紐蘭格林及其用途

紐蘭格林及其用途
【專利摘要】本發明提供了特定的紐蘭格林多肽，能夠用于預防、治療或延遲各種疾病或紊亂的方法和組合物中。
【專利說明】紐蘭格林及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及對ErbB2受體有高親和力的神經調節蛋白及其治療各種心臟疾病及紊亂的用途。
【背景技術】
[0002]心臟(心室)肥大是對增大的心臟工作壓力或需求的一種重要的適應性生理反應。肥大刺激因素作用后發生的早期細胞變化之一是線粒體合成以及伴隨單個細胞大小成比例增加的肌原纖維擴增(室壁增厚)，但細胞數量沒有(或極少)增加。
[0003]當心室受到壓力時，最初的反應是肌小節長度的增加。隨后是總體肌肉量的增加。當負荷過于嚴重時，心肌收縮力將減弱。在最輕微的狀態，這種減弱體現為無負荷心肌收縮速度的減小或等長收縮時力量發展速率的減小。當心肌收縮力進一步減弱時，出現無負荷心肌縮短速度的更大程度下降，并伴隨等長收縮肌肉力量發展及收縮長度下降。此時，循環補償仍可由心臟擴大以及心肌質量的增加提供，它傾向于維持心室壁應力在正常水平。當收縮力繼續下降時，會出現明顯的充血性心衰，表現為心輸出量或工作力的下降，和/或心室舒張末期容積和舒張壓的上升。
[0004]從肥大到心衰的過渡以幾個細胞組織的變化為特征。例如，正常的肥大的細胞有較大的尺寸， 伴有增強的且有序的收縮單位以及較強的細胞-細胞粘連。反之，病理狀態的肥大的細胞，其尺寸亦較大并有蛋白聚集，表現出收縮蛋白的無序化(肌小節結構紊亂)以及較差的細胞-細胞粘附(肌纖維紊亂)。因此，在病理狀態的肥大中，細胞尺寸的增加以及收縮蛋白的聚集與肌小節結構的無序組裝和牢固的細胞-細胞相互作用的缺失相關聯。
[0005]大約有5百萬美國人患有心衰，并且每年新增病人在55萬以上。當前治療心衰的藥物主要集中于血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑，這些血管舒張劑引起血管擴張、降低血壓并減少心臟的工作量。雖然死亡率的百分數下降是具有統計學差異的，但使用ACE抑制劑后實際的死亡率下降平均僅為3%-4%，并且還有幾種潛在的副作用。
[0006]ACE抑制劑也與其他藥物聯用，比如洋地黃，能增加心臟收縮的力量；和/或某種利尿劑，通過引起腎臟排除血液中更多的鈉和水從而有助于減輕心臟的工作量。然而，至少有一項研究證明在I1-1II級心衰病人使用洋地黃與安慰劑相比，其生存率沒有什么差異。此外，利尿劑能改善心衰的某些癥狀，但不適宜用來單獨治療。
[0007]預防或治療心衰的其他選擇亦有相應的局限。比如，心臟移植顯然比藥物治療更昂貴及更具侵入性，并且還進一步受有無供體心臟的限制。使用機械裝置，比如雙心室心臟起搏器，同樣是侵入性的并且較昂貴。因此，由于當前治療手段的不足，需要有新的治療措施。
[0008]一種很有前途的新的治療手段包括給心衰患者或有心衰風險的患者施用紐蘭格林(此后稱為“NRG”)。NRGs由一個結構上相關的生長和分化因子家族組成，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其異構體。例如，已鑒定的NRGl的異構體超過15個，可以根據它們基本的表皮生長因子(EGF)類似區的差異分成α和β兩大類。NRG-1在如下文獻資料中被提及，如美國專利 5，530，109，5，716，930，7，037，888 ;Lemke, Mol.Cell.Neurosc1.1996, 7:247-262 ;Peles和Yarden, 1993, BioEssays 15:815-824，1993 ；Peles et al.,1992，Cell 69:205-216 ；ffen et al., 1992，Cell 69:559-572 ;Holmes et al., 1992，Science 256:1205-1210 ;Falls et al., 1993, Cell 72:801-815，Marchionni et al.,1993，Nature 362:312-8，以上內容通過引用完整的合并于此。NRG-2在如下文獻資料中提及，如 Chang et al., 1997, Nature 387:509-512 ；Carraway et al., 1997, Nature387:512-516 ；Higashiyama et al., 1997, J.Biochem.122:675-680 ；Busfield etal., 1997，Mol.Cell.Biol.17:4007-4014 和 WO 97/09425，以上內容通過引用完整的合并于此。NRG-3在如下文獻資料中提及,如Hi jazi et al., 1998, Int.J.0ncol.13:1061-1067，其內容通過引用完整的合并于此。NRG-4在如下文獻資料中提及，如Harariet al., 1999，Oncogene.18:2681-2689，其內容通過引用完整的合并于此。
