性。兩個步驟中都可以使用抗體，然而也可使用其它物質，因而也可使用這些標記物的配體以使攜帶(或缺乏)它們的細胞富集。
`[0146]抗體或配體可以附著于固體支持物以允許進行粗分離。分離技術優選將最大化的保持所要收集級分的活力。可以使用具有不同效率的各種技術以獲得相對粗糙的分離。所使用的具體即使將取決于分離的效率、相關的細胞毒性、操作的簡便和速度、以及成熟裝置和/或專門的技能的必要性。用于分離的程序可以包括，但不限于磁分離、使用抗體包被的磁珠、親和層析以及用附著至固體基質的抗體〃裝盤(panning)"。提供精確分離的技術包括但不限于FACS。用于進行FACS的方法對技術人員是顯見的。
[0147]針對每個本文所述標記物的抗體是商業可購的(例如，針對STRO-1的單克隆抗體可以購自R&D Systems, USA)、可得自ATCC或其它保藏機構和/或可以用本領域已知的方
法產生。
[0148]優選地，用于分離STRO-1+細胞的方法包括，例如，第一步即使用如磁激活細胞分選(MACS)的固相分選步驟識別STRO-1高水平的表達。如果需要的話，隨后可以是第二個分選步驟，以產生高水平的前體細胞表達，如專利說明書W001/14268中所述。此第二分選步驟可能涉及使用一或多種標記物。
[0149]獲得STRO-1+細胞的方法還可以在第一個富集步驟前包括使用已知技術收集細胞的來源。從而可以如外科手術般地去除組織。含有來源組織的細胞將會被分離至所謂的單一細胞懸液。可以通過物理的或者酶的手段來實現此分離。
[0150]一旦獲得了適宜的STRO-1+細胞群體，可以用適宜的手段將其培養或擴展以獲得MEMP。
[0151]在一個實例中，細胞取自要治療的對象，用標準技術體外培養并用于獲得所述上清液或可溶因子或擴展的細胞，用于作為自體同源的或同種異源的組合物施用于所述對象。在另外的實例中，使用已建立的一或多種人細胞系的細胞來獲得所述上清液或可溶因子。在本發明另一個有用的實例中，使用非人動物的細胞(或者如果患者不是人類，則所用細胞來自另外的物種)以獲得所述上清液或可溶因子.[0152]本發明的施行可以使用來自任何非人動物物種的細胞，包括但不限于非人靈長類細胞、有蹄動物、犬類、貓類、兔類、嚙齒類、禽類、和魚類細胞。可用來實行本發明的靈長類細胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、和任何其它新舊大陸的猴類的細胞。可用來實行本發明的有蹄類細胞包括但不限于牛類、豬類、棉羊類、山羊類、馬類、水牛和野牛的細胞。可用來實行本發明的嚙齒類細胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、和沙鼠細胞。可用來實行本發明的兔類物種的實例包括但不限于家兔、長腿野兔(jack rabbit)、野兔、棉尾兔、雪鞋兔(snowshoe rabbit)、和鼠兔(pika)。雞(Gallus gallus)是可用來實行本發明的禽類物種的實例。
[0153]可用于本發明的方法的細胞可以在使用前進行儲存，或者在獲得所述上清液或可溶因子前進行儲存。用于保存和儲藏真核細胞(特別是哺乳動物細胞)的方法和方案，是本領域已知的(參見例如，Pollard, J.W.and Walker, J.Μ.(1997)Basic Cell CultureProtocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R.1.(2000) Cultureof Animal Cells, Fourth Edition, ffiley-Liss, Hoboken, N.J.) ? 保持分離的干細胞如間充質干細胞/先祖細胞、或其后代的生物學活性的任何方法，都可以與本發明聯用。在優選的實例中，使用冷凍保存來維持和儲藏細胞。
[0154]經遺傳改誥的細朐
[0155]在一個實例中，STRO-1+細胞和/或其后代細胞是經過遺傳改造的，例如改造為表達和/或分泌感興趣的蛋白質，例如提供治療和/或預防益處的蛋白，如胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶，或者關聯或引起增強的血管發生的`多肽，或者與細胞分化成胰細胞或血管細胞相關聯的多肽。
[0156]用于遺傳改造細胞的方法對技術人員是顯見的。例如，把要在細胞中表達的核酸可操縱地連接至用于誘導在細胞中的表達啟動子。例如，將核酸連接至可在對象的多種細胞中操作的啟動子，如例如，病毒啟動子如CMV啟動子(例如CMV-1E啟動子)或SV-40啟動子。另外的適宜啟動子是本領域已知的，并且應該認為其經必要的修改可適用于本發明的實例。
[0157]優選以表達構建體的形式提供核酸。如本文所用，術語〃表達構建體〃是指核酸，其具有在細胞中表達其所可操縱地連接的核酸(例如報道基因和/或反選擇性報道基因)的能力。在本發明的背景中，應理解表達構建體可以含有或者本身就是質粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組-或基因組-片段、或者其它能夠以可表達的形式保持和/或復制異源DNA的核酸。
[0158]構建用于實行本發明的適宜表達構建體的方法對本領域技術人員是顯見的，并且在例如 Ausubel et al(In:Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience,ISBN047150338, 1987)或 Sambrook et al (In:MolecularCloning:Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories, New York, Third Edition2001)中有描述。例如，使用如PCR從適宜的模板核酸擴增表達構建體的每個組分，并隨后將其克隆至適宜的表達構建體內，如例如質粒或噬菌粒。
[0159]適宜于此種表達構建體的載體是本領域已知的和/或在本文有描述。例如，在哺乳動物細胞中適用于本發明方法的表達載體為，例如，由Invitrogen供應的pcDNA載體套件的載體、PCI載體套件的載體(Promega)、pCMV載體套件的載體(Clontech)、pM載體(Clontech)、pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontech)或 pcDNA 載體套件的載體(Invitrogen)。