[0009]NRG與EFG受體家族的成員結合，該受體家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4，其中每一個受體在多種細胞功能中都發揮重要的作用，包括細胞生長、分化和存活。它們都是蛋白酪氨酸激酶受體，由一個細胞外配體結合結構域、跨膜結構域和細胞質酪氨酸激酶結構域組成。NRG結合至ErbB3或ErbB4的細胞外結構域后，能夠誘導構象改變從而引起ErbB3、ErbB4和ErbB2之間形成異二聚體，或者ErbB4自身形成同源二聚體，這樣就會導致受體細胞內C-末端結構域的磷酸化。然后磷酸化的細胞內結構域與細胞內其他的信號蛋白結合，活化相應的下游AKT或ERK信號傳導途徑，并誘導一系列的細胞反應，比如刺激或抑制細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移或細胞粘附。在這些受體中，主要是ErbB2和ErbB4在心臟表達。
[0010]已有研究表明NRGl的EGF類似區，約50至64個氨基酸，足以結合并活化這些受體。以前的研究表明紐蘭格林-1 β (NRG-Ιβ )能以高親和力直接結合ErbB3和ErbB4。孤兒受體ErbB2能與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體并且其親和力比ErbB3或ErbB4同源二聚體要高。神經發育的研究結果提示交感神經系統的形成需要完整的NRG-1 β、ErbB2和ErbB3信號傳導系統。靶向破壞NRG-1 β、或ErbB2或ErbB4后由于心臟發育缺陷而導致胚胎致死。最近的研究也突顯了 NRG-1 β、ErbB2和ErbB4在心血管發育以及維持成年正常心臟功能方面具有重要作用。研究表明NRG-1 β能增強成年心肌細胞的肌小節的組織結構。短期施用一種重組的NRG-1 β EGF類`似區能顯著改善或防止三種不同心衰動物模型的心肌功能的惡化。更重要的是，NRG-1 β能顯著延長心衰動物的存活。這些效應使得NRG-1 β有望成為一種治療多種普通疾病導致的心衰的廣譜治療物或先導化合物。然而，仍然需要一種應用NRG的更有效的方法，可以在臨床上用來預防、治療或延遲心衰和/或心臟肥大。

【發明內容】

[0011]發明概沭
本發明的第一個方面是提供了對ErbB受體有高親和力的紐蘭格林多肽。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽包含神經調節蛋白的EGF功能域。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽包含人神經調節蛋白β 2異構體的EGF功能域。在某些實施方案中，對ErbB受體有高親和力的紐蘭格林多肽包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
[0012]本發明的紐蘭格林多肽比野生型全長神經調節蛋白對ErbB受體有更強的親和力。除了與ErbB受體連接，本發明的紐蘭格林多肽也具備一項或多項天然神經調節蛋白的生物功能。
[0013]紐蘭格林多肽的制備可以依據任何本【技術領域】內熟知的相關技術。在此提供制備紐蘭格林多肽的典型的技術。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽可以是重組的。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽是合成的，例如通過液相或固相肽合成。
[0014]本發明的另一個方面是提供了紐蘭格林多肽相關的核酸、載體以及宿主細胞。該核酸或其互補序列編碼紐蘭格林多肽或其中的片段。核酸可以是雙鏈或單鏈的DNA或RNA，能被插入到合適的載體中以便增殖和紐蘭格林多肽的表達。改造后的載體轉入到合適的宿主細胞內，如可表達重組紐蘭格林多肽的宿主細胞。
[0015]本發明的另一個方面是提供了紐蘭格林多肽在治療和非治療方面的應用。特別是紐蘭格林多肽在預防、治療或延遲各種心臟疾病及紊亂的應用。相應地，本發明提供包含紐蘭格林多肽的藥物制劑以及相關治療方法。
[0016]本發明的另一個方面是提供了治療哺乳動物心衰的方法。在某些實施方案中，該方法包括將紐蘭格林多肽注入哺乳動物體內。
[0017]本發明的另一個方面是提供了誘導細胞內ErbB受體磷酸化的方法。在某些實施方案中，該方法包括用紐蘭格林多肽接觸細胞。
[0018]本發明的另一個方明是提供了誘導并維持心臟細胞內的AKT信號通路的活化。在某些實施方案中，該方法包括用紐蘭格林多肽接觸心臟細胞。
[0019]本發明的另一個方明是提供了誘導并維持心臟細胞內的ERK信號通路的活化。在某些實施方案中，該方法包括用紐蘭格林多肽接觸心臟細胞。
[0020]圖片簡要說明` 圖1顯示不同濃度的NRG55、NRG57和NRG59對心肌細胞AKT磷酸化的影響。GADPH作為對照。
[0021]發明詳沭
L__釋義
除另有定義，這里使用的所有技術及科技術語與本發明所屬【技術領域】的普通技術人員理解含義相同。此處所提到的所有專利、申請、公開的申請以及其他出版物都通過引用完整的合并于此。如果本部分所提出的定義與通過引用合并于此的專利、申請、公開的申請以及其他出版物中提出的定義相反或不一致時，則以本部分提出的定義為準。
[0022]除非特別指明，在此所用“一個”的意思是“至少一個”或“一個或多于一個”。
[0023]此處所用“EGF樣功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所編碼的可以結合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其異源或同源二聚體的多肽片段，并且與下述參考文獻中描述的EGF受體結合區域具有結構相似性:W0 00/64400 ;Holmes等，Science,256:1205-1210 (1992);美國專利5，530，109 和 5，716，930 ;Hi jazi 等，Int.J.0ncol.,13:1061-1067 (1998) ；Chang 等，Nature,387:509-512 (1997) ；Carraway 等，Nature,387:512-516 (1997) ;Higashiyama 等，J.Biochem., 122:675-680 (1997)；以及 WO97/09425，以上內容通過引用完整的合并于此。在某些實施方案中，EGF樣功能域結合并激活ErbB2/ ErbB4或ErbB2/ ErbB3異源二聚體。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-1的受體結合區氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域是指NRG-1的第177-226位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-2的受體結合區氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-3的受體結合區氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含NRG-4的受體結合區氨基酸。在某些實施方案中，EGF樣功能域包含美國專利5，834，229中描述的氨基酸序列:Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys ValAsn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro(SEQ ID NO: 11)。
[0024]此處所用的治療特定疾病的活性成分的“有效劑量”是足以改善、或以某種方式減少該疾病相關癥狀的劑量。這一劑量也許能治愈疾病，但典型的情況下是用來改善疾病的癥狀。
[0025]此處所用的“活性成分”是用來診斷、治愈、緩解、治療或預防人或其他動物所患疾病，或者增強身體或心理健康的任何物質。
[0026]此處所用的特定紊亂癥狀的“改善”是指通過施用特定的活性成分而永久的或暫時地、持續或瞬時地減輕癥狀，而這一減輕能歸因于或與施用該試劑有關。
[0027]此處所用的“治療”或“處理”是指可以使不適、紊亂或疾病的癥狀改善或向好的方向改變的任何方式。其效果可以是預防性的，比如完全或部分防止某一疾病或其癥狀發生，也可以是治療性的，比如部分或完全治愈某一疾病和/或該疾病引起的不利影響。治療還包括此處所述組合物的任何藥物用途。
[0028]此處所用的“ 載體(或質粒)”是指用來將異源DNA引入細胞以在其中表達或復制的分散組件。選擇并使用這些載體對技術人員來說非常熟悉。表達載體包括能表達與調控序列連接之DNA的載體，調控序列如啟動子區能影響這些DNA片段的表達。因此，表達載體指重組的DNA或RNA組件，比如質粒、噬菌體、重組病毒或其他載體，當被引入適當的宿主細胞就導致克隆的DNA表達。適當的表達載體是本領域的技術人員廣知的，包括那些在真核細胞和/或原核細胞復制的載體以及那些保持游離的或那些整合到宿主細胞基因組的載體。
[0029]此處所用的“心肌細胞分化”是指以如下情況為特征的狀態，DNA合成減少10%以上、抑制其他因素刺激的DNA合成大于10%、有序的肌小節結合和細胞-細胞粘聯、MAP激酶的持續活化、以及p21eipl的增強表達。進一步的討論參見W000/37095，其內容通過引用完整地合并于此。
[0030]此處所用的“射血分數(ejection fraction)”或“EF”是指一次心搏從充滿的左心室泵出的血液的比例。可用下列公式來定義:(左心室舒張末期容積一左心室收縮末期容積)/左心室舒張末期容積。
[0031 ] 此處所用的“收縮分數(fractional shortening)”或“FS”是指左心室收縮狀態和舒張狀態直徑變化的比值。可用下列公式來定義:(左心室舒張末期內徑一左心室收縮末期內徑)/左心室舒張末期內徑。
[0032]此處所用的“心衰”是指心臟不能以代謝的組織需要的速度泵血的心功能異常。心衰包括多種疾病狀態如充血性心衰、心肌梗死、快速性心律不齊、家族性心肌肥大癥、缺血性心臟病、先天性擴張性心肌癥、心肌炎等等。心衰可以由多種因素引起，包括，但不限于:缺血的、先天的、風濕的、或原發形式。慢性心臟肥大是一種明顯的疾病狀態，是充血性心衰和心臟停跳的如兆。
[0033]此處所用的“心肌梗死”是指冠狀動脈阻斷或血流中斷導致的嚴重而持續的缺血引起的部分心肌的斑塊性壞死。[0034]此處所用的“肌小節或肌小節結構的有序的、增強的排列”是指通過心肌細胞中α_輔肌動蛋白免疫熒光染色展示的以收縮蛋白的整齊排列為特征的狀態。細胞中α-輔肌動蛋白的整齊排列可以通過顯微鏡及其相連的照相設備來識別。此處所用的“肌小節或肌小節結構的紊亂或不整齊”是與“肌小節或肌小節結構的有序的、增強的排列”相反的情況。
[0035]此處所用的“細胞骨架結構的有序的或增強的排列”是指心肌細胞中經鬼筆環肽(phal 1 i din )染色顯示的以肌動蛋白纖維有序排列為特征的狀態。細胞中肌動蛋白纖維的整齊排列可以通過顯微鏡及其相連的照相設備來識別，如本發明圖片中的例示。此處所用的“細胞骨架結構的紊亂或不整齊”是指與“細胞骨架結構的有序的，或增強的排列”相反的情況。