[0160]技術人員會知道另外的載體和此類載體的來源，如例如InvitrogenCorporation、Clontech 或 Promega0
[0161]用于將分離的核酸或者含有其的基因構建體引入到細胞內以表達的方法是本領域技術人員所熟知的。用于給定生物體的技術取決于已知的成功技術。用于將重組DNA引入細胞的方法包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染如微粒轟擊脂質轉染胺(Gibco, MD, USA)和 / 或 cellfectin (Gibco, MD, USA)，PEG-介導的 DNA 攝取、電穿孔和微粒轟擊如微粒轟擊DNA-包被的鶴或金顆粒(Agracetus Inc., WI, USA)等。
[0162]或者，本發明的表達構建體是病毒載體。適宜的病毒載體是本領域已知的和商業可購的。常規的用于遞送核酸以及將該核酸整合至宿主細胞基因組內的基于病毒的系統包括，例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體，或者腺伴隨病毒載體。或者，腺病毒載體可用于將保持游離的核酸引入到宿主細胞內。表達載體是將基因轉移至靶細胞和組織的有效且通用的方法。此外，已經在許多種不同細胞類型和靶組織中觀測到高轉導效率。
[0163]例如，反轉錄病毒`載體通常包含順式作用長末端重復序列(LTR)，具有對外源序列高達6-10kb的組裝容量。最小的順式作用LTR就足以復制和組裝載體，其被用于將表達構建體整合至靶細胞內以提供長期的表達。廣泛使用的反轉錄病毒載體包括那些基于小鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、以及其組合的載體(參見例如，Buchscher et al.，JVirol.56:2731-2739(1992);Johann et al, J.Virol.65:1635-1640(1992);Sommerfelt et al, Virol.76:58-59(1990);Wilson et al, J.Virol.63:274-2318(1989);Milleret al., J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700;Miller and Rosman BioTechniques7:980-990, 1989;Miller, A.D.Human Gene Therapy7:5-14, 1990;Scarpa et alVirology75:849-852, 1991;Burns et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA90:8033-8037，1993)。
[0164]各種腺伴隨病毒(AAV)載體系統也被開發用于核酸遞送。AAV載體可以使用本領域已知的技術輕易地構建。參見例如，U.S.Pat.N0.5，173，414和5，139，941;International Publication N0.W092/01070 和 W093/03769;Lebkowski etal.Molec.Cell.Biol.5:3988-3996, 1988;Vincent et al.(1990)Vaccines90(Cold SpringHarbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology5:533-539, 1992;Muzyczka.Current Topics in Microbiol, and Immunol.158:97-129，1992;Kotin, HumanGene Therapy5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy7:165-169, 1994;以及Zhou et al.J Exp.Med.179:1867—1875，1994。
[0165]可用于遞送本發明的表達構建體的另外的病毒載體包括，例如，源自痘家族病毒的那些，如牛痘病毒和禽痘病毒或者甲病毒或綴合病毒載體(例如Fisher-Hoch etal., Proc.Natl Acad.Sc1.USA56:317-321，1989 中所述的)。
[0166]測定細胞和可溶因子的治療/預防潛力
[0167]用于確定細胞或可溶因子治療或防止或延緩胰功能異常的發作或進展的能力的方法對于技術人員將是顯見的。
[0168]例如，將細胞或可溶因子(例如，因子的混合物或單一的因子或因子的部分(例如，源自親和性純化或層析的))施用于測試對象(例如測試動物)一段時間并且是在某些條件下，從而足以提供治療性/預防性的益處，并且評估休眠或基礎或禁食的葡萄糖水平和/或進行葡萄糖耐受測試。使用商業可購的試劑盒和/或設備來進行此類測試。基礎或禁食葡萄糖水平在禁食后進行評估，例如，進行大約8至大約14小時。對于葡萄糖耐受測試，將對象禁食大約8至大約14小時然后消耗葡萄糖(例如，每千克體重大約1.75克的葡萄糖)并在大約2至3小時后評估葡萄糖的血液水平。根據世界衛生組織(WorldHealth Organization),禁食血衆葡萄糖應該是低于6.lmmol/1 (100mg/dl)。介于6.1和7.0mmol/1 (100和126mg/dl)之間的禁食水平是臨界(〃受損禁食糖血〃)，而反復處于或高于7.0mmol/1 (126mg/dl)的禁食水平是糖尿病的診斷。2小時葡萄糖水平應該低于
7.8mmol/l (140mg/dl)。介于此水平和11.lmmol/1 (200mg/dl)之間的水平表明受損的葡萄糖耐受。在2小時的葡萄糖水平高于11.lmmol/1 (200mg/dl)確認了糖尿病的診斷。