[0036]此處所用的“蛋白”與“多肽”或“肽”的含義相同，除非文中另有明確說明。
[0037]此處所用的“MAP激酶的持續活化”是指細胞中MAP激酶——p42/44的磷酸化狀態維持至少21小時。W000/37095里面有進一步的討論，其內容通過引用合并于此。
[0038]“協同的”，“協同效應”或類似術語在此是用來描述通過聯合一種或多種治療試劑和一種或多種維甲酸化合物而獲得的改善的治療效果。盡管在某些領域里面協同效應意味著大于加和的效果(例如，1+1=3)，但是在醫療領域，一種加和(1+1=2)或小于加和(1+1=1.6)效應也可以是協同的。比如，如果兩種藥物之一單獨施用可抑制50%的心室肌細胞肥大的擴展，就不能指望兩種藥物聯用可完全停止心室肌細胞肥大的發展。在許多情況下，由于不能接受的副作用，兩種藥物不能一起施用。在其他情況下，藥物之間相互拮抗，在聯合使用時減緩心室肌細胞肥大的發展小于50%。因此，如果兩種藥物合用減緩心室肌細胞肥大的發展大于50%且不增加不能接受的副作用，就獲得了協同效應。
[0039]此處所用的“心臟肥`大”是指特征如下的狀況:單個心室肌細胞大小的增加，細胞大小的增加足以導致對病人作出臨床診斷或足以認定細胞變大(例如，比非肥大細胞大兩倍或更多)。它可能伴隨著單個心肌細胞中收縮蛋白的積聚和胚胎基因表達的激活。
[0040]用來檢測心室肌細胞肥大的方法有體外法和體內法兩種。體外檢測心室肌細胞肥大的方法包括W000/37095中所描述的那些方法，比如細胞尺寸的增加以及心鈉素(ANP)表達的增加。細胞尺寸的改變被用于一種評分系統來測定肥大的程度。可用倒置相差顯微鏡來觀察這些改變，肥大的程度用人為的7-0的評分尺度來衡量，7分表示完全肥大的細胞，3分表示未刺激的細胞。3分和7分所代表的狀態可分別參見Simpson等(1982)CirculationRes.51: 787-801中的圖2A和B。肥大評分與細胞表面積(μ m2)的關系被發現呈線性(相關系數=0.99)。在苯腎上腺素誘導的肥大中，未暴露(正常)細胞的肥大評分為3，細胞表面積為581 μ m2 ;而完全肥大細胞的肥大評分為7，表面積為1811 μ m2，或約為正常值的200%。肥大評分為4的細胞的表面積為771 μ m2，或比未暴露細胞大約30% ;肥大評分為5的細胞的表面積為1109 μ m2，或比未暴露細胞大約90% ;肥大評分為6的細胞的表面積為1366 μ m2，或比未暴露細胞大約135%。存在心室肌細胞肥大主要包括細胞表現出約15%的尺寸增加(肥大評分3.5)或更多。通過上述分析方法評分可反映肥大誘導劑誘導最大肥大反應能力的不同。例如，內皮素(endothelin)誘導的細胞尺寸增加的最大值大約為肥大評分5分。
[0041]此處所用的“心臟肥大抑制”是指表征肥大的參數之一相對于肥大情況下有減小，或阻止表征肥大的參數之一相對于正常情況增大。例如，心室肌細胞肥大的抑制可通過測量細胞尺寸相對于肥大情況下減小來顯示。心室肌細胞肥大的抑制是指相對于肥大狀況下所觀察到的大小細胞尺寸要減小10%或更多。優選的條件下，肥大的抑制意味著細胞尺寸的減少在50%或以上。參照用苯腎上腺素為誘導劑時的肥大分析計分法，這些減少分別相當于肥大計分約6.5或更小、5.0-5.5、和4.0-5.0。當使用不同的誘導劑時，通過測量相對于誘導劑存在時的最大細胞尺寸(或肥大評分)的評分值來顯示抑制。
[0042]防止心室肌細胞肥大是通過阻止細胞尺寸在足以誘導肥大的誘導劑濃度下相對于正常細胞增加來確定的。例如，防止肥大是指在最大刺激濃度的誘導劑存在時細胞尺寸相對于未誘導細胞增加不到200%。優選的條件下，防止肥大意味著細胞尺寸相對于未誘導細胞增加小于135% ;最優選的條件下，防止肥大意味著細胞尺寸相對于未誘導細胞增加小于90%。相對于用苯腎上腺素為誘導劑時肥大計分分析法，在最大刺激濃度的苯腎上腺素存在時，防止肥大的肥大計分分別為約6.0-6.5,5.0-5.5、和4.0-5.0.肥大的體內測定包括測量心血管參數比如血壓、心率、體循環阻力、收縮力、心跳力量、向心性肥大或擴張性肥大、左心室收縮壓、左心室平均壓、左心室舒張末期壓、心輸出量、每搏指數(stroke index)、組織學參數、以及心室大小和室壁厚度。用來測定體內心室肌細胞肥大的發展和抑制的動物模型包括壓力過載小鼠模型、右室失功能小鼠模型、轉基因小鼠模型、以及心肌梗死大鼠模型。用來評估病人心室肌細胞肥大的存在、發展及抑制的醫學方法已廣為人知，包括測量舒張和收縮參數、評估心室重量以及肺靜脈流量。
[0043]肥大可來自任何對維甲酸有反應的因素包括先天性病毒的、先天的、心臟營養性的、肌肉營養性的因素，或者作為缺血或缺血性損傷比如心肌梗死的結果。典型的情況是，進行治療以阻止或減緩肥大的進程，尤其是在心臟損傷后，比如缺血發生后。優選的，為治療心肌梗死，試劑在心肌梗死后立即給予，以預防或減輕肥大。
[0044]此處所用的“活性單位”或“1U”是指能引起50%最大反應的標準產品的用量。換句話說，為了測定某一活性制劑的活性單位，必須測定EC50。例如，如果某一產品的EC50是0.067 μ g/ml，則這個量就是I個單位。進一步來說，如果使用了 Iyg該產品，就是使用了 14.93U(l/0.067)。可以用本領域已知的任何方法來測定EC50，包括下面的實施例中發明人所使用的方法。活性單位的測定對于遺傳工程產品和臨床使用藥物的質量控制是重要的，這樣可以使不同醫藥品和/或不同`批次的產品以同樣的標準來定量。