[0169]優選所述測試對象患有胰功能異常。例如，所述測試對象是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(I型糖尿病的模型)或者施用了鏈脲菌素的小鼠或大鼠(I型和/或II型糖尿病的模型；參見 Liikic et al., Developmental Immunol.6:119-128，1998 和 Arulmozhi etal., Indian J.Pharmacol., 36:217-221，2004), Goto Kakizaki (GK)大鼠(II 型糖尿病的模M ), New Zealand Obese (NZO)小鼠(II型糖尿`病的模型)。其它I型和/或II型糖尿病的模型在例如，Rees and Alcolado, Diabet.Med.22:359-70，2005 中有描述。
[0170]在此種胰功能異常模型中與未經治療的動物或治療前的測試對象相比降低基礎葡萄糖水平和/或改善葡萄糖耐受的細胞和/或可溶因子被認為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發作或進展。
[0171]作為選擇，或者此外，對測試對象的循環中的胰島素水平進行評估，例如，使用酶聯-或熒光聯-免疫吸附測定。在測試對象的循環中提高胰島素水平的細胞和/或可溶因子被認為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發作或進展。
[0172]用于確定血清胰高血糖素和促生長素抑制素水平的試劑盒和測定法是本領域已知的和 / 或商業可購，例如，來自 Immuno-Biological Laboratories, Inc 或 MilliporeCorporation 的。
[0173]作為選擇，或者此外，淀粉酶的血清水平是用色度測定法確定的，例如，如Caraway, Am.J.Clin.Pathol.，32:97-99，1959中所述，或者用熒光測定來確定，例如，如Rinderknecht and Marbach, Clin.Chem.Acta., 29:107-110，1972 中所述的。將血清淀粉酶水平維持在正常水平(例如，21-101U/L)的因子或細胞被認為可能治療或防止或延緩胰功能異常的發作或進展。[0174]淀粉酶水平還可以在胰切片中或在胰液中確定，例如，由經葉二指腸插管獲得的。這些樣品還提供了用于測量胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶水平的樣品。例如，Connon et al., Digestive Diseases andSciences, 23:472-475，1978描述了用于確定胰液中胰脂肪酶水平的測定法。
[0175]前段中所描述的測定法還適于對接受本文中根據任何實例所述治療的對象實行進行中的監測。
[0176]根據前文，對于技術人員顯見的是，本發明還提供了對用于治療胰功能異常的細胞或可溶因子進行鑒定或分離的方法，所述方法包括:
[0177](i)向患有胰功能異常的測試對象施用細胞或可溶因子并評估該對象的胰功能；
[0178](ii)將(i)中所述對象的胰功能，與患有胰功能異常但并未施用所述細胞或可溶因子的對照對象的胰功能進行比較，
[0179]其中所述測試對象中與對照對象相比改善了的胰功能表明該細胞或可溶因子治療緩胰功能異常。
[0180]本發明還提供了對用于防止或延緩胰功能異常的細胞或可溶因子進行鑒定或分離的方法，所述方法包括:
[0181](i)向測試對象施用細胞或可溶因子并繼而在該測試對象中誘導胰功能異常；
[0182](ii)將(i)中所述對象的胰功能，與患有胰功能異常但并未施用所述細胞或可溶因子的對照對象的胰功能進行比較，
[0183]其中所述測試對象中與對照對象相比改善了的胰功能表明該細胞或可溶因子防止或延緩胰功能異常的發作。`
[0184]所述細胞可以是本文中根據任何實例所描述的任何細胞。
[0185]細朐纟目合物
[0186]在本發明的一個實例中，STRO-1+細胞和/或其后代細胞以組合物的形式施。優選此種組合物包含藥物可接受載體和/或賦形劑。
[0187]術語〃載體〃和〃賦形劑〃是指物質的組合物，其在本領域中被常規用于促進活性化合物的儲存、施用、和/或生物活性(參見例如，Remington’s PharmaceuticalSciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)。載體還可以降低所述活性化合物的任何不期望的副作用。適宜的載體例如是穩定的，如不能與載體中的其它成分反應。在一個實例中，所述載體在用于治療的劑量和濃度不會再接受者中產生顯著的局部或全身性副作用。
[0188]適于本發明的載體包括常規使用的那些，例如，水、鹽水、水成葡聚糖、乳糖、Ringer溶液、緩沖溶液、透明質酸和乙二醇是優選的液體載體，特別是對于溶液而言(當等滲時)。適宜的藥物載體和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸那、單硬脂酸甘油鹽/酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、
乙醇等。
[0189]在另一個實例中，載體是介質組合物，例如，細胞在其中生長或懸浮。優選此種介質組合物不會在其所施用的對象中誘導任何副作用。
[0190]優選的載體和賦形劑不會對細胞的活力和/或細胞降低、防止或延緩胰功能異常的能力帶來不利的影響。[0191]在一個實例中，所述載體或賦形劑提供緩沖活性以將所述細胞和/或可溶因子維持在適宜的PH，由此發揮生物學活性，例如，所述載體或賦形劑是磷酸緩沖鹽水(PBS)。PBS是有吸引力的載體或賦形劑，因為其最低限度的與細胞和因子相互作用并且允許細胞和因子的快速釋放，在此種情況中，本發明的組合物可以被生產為液體以直接應用于血流或者進入組織或環繞或鄰近組織的區域，例如通過注射。
[0192]還可以將STRO-1+細胞和/或其后代細胞摻入或插入支架內，所述支架是接受者相容性的并且降解成對接受者無害的產物。這些支架向要移植入接受者對象中的細胞提供支持和保護。此類支架的實例有天然的和/或合成的生物可降解支架。
[0193]多種不同的支架可以成功的用于本發明的實踐。優選的支架包括但不限于生物的、可降解的支架。天然生物可降解支架包括，膠原、纖連蛋白、和層粘連蛋白支架。用于細胞移植支架的適宜的合成材料應該能夠支持廣泛的細胞生長和細胞功能。此種支架還可以是可吸收的。適宜的支架包括聚乙醇酸支架，例如Vacanti, et al.J.Ped.Surg.23:3-91988; Cima, et al.Biotechnol.Bioeng.38:1451991; Vacanti, et al.Plast.Reconstr.Surg.88:753-91991中所描述的；或者合成聚合物如聚酐、多正酯類、和聚乳酸。
[0194]在另一個實例中，所述細胞可以在凝膠支架中施用(如來自Upjohn Company的Gelfoam)。
[0195]可用于本發明的細胞組合物可以單獨施用或者作為與其它細胞的摻合物來施用。可以與本發明的組合物協同施用的細胞包括但不限于，其它多能或多潛能細胞或干細胞、或者骨髓細胞。不同類型的細胞可以在施用前才即時與本發明的組合物摻和，或者可以在施用前將它們一起共培養一段時間。
[0196]優選所述組合物包含有效量的或者治療或預防有效量的細胞。例如，所述組合物包含大約IxlO5個STRO-1+細胞/kg至大約IxlO7個STRO-1+細胞/kg或者大約IxlO6個STRO-1+細胞/kg至大約5xl06個STRO-1+細胞/kg。要施用的細胞的確切量取決于多種因素，包括患者的年齡、重量、和性別，以及胰功能異常的程度和嚴重性。
`[0197]在一些實例中，將細胞包含在室內使得該細胞不能進入對象的循環，然而該室卻允許所述細胞分泌的因子進入循環。以此方式，可以通過允許細胞將因子分泌至對象的循環內從而將可溶因子施用于該對象。此種室同樣可以被植入對象中的部位以提高所述可溶因子的局部水平，例如植入胰內或其附近。
[0198]在本發明的一些實例中，可能無須或者不期望在開始用細胞組合物治療前對患者進行藥理學的免疫阻抑。因此，在某些情況中移植同種異源或者甚至是異種異源的STRO-1+細胞或其后代是可以耐受的。
[0199]然而，其它情況中，在開始細胞治療前對患者進行藥理學的免疫阻抑是期望的或者適當的。這可以通過使用全身性的或局部的免疫阻抑劑來完成，或者可以通過在包囊化的裝置里遞送細胞來完成。可將所述細胞包囊在膠囊中，所述膠囊對于細胞所需的營養和氧氣以及治療因子是可滲的而該細胞對于免疫體液因子和細胞是不可滲的。優選包囊材料是低變應原性的、容易且穩定地位于靶標組織中、并且對植入的結構提供增加的保護。用于降低或消除對移植細胞的免疫應答的這些以及其它方法是本領域已知的。作為選擇，可以將細胞遺傳改造以降低其免疫原性。
[0200]可溶因子的組合物[0201]在本發明的一個實例中，源自STRO-1+細胞和/或后代細胞的上清液或可溶因子以組合物的形式施用，例如，包含適宜的載體和/或賦形劑。優選所述載體或賦形劑不會對所述可溶因子或上清液的生物學作用帶來不利影響。
[0202]在一個實例中，所述組合物包含物質的組合以使可溶因子或上清液的成分穩定，例如，蛋白酶抑制劑。優選所包含的蛋白酶抑制劑的量不足以給對象帶來不利影響。
[0203]含有源自STRO-1+細胞和/或后代細胞的上清液或可溶因子的組合物可以被制成適當的液體懸濁液，例如，在培養基中或者在穩定的載體或緩沖溶液中，例如，磷酸緩沖鹽水。適宜的載體在本文上文中有描述。在另一個實例中，含有源自STRO-1+細胞和/或后代細胞的上清液或可溶因子的懸濁液是用于注射的油懸濁液。適宜的親酯溶劑或媒介物(vehicle)包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯類；或脂質體。用于注射的懸濁液還可以含有提高該懸濁液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或葡聚糖。任選地，懸濁液還可以含有適宜的穩定劑或提高混合物溶解度的物質以使得可以制備高濃度溶液。
[0204]可以通過將所需量的上清液或可溶因子摻入到適當的溶劑(根據需要具有一種或一組上述的成分)中，從而制備無菌的可注射溶液，隨后進行過濾消毒。
[0205]通常，通過將所述上清液或可溶因子摻入到無菌的媒介物中而制備分散體，所述媒介物含有堿性分散介質以及所需的其它成分(如上所列舉的)。在用無菌粉末制備無菌可注射溶液的情況中，優選的制備方法是真空干燥和凍干，其從先前經過濾消毒的溶液產生所述活性成分加上另外所期望成分的粉末。根據本發明的作為選擇的方面，所述上清液或可溶因子可以與一或多種增強其可溶性的額外的化合物一起配制。
[0206]其它示例性的載體或賦形劑在如下中有描述，例如Hardman, et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork, N.Y.;Gennaro(2000)Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wil`kins, New York, N.Y.; Avis, et al.(eds.) (1993)PharmaceuticalDosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker,NY;Lieberman, et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY;Lieberman, etal.(eds.) (1990)Pharmaceutical Dosage Forms!Disperse Systems,MarceIDekker, NY;Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,MarcelDekker, Inc., New York, N.Y0