[0045]在某些例子中，紐蘭格林的單位是通過用激酶受體活化酶聯免疫吸附法(KIRA-ELISA)測量紐蘭格林的活性而確定的，如W003/099300和Sadick et al.，1996，Analytical Biochemistry, 235:207-14中詳細描述的，其內容通過引用而完整地合并于此。簡言之，該方法測量了紐蘭格林誘導的貼壁的乳腺癌細胞系MCF-7的ErbB2活化和磷酸化。用Triton X-100裂解液來溶解膜蛋白，其中的受體被包被在ELISA孔中的與ErbB3或ErbB4無交叉反應的ErbB2特異性抗體(如H4)捕獲。受體的磷酸化程度通過抗磷酸化酪氨酸抗體ELISA測定。
[0046]B.紐S格林
本發明提供的紐蘭格林多肽能結合ErbB受體。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽對ErbB受體親和力加強。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有神經調節蛋白EGF功能區域。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有人神經調節蛋白β 2異構體的EGF功能區域。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有SEQ ID NO: 3、5、7、9的氨基酸序列。[0047]在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。在更優的實施方案中，紐蘭格林多肽為SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
[0048]在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。在更優的實施方案中，紐蘭格林多肽為SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
[0049]在某些實施方案中，紐蘭格林多肽含有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。在更優的實施方案中，紐蘭格林多肽為SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
[0050]本發明的紐蘭格林多肽比野生型全長神經調節蛋白對ErbB受體有更強的親和力。除了與ErbB受體連接，紐蘭格林多肽也具備一項或多項天然神經調節蛋白的生物功倉泛。
[0051]紐蘭格林多肽的制備
紐蘭格林多肽的制備可以依據任何明顯的相關技術。制備紐蘭格林多肽的典型的技術可參見，如美國專利7, 226，907和5，367，060，W094/026298和W003/099300，其內容通過引
用完整地合并于此。
[0052]本發明紐蘭格林多肽的制備可以依據任何本【技術領域】內熟知的相關技術。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽是合成的，例如通過液相或固相肽合成，參見Merrifield，1963, J.Am.Chem.Soc.85:2149; Fields et al., 1990, Int J Pept Protein Res.35:161-214; Fields et al., 1991，Pept Res.4: 95-101，其內容通過引用完整地合并于此。
[0053]在優化的實施方案中，紐蘭格林多肽可以從天然資源、合成或商業途徑獲得。在某些實施方案中。在某些實施方案中，紐蘭格林多肽可以通過重組表達蛋白之后純化獲得。
[0054]紐蘭格林多肽可以用本領域已知的任何技術純化，如高效液相層析，離子交換層析，凝膠電泳，親和層析等。本領域技術人員熟知具體的紐蘭格林多肽的純化條件。
[0055]紐蘭格林多肽的使用
紐蘭格林多肽可以根據本領域的熟練技術人員判斷來施用。這方面的例子包括如下文件描述的方法:美國專利7，226，907和5，367，060，W094/026298和W003/099300，其內容通過引用完整地合并于此。
[0056]紐蘭格林多肽對治療一系列疾病和紊亂有效果。典型的疾病和紊亂包括心臟疾病如心衰，病毒性心肌炎，擴張(充血)型心肌病(DCM)，心臟毒性或心肌梗塞。
[0057]在某些實施方案中，本發明提供了一種方法，通過施用有效劑量的紐蘭格林多肽來治療心衰。
[0058]紐蘭格林多肽可能以藥物制劑的形式來施用。
[0059]紐蘭格林多肽的施用方式由本領域熟練的技術人員判斷，包括但不局限于口服、靜脈注射、灌胃給藥、直腸給藥、腹(膜)腔內給藥或腦室注射給藥。