[0207]治療性組合物通常應該是無菌的以及在生產和儲存條件下穩定的。組合物可被配制成溶液、微乳劑、脂質體、或其它有序的結構。所述載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)、以及其適宜的混合物。可以通過如下來保持適當的流動性，例如通過使用包被如卵磷脂、在分散體的情況中通過保持所需的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑。在很多情況中，會優選在之外中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。可以通過在組合物中包含延緩吸收的物質如單硬脂酸鹽和明膠從而使可注射組合物的吸收延長。此外，可以在緩釋配制物中施用所述可溶因子，例如在包含緩釋聚合物的組合物中。活性化合物可以與保護該化合物以免快速釋放的載體一起制備，如控釋配制物，包括植入和微囊化的遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備此類配制物的許多方法已獲得專利或者通常是本領域技術人員已知的。
[0208]所述上清液或可溶因子可以與適當的基質組合施用，例如用于使所述可溶因子的緩釋。
[0209]組合物的另外的成分
[0210]所述源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代可與其它有益的藥物或生物分子(生長因子、營養因子)一起施用。當與其它物質一起施用時，它們可以與所述其它物質在單一的藥物組合物中一起施用、或者在分別的藥物組合物中施用、同時或者順序施用(在施用所述其它物質之前或之后)。可以共施用的生物活性因子包括抗凋亡劑(例如，EPO、EPO模擬抗體(mimetibody)、TPO、IGF-1和IGF-1I, HGF、胱天蛋白酶抑制劑);抗炎劑(例如，P38MAPK抑制、TGF-β抑制劑、抑制素、IL-6和IL-1抑制劑、PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIR0UMUS、和 NSAID (非甾體抗炎藥物；例如，TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPR0FEN);免疫阻抑/免疫調節劑(例如，鈣神經素抑制劑如環孢菌素、他羅利姆；mT0R抑制劑(例如，SIROUMUS、EVER0LIMUS);抗增殖劑(例如，硫唑嘌呤、嗎替麥考酚酯)；皮質類固醇類(例如，潑尼松龍、氫化可的松)；抗體如單克隆抗-1L-2Ra受體抗體(例如，巴利昔單抗、達克珠單抗)、多克隆抗-T-細胞抗體(例如，抗-胸腺細胞球蛋白(ATG);抗-淋巴細胞球蛋白(ALG);單克隆抗-T細胞抗體0KT3));抗-血栓形成劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack (右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗-凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達莫、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑、以及血小板抑制劑)；和抗-氧化劑例如，普羅布可、維生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉劑。
[0211]在一個實例中，如本文根據任何實例所描述的組合物包含用于治療或預防胰功能異常的額外的因子。例如，該組合物包含雙縮胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、苯甲酸衍生物、α -葡糖苷酶抑制劑、SGLT2抑制劑、和INGAP肽、二肽肽酶-1V抑制劑、胰島素致敏物(例如，PPAR激動劑或雙縮胍)、胰島素、胰島素模擬物、胰高血糖素受體拮抗劑、GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1受體激動劑；GIP、GIP模擬物、GIP受體激動劑、PACAP、PACAP模擬物、PACAP受體3激動劑；膽固醇降低劑(例如，HMG-CoA還原酶抑制劑、多價螯合劑、煙醇、煙酸)、PPAR α/gamma雙重激動劑或抗-肥胖化合物。
[0212]在另一個實例中，如本文根據任何實例所描述的組合物另外包含誘導或增強先祖細胞分裂成胰細胞的因子。示例性的因子包括，fct、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子或 TGF β。
[0213]在另一個實例中，如本文根據任何實例所描述的組合物另外包含誘導或增強先祖細胞分裂成血管細胞的因子。示例性的因子包括，血管內皮生長因子(VEGF)、源自血小板的生長因子O3DGF;例如，PDGF-BB)、以及FGF。
[0214]在另一個實例中，如本文根據任何實例所描述的組合物另外包含組織特異性定型細胞(TSCC)。對于這個，International Patent Application N0.PCT/AU2005/001445證明了施用TSCC和STRO-1+細胞可以導致TSCC的增殖增強。在一個實例中，TSCC是胰細胞，例如β細胞或胰細的混合物，例如朗格漢斯胰島。向對象施用此組合物可以導致例如β細胞胰島的產生增加。在另一個實例中，TSC是血管細胞。向對象施用此組合物可以導致脈管系統的產生增加，例如，在胰中增加，例如，導致遞送到胰的營養增加。
[0215]醫療設各
[0216]本發明還提供了用于本文根據任何實例所描述的方法(或在所述方法中使用時)的醫療設備。例如，本發明提供了注射器或導管或其它適宜的遞送設備，其中包含STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子和/或本發明的組合物。任選地，所述注射器或導管包裝有使用說明書用本文根據任何實例所描述的方法。
[0217]在另一個實例中，本發明提供了植入物，其包含STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子和/或本發明的組合物。任選地，所述植入物包裝有使用說明書用本文根據任何實例所描述的方法。適宜的植入物可以由支架(例如，如本文上文中所描述的)以及STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子所形成。
[0218]施用的方式