[0060]在一個優選的實施方案中，用于給藥的組合物是藥物制劑。藥物制劑可以是含有預防或治療劑量的一種或多種預防或治療的藥劑(例如，含有紐蘭格林多肽和其他預防或治療藥劑的復合體)，和藥學上可接受的載體或賦形劑。在某個實施方案和本文中，“藥學上可接受的”是指已被國家相關部門通過的或是在美國制藥學或其他被廣泛認可的制藥學上記載的可用于動物特別是人身上的。“載體”是指稀釋劑、佐劑(如弗氏完全佐劑和不完全佐劑)、賦形劑或其它幫助 治療劑施用的載體。藥物載體可以是無菌的液體，如水和油，油包括石油、動物油、植物油或合成的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等之類的。通過靜脈注射藥物制劑時最佳的載體是水。在制備注射劑型合劑時，可以采用鹽水、葡萄糖和甘油液體。合適的藥學載體的例子在E.W.Martin寫的《雷明頓制藥學》(Remington’sPharmaceutical Sciences)中有描述。
[0061]典型的藥物制劑和劑型含有一種或多種賦形劑。合適的賦形劑藥學領域的熟練技術人員公知，包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、云母、氯化鈉、脫脂乳粉、丙烯、乙二醇、水、酒精等之類的。某種賦形劑是否適合整合到藥物制劑或劑型取決于該領域公知的很多因素，包括但不限于，劑型施用于病人的方式和劑型中的特殊的活性組分。如有需要，制劑或單一的劑型可以含有微量的濕潤劑、乳化劑或PH緩沖劑。
[0062]藥物制劑含有本領域熟知的賦形劑或是刊登在如美國藥典(USP) SP(XXI)/NF(XVI)上的賦形劑。一般來說，無乳糖制劑含有活性組分，粘合劑/填充劑，和藥學上兼容并且劑量可接受的潤滑劑。典型的無乳糖劑型含有活性組分，微晶纖維素，預糊化淀粉和硬脂酸鎂。
[0063]本發明的藥物制劑和劑型含有一種或多種降低活性組分分解速率的化合物。該化合物此處稱為“穩定劑”，它包括但不僅限于抗氧化劑如抗壞血酸，PH緩沖液或鹽緩沖液。
[0064]藥物制劑和單一劑型可采用以下形式:溶液、懸浮、乳劑、藥片、膠囊、粉末、持續釋放形式等之類。口服的制劑含有標準的載體如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。該藥劑和劑型含有預防或治療劑量的純化的起預防或治療作用的藥劑，為了能夠較好得施用給病人會和一定量的載體混合以賦形。藥劑形式應該適合給藥的方式。在優化的實施方案中，藥物制劑或單一劑型應該是無菌的并且以合適的形式施用，優選的是對象是動物，更優選的對象是哺乳動物，最優選的對象是人。
[0065]含有紐蘭格林的藥物制劑的形式應能適應其給藥方式。給藥方式包括但不局限于注射(比如靜脈、肌肉、皮下或皮內注射)、口服、口腔(如舌下)、吸入、鼻內、通過皮膚、局部、通過粘膜、腫瘤內、滑膜內和直腸給藥。在某個特定實施方案中，制劑的制定可參考某種常規程序，比如用來制備以靜脈或皮下或肌肉注射、口服、鼻內或局部給藥方式施用給人的藥物制劑的常規程序。在某個實施例中，藥物制劑的形式符合皮下注射給藥的常規方式。典型地，靜脈注射給藥方式的制劑是無菌等滲溶液。如有需要，該制劑也能含有增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因以便緩解注射部位的疼痛。
[0066]劑型包括但不局限于以下形式:藥片、囊片、膠囊如軟彈性明膠膠囊、扁囊劑、片齊?、錠劑、分散劑、栓劑、藥膏、泥罨劑(膏狀藥)、糊劑、粉末、敷料、乳劑、膏藥、溶液、藥物貼片、氣溶劑(如噴鼻劑或吸入器)、膠體；液體劑型適合口服或粘膜給藥的病人，液體劑型包括懸浮液(如含水或非水懸浮液、水包油乳化液或油包水乳化液)、溶液和萬能藥；液體劑型適合注射用藥的病人；無菌固體(如晶體或非晶體)可通過重構建變成適合注射用藥病人的液體劑型。
[0067]根據用途不同，紐蘭格林多肽的制劑、形狀和劑型類別也將不同。舉例來說，用于急性治療紊亂的劑型可能比相同疾病長期治療的劑型含有更多的紐蘭格林多肽。同樣地，針對不同癌癥有 治療效果的劑型也各不相同。類似地，注射劑型含有的活性組分的量比治療相同疾病或紊亂的口服劑型的量少。本領域熟練技術人員熟知上述制劑方式以及本發明中所包含的其它特殊劑型各不相同。詳見《雷明頓制藥學》，第18版，Mack出版社，伊斯頓，賓夕法尼亞州(1990)。
[0068]紐蘭格林多肽給藥可以根據本領域的熟練技術人員的判斷以任何途徑進行，包括但不局限于這些:口服、靜脈注射、灌胃給藥、十二指腸給藥、腹膜內給藥或腦室注射給藥。
[0069]C.劑量和給藥涂徑
本發明中的紐蘭格林的用量將隨著疾病或不適狀況的性質和嚴重程度的不同、以及活性組分的給藥途徑的不同而變化。給藥頻率和劑量也將隨著每一個病人的特殊因素而變化，取決于特定的治療(例如，治療性或預防性制劑)、機能紊亂、疾病、或不適的嚴重程度、給藥途徑、以及年齡、體重、反應情況、還有病人的既往用藥史。可以從體外或動物模型測試系統獲得的劑量-反應曲線來推測有效劑量。
[0070]紐蘭格林的可效仿的使用劑量包括給藥對象每公斤體重用多少毫克或微克的紐蘭格林(如，約I微克每公斤體重至約500毫克每公斤體重、約100微克每公斤體重至約5毫克每公斤體重、或約I微克每公斤體重至約50微克每公斤體重)。如給病人的用藥劑量，典型情況下是病人每公斤體重所用的活性肽的重量為0.001mg/kg-15mg/kg。適宜的用量還有:0.001mg/kg_15mg/kg、0.005mg/kg-10mg/kg、0.01mg/kg-5mg/kg>0.001mg/kg_4mg/kg、0.005mg/kg_3mg/kg、0.01mg/kg_2mg/kg、0.001mg/kg_lmg/kg、0.005mg/kg-0.5mg/kg、
0.010mg/kg-0.2mg/kg、0.005mg/kg-0.050mg/kg。
[0071]紐蘭格林的可效仿的使用劑量還包括給藥對象每公斤體重用多少單位(U)或單位量的紐蘭格林(如，約IU每公斤 體重至約5，000U每公斤體重、約IOU每公斤體重至約
1,000U每公斤體重、或約100U每公斤體重至約500U每公斤體重)。如給病人的用藥劑量，典型情況下是病人每公斤體重所用的活性肽的單位為10U/kg-l，OOOU/kg。適宜的用量還有:iu/kg-10, 000U/kg、lU/kg-5, 000U/kg、10U/kg-5，000U/kg、lOU/kg-1, 000U/kg、50U/kg-2, 000U/kg、50U/kg-l,000U/kg、50U/kg_500U/kg、lOOU/kg-1, 000U/kg、100U/kg_500U/kg、100U/kg-200U/kg。
[0072]一般而言，對于此處所描述的多種疾病，本發明的方法中所推薦的紐蘭格林每天的用量范圍為:每天約0.0Olmg至lOOOrng。特定情況下，每天的用藥總量的范圍可為:0.001mg_15mg、0.005mg_10mg、0.01mg_5mg、0.001mg_4mg、0.005mg_3mg、0.01mg_2mg、
0.001mg-lmg、0.005mg-0.5mg、0.01Omg-0.2mg。給病人安排治療時，開始可以用低劑量，比如每天約0.1 μ g-ι μ g,如果必要的話可以增至每天約20 μ g_l, 000 μ g,可以單劑量使用也可以分次使用，取決于病人的整體反應。在某些情況下，所用活性組分的劑量有必要超出此處所講的范圍，這對于本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。此外，應該指出的是臨床醫生或治療醫師應該知道根據病人個體的反應情況從而怎樣以及何時中斷、調整或終止治療。在一些具體情況下，紐蘭格林的使用量為約IU/天-10，000U/天。在某些具體情況下，紐蘭格林的使用量為約W天-5，000U/天。在某些具體情況下，紐蘭格林的使用量為約10U/天-2，000U/天。在某些具體情況下，紐蘭格林的使用量為約10U/天-1，000U/天。在某些具體情況下，紐蘭格林的使用量為約100U/天-200U/天。
[0073]紐蘭格林還可以通過劑量計劃表或“治療周期”來給藥。治療周期內每天的劑量在上面已經詳細列出。治療周期可以持續2天、5天、7天、10天、2周、3周、4周、5周或6周。
[0074]在一些具體情況下，在治療周期內每天都使用紐蘭格林。在某些具體情況下，在一個治療周期內紐蘭格林的持續用藥時間為3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天。在一些具體情況下，在一個治療周期的第一天給予紐蘭格林，在治療周期余下的一天或數天則不給予紐蘭格林。在某些具體情況下，在一個治療周期內，每天給予紐蘭格林并持續3、5、7或10天，該周期內余下的時間則不給藥。
[0075]
實施例
[0076]實施例1紐蘭格林多肽化學合成
紐蘭格林多肽NRG53(SEQ ID NO: 3)，紐蘭格林多肽NRG55 (SEQ ID NO: 4)，紐蘭格林多肽NRG57(SEQ ID NO: 5)，紐蘭格林多肽NRG59 (SEQ ID NO: 6)，紐蘭格林多肽NRG61(SEQ ID NO:1)由上海吉爾生化公司合成。
[0077]NRG61 含有如下氨基酸序列:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys ThrPhe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg TyrLeu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala SerPhe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln (SEQ ID NO:1)，即人NRG-1 氨基酸序列 177-237。
[0078]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcggaggagctgtac cag (SEQ ID NO: 2)。
[0079]紐蘭格林多肽EGF53的氨基酸序列如下:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu LysGlu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn ProSer Arg Tyr Leu Cys L`ys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe (SEQ ID NO: 3)。
[0080]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttc (SEQ ID NO:4)。
[0081]紐蘭格林多妝NRG55的氨基酸序列如下:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu LysGlu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn ProSer Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe Tyr Lys (SEQ ID NO: 5)。