[0219]源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代可經手術植入、注射、遞送(例如，通過導管或注射器的方式)、或者另外可以直接或間接地施用于需要修復或加強的部位如胰、或者進入對象的血液系統。
[0220]優選所述的源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代被遞送至對象的血液系統。例如，所述的源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代被腸胃外遞送。示例性的腸胃外施用途徑包括，但不限于腹膜內、心室內、腦室內、鞘內。優選所述的源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代經動脈內遞送至大動脈內、遞送至心臟的心房或心室內、或者遞送至與胰連接的血管，例如腹部大動脈、上腸系膜動脈、胰十二指腸動脈或脾動脈。在另外的實例中，將源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+`細胞或其后代施用于股動脈腹腔動脈。
[0221]在細胞遞送至心臟的心房或心室的情況中，優選將細胞施用于左心房或心室以避免由細胞快速遞送至肺部所帶來的并發癥。
[0222]優選所述的源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代被注射至遞送部位，例如使用注射器或者通過導管或中心靜脈導線。
[0223]選擇用于治療配制物的施用方案取決于幾個因素，包括該實體的血清或組織周轉率、癥狀的水平、以及該實體的免疫原性。優選地，施用方案將遞送至患者的治療化合物的量最大化并與可接受的水平的副作用相協調。因此，所遞送的配制物的量部分取決于特定的實體以及要治療的病癥的嚴重性。
[0224]在一個實例中，源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代被作為單一的丸劑遞送。或者，源自STRO-1+細胞的上清液或可溶因子、STRO-1+細胞或其后代通過連續的灌輸而施用，或者通過例如I天、I周、或每周1-7次的間隔來給藥。優選的給藥方案涉及避免了顯著的不期望副作用的最大劑量或給藥頻率。每周的總劑量取決于所使用化合物的類型和活性。適當的劑量由臨床醫師確定，例如，使用本領域中已知或者懷疑會影響治療或者預計會影響治療的參數。通常，以稍低于最佳劑量的劑量開始，之后以小的增量增加直至達到期望的效果或者相對于任何負面的副作用的最佳效果。重要的診斷量度包括糖尿病癥狀的那些。
[0225]根據本發明用于治療或延緩胰功能異常的進展的實例，優選在對病癥的診斷后施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子，例如使用本領域已知的標準方法和/或本文所述的方法來診斷，例如葡萄糖耐受。
[0226]對于那些用于預防或延緩胰功能異常的發作的實例，優選在病癥的臨床診斷前施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或源自其的可溶因子，例如，當對象患有受損葡萄糖耐受和/或受損的禁食糖血時，和/或在自身免應答之前的或伴有自身免應答的I型糖尿病的情況，如由T細胞群體和/或B細胞群體的擴展所指示出的和/或由自身抗體的產生所指示出的(例如，在I型糖尿病的發作或進展中針對胰胰島細胞的細胞毒T細胞的擴展和/或針對一或多種胰β_胰島細胞標記物的自身抗體的擴展)。用于對自身免疫應答的發作進行確定或預測的方法對技術人員來說是顯見的和/或在本文中有描述。例如，檢測到針對源自胰細胞或在胰細胞表面的抗原自身抗體，表明了對象針對所述細胞的免疫應答。一種此類測定檢測對象血清中的胰島細胞抗體。此測定包括使含有胰島細胞的胰的切片接觸來自測試對象的血清。繼而用結合人免疫球蛋白的經標記的二抗來檢測來自對象的血清中的免疫球蛋白(其能夠結合胰β_胰島細胞)。用于檢測胰島細胞抗體的適宜的方法(其中使用熒光標記物)在例如Bottazzo et al，Lancet2:1279-83，1974中有描述。作為選擇，或者此外，使用測定法來檢測結合對象中特定抗原的自身抗體。舉例來說，Brooking et al.(Clin Chim Acta331:55-59，2003)描述了基于 ELISA 的測定法，用于檢測針對GAD65的自身抗體。所描述的測定法在微量滴定平板上使用低濃度的GAD抗原以捕獲樣品中的自身抗體。加入液態的生物素化GAD并且其被自身抗體的第二結合位點所捕獲，而且被檢測到產生非同位素的可探測信號的是經生物素化的GAD65。Nagata etal, Ann.New York AcacL Scil037:10-15，2004 描述了 ELISPOT 測定法，其可用于檢測針對胰島素、IA-2和GAD65的自身抗體的存在。
[0227]用于監測治療/預防的方法
[0228]用于監測治療/預防的方法在本說明書的基礎上對于技術人員來說將會是很顯然的。例如，血液葡萄糖水平和/或胰島素水平和/或淀粉酶水平用本領域公知的方法和/或本文所述的方法進行評估`。
[0229]在另一個實施例中，在處理之后獲得胰的樣品(例如，活組織檢查)，以及β細胞(例如，表達胰島素的細胞)和/或α細胞(例如，表達胰高血糖素的細胞)和/或胰島和/或PDX-1表達細胞的數目，例如使用免疫組織化學、免疫熒光、或核酸擴增測定法如聚合酶鏈反應(PCR)。此類測定法在本文中有描述。
[0230]本發明將在下述非限制性的實施例中進行進一步的描述。
[0231]實施例1
[0232]用STRO-1+細胞治療糖尿病小鼠
[0233]1.1材料和方法
[0234]小鼠中鏈脲菌素(STZ)-誘導的糖尿病
[0235]在第1-4天于4-h的午前禁食后，每天用35mg/kg的β -細胞毒素，鏈脲菌素(STZ; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)經腹膜內(1.p.)注射7-8周齡的雄性免疫缺陷NOD/scid 小鼠(NOD.CB17-Prkdcscld/J； Animal Research Centre, Perth, Australia) ? 將 STZ 溶解于pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液中，并在制備好后的15min之內注射。將小鼠保持在無菌條件下。[0236]細胞的灌輸和治療組
[0237]將經免疫磁性選擇的來自積累的骨髓細胞的人STRO-1+基質細胞基本上按照Gronthos 和 Zannetino (Methods Mol Biol.449:45-57, 2008)所述的那樣進行培養擴展，并且得自 Angioblast Systems, USA。將傳代 4，在 ProFreeze?-CDM(Lonza, USA)中低溫保存的STRO-1+基質細胞解凍，并對每個小鼠將2.5xl06的細胞配制到200 μ I的媒介物中用于立即注射。在第10天，STZ處理后，將每個NOD/scid小鼠，用單一劑量的細胞經胸壁注射入經麻醉小鼠的左心室(動脈途徑)。對照小鼠則通過動脈或靜脈途徑注射200 μ I的媒介物(含有 7.5%DMS0 和 a -MEM 的 ProFreeze?-CDM)。
[0238]對血液葡萄糖和胰島素的測定
[0239]在4_h 的午前禁食后，用葡萄糖計(Optimum Xceed? Diabetes MonitoringSystem; Abbott Diagnostics, Victoria, Australia)測定尾靜脈血液中的血液葡萄糖。通過使用小鼠特異的ELISA試劑盒(Ultrasensitive Mouse Insulin ELISAMercodia, Uppsala, Sweden),在第32天處死小鼠前通過對麻醉的小鼠進行心臟內穿刺(puncture)而獲得的血液中測定血液胰島素。
[0240]組織樣品的制備
[0241]通過斷頸法對小鼠實施安樂死，將胰摘除并對稱地切開，將一半在10%的中性福爾馬林中固定，而將另一半包埋入Tissue-Tek OCT Compound(SakuraFinetek, Torrance, CA)并在干冰上冷凍且儲存于_70°C。胰被特定地用于本研究中大部分的分析，而其它組織如肺、肝、心臟、脾、胃、腸/盲腸、膀胱、睪丸和腦則被收集用于組織病理學。
[0242]胰組織的組織學和`免疫熒光染色
`[0243]對于胰的組織學，將經福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色。將裝載至顯微鏡載玻片上的FFPE組織切片(5μπι)去石蠟化，并通過在高壓鍋中的檸檬酸鹽緩沖液中加熱而進行抗原恢復(antigen retrieval) ?在抗原恢復后用10%的正常山羊血清將該切片封閉2h并用于使用如下抗體(先前經測試和驗證可檢測經抗原恢復的組織中的小鼠特異性分子)的免疫熒光檢測:豚鼠抗-胰島素抗體(1:100; Millipore，USA)、小鼠抗-胰高血糖素抗體(10 μ g/ml;克隆 K79bB10; AbCAM)、小鼠抗-PDX-1抗體(10 μ g/ml;克隆267712 ;R&D Systems)。在2h的初抗溫育步驟之后，用1%的正常山羊血清/PBS將載玻片洗滌3次5min并在室溫與物種特異性二抗(1:400;山羊抗-小鼠Alexa Fluor555; Molecular Probe或山羊-抗-膝鼠羅丹明；JacksonLaboratories或山羊-抗-小鼠IgGl-FITC; AbCAM)進一步溫育90min。對照省略掉初抗。胰組織中平滑肌肌動蛋白(SMA)的染色通過使用小鼠抗-SMA-FITC mAb (2mg/ml;克隆1A4; AbCAM)的直接熒光染色來進行。
[0244]免疫染色的評估
[0245]在Zeiss Observer Zl顯微鏡(Germany)中觀察載玻片并用AxioCam MRm拍攝圖片。用Axio Vision Rel4.7軟件分析所拍攝的胰組織(經H&E或者針對胰島素、胰高血糖素、PDX-1和SMA的抗體染色并且經熒光探針檢測)的圖片。來自每個實驗動物的每個5mm的H&E切片被用于計數胰島的總數目以及分析胰島的大小(面積和直徑量度)并且針對每個相應的經圖像分析所測量的總切片面積進行歸一化(normalize)。此外，每個經抗原恢復的5 μ m FFPE切片(由抗-胰島素、胰高血糖素或PDX-1抗體染色)被計數陽性染色的細胞的總數目并且針對相應的經測量的總切片面積或總胰島面積來進行歸一化。通過圖像分析對不同直徑的胰微血管的分布進行計數以及測量，并且針對其相應的經檢驗的切片面積進行歸一化。所有的圖像均在20-40X的物鏡放大倍數下進行分析。
[0246]通過半-定量RT-PCR的RNA分析
[0247]來自實驗組胰的RNA樣品是在Trizol試劑中從來自每個冷凍組織的總共IOOmm的切片中提取的。用 illustra RNAspin Mini RNA Isolation試劑盒(GE Healthcare, UK)從該Trizol組織提取物中純化RNA。用分光光度計對總RNA進行定量并將I μ g用oligo-dT (pdT12-18)和MMLV反轉錄酶進行反轉錄。在表1所給出的擴增條件下用Tth PlusDNA聚合酶(Roche Applied Science)以及用針對鼠基因MafA、Ngn3、和Pdx-1的引物來將cDNA樣品進行PCR擴增。β-肌動蛋白基因被用于對靶基因的表達進行歸一化。用KodakID3.5軟件通過對UV-照射下可見條帶的光密度測定分析來對PCR產物進行定量。
[0248]表1.PCR 條件
[0249]
【權利要求】
1.用于在有需要的對象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
2.權利要求1的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的施用促進胰β細胞和/或胰島的再生。
3.權利要求1或2的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對象中降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對象中提高胰β細胞的數目和/或相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或降低胰α細胞的數目和/或提高胰島的數目。
5.權利要求1至4任一項的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對象的胰中提高胰和十二指腸同源異型框因子-1 (PDX-1)的表達和/或提高表達rox-1的細胞的數目。
6.權利要求1至5任一項的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的施用在所述對象的胰中誘導或促進動脈發生或血管發生。
7.根據權利要求1或6的方法，其中所述對象患有與胰的內分泌和/或外分泌功能相關的胰功能異常。
8.根據權利要求7的方法，其中所述胰功能異常關聯或引起異常水平的胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶。
9.根據權利要求8的方法，其中所述異常水平的胰高血糖素是由分泌胰高血糖素的腫瘤所引起的。
10.根據權利要求7的方法，其中所述胰功能異常關聯或引起營養的吸收障礙。
11.根據權利要求7的方法，其中所述胰功能異常關聯胰炎、胰機能不全，獲得性自身免疫缺陷綜合癥、癌癥、囊性纖維化或Zollinger Ellison綜合癥。
12.根據權利要求7的方法，其中所述胰功能異常導致低血糖或高血糖、降低的血清氨基酸水平、蛋白尿、或者壞死松解性游走性紅斑。
13.根據權利要求7的方法，其中所述胰功能異常關聯或引起碳水化合物代謝病。
14.根據權利要求7的方法，其中所述碳水化合物代謝病通過由胰所產生的胰島素的降低所引起或者通過由胰所產生的淀粉酶的降低所引起。
15.根據權利要求13或14的方法，其中所述碳水化合物代謝病是糖尿病。
16.根據權利要求1-15任一項的方法，其中將所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子直接施用至對象的血流中。
17.根據權利要求16的方法，其中動脈內施用所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子。
18.根據權利要求1-17任一項的方法，其中施用于對象的所述STRO-1+細胞是STRO-1b"、和/或表達組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)，和/或所述后代細胞和/或可溶因子衍生自是STRO-1b"和/或表達TNAP的STRO-1+細胞。
19.根據權利要求1-1 8任一項的方法用于治療或延緩胰功能異常的進展，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子在病癥的診斷后施用。
20.根據權利要求1-19任一項的方法，另外包括監測或探測胰功能異常的發病和/或進展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰島素水平、和/或β細胞的數目、和/或α細胞的數目、和/或胰島的數目、和/或rox-1表達細胞的數目、和/或rox-1表達的量和/或血管的數目。
21.根據權利要求1-20任一項的方法，其中所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子以組合物的形式施用，所述組合物包含所述STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子以及載體和/或賦形劑。
22.根據權利要求21的方法，其中所述組合物另外包含誘導或增強先祖細胞分化成血管細胞的因子，或者所述組合物包含組織特異性定型細胞。
23.STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物，其用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細胞的數目和/或用于相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或用于減少胰α細胞的數 目和/或用于提高胰島的數目；和/或 (vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達和/或用于提高胰中的rox-1表達細胞的數目；和/或 (vii)誘導或促進胰中的動脈發生或血管發生。
24.STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細胞的數目和/或用于相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或用于減少胰α細胞的數目和/或用于提高胰島的數目；和/或 (vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達和/或用于提高胰中的rox-1表達細胞的數目；和/或 (vii)誘導或促進胰中的動脈發生或血管發生， 的用途
25.STRO-1+細胞和/或其后代細胞和/或衍生自其的可溶因子在制備用于: (i)治療胰功能異常；和/或 (ii)改善胰功能；和/或 (iii)誘導或促進胰β細胞和/或胰島的再生；和/或 (iv)降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (v)提高胰β細胞的數目和/或用于相對于胰α細胞提高胰β細胞的數目和/或用于減少胰α細胞的數目和/或用于提高胰島的數目；和/或(vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-1(PDX-1)表達和/或用于提高胰中的rox-1表達細胞的數目；和/或 (vii)誘導或促進胰中的動脈發生或血管發生， 的藥物中的用途 。
【文檔編號】A61K35/12GK103800370SQ201310652234
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2009年11月19日 優先權日:2008年11月20日
【發明者】S·伊泰斯庫, R·克里希南 申請人:中胚有限公司