[0082]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaag (SEQ IDNO: 6)0
[0083]紐蘭格林多妝NRG55的氨基酸序列如下:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu LysGlu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn ProSer Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe Tyr Lys (SEQ ID NO: 5)。[0084]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaag (SEQ IDNO: 6)0
[0085]紐蘭格林多妝NRG57的氨基酸序列如下:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu LysGlu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn ProSer Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu (SEQ ID NO: 7)。
[0086]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga g(SEQ ID NO: 8) o
[0087]紐蘭格林多妝NRG59的氨基酸序列如下:Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu LysGlu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn ProSer Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr ValMet Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu (SEQ ID NO: 9)。
[0088]上述氨基酸序列對應的核酸序列為:agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggagaaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgtgcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcggaggagctg (SEQ ID NO: 10)0
[0089]將上述多肽分別溶解在Buffer I (0.1M Na2HPO4,0.1M檸檬酸，6M尿素，ImMEDTA-Na2, 5mM DTT，pH8.0)中，濃度為lmg/ml，溶解液放置室溫I小時，將Iml溶解液和9mlBuffer 2 (0.01M Na2HPO4,0.01M 檸檬酸，6M 尿素，ImM EDTA-Na2?0.5mM GSSG，0.5mM GSH，pH8.0)混合，多肽終濃度為0.lmg/ml` ο再將混合液在室溫攪拌90分鐘，之后4°C放置16小時。用交聯葡聚糖凝膠G25分離樣本并收集溶解在Buffer 3(20mM Na2HPO4, 20mM NaH2PO4,ρΗ6.0)中。
[0090]實施例2受體與化學合成的紐蘭格林多肽的結合
收集MCF-7細胞，計數、離心并重懸于DMEM (10%血清，9 μ g/ml胰島素)中，細胞密度為5X104/ml。鋪96孔板，每孔加入100 μ I懸浮液，37°C過夜。第二天用PBS洗三遍細胞，換液用無血清DMEM培養24小時。
[0091]用包被緩沖液(50mMNa2CO3-NaHCO3,pH9.6)稀釋 ErbB2 抗體 H4 (ErbB2 單克隆抗體，澤生)到6μ g/ml，加到96孔板中，每孔50 μ I。4°C反應過夜使抗體與板結合。
[0092]吸去MCF-7 細胞中的 DMEM 培養液，將 NRG、NRG53、NRG55、NRG57、NRG59、NRG61用DMEM經連續稀釋后加入孔中，每孔100 μ I。空白對照僅加DMEM。37°C孵育20分鐘，用PBS緩沖液洗一遍，再加入100 μ I/孔裂解緩沖液(50mM Hepes, pH8.0,150mM NaCl，2mM原釩酸鈉，0.01%硫汞撒，1% Triton X-100和I片蛋白酶抑制劑混合偏/25ml )，4°C裂解30分鐘，之后輕晃板使細胞從板上脫落，離心15，OOOrpm 15分鐘。
[0093]抗體包被的板用洗液(IOmM PBS, ρΗ7.4,0.05% Tween 20)沖洗5遍，每孔加入200 μ I 5%脫脂牛奶的洗液，37°C孵育2小時，再用洗液洗3次。[0094]將裂解后的細胞液按每孔90 μ I加入相應的包被板中，37°C孵育I小時，之后用洗液洗5遍，加入100 μ I合適濃度的辣根過氧化氫酶(HRP)聯磷酸酪氨酸抗體(圣克魯斯生物技術)，37°C孵育I小時。洗液洗5遍，加入新鮮的準備好的HRP底物溶液(50mM檸檬酸，IOOmM Na2HPO4, pH5.0,0.2mg/ml 四甲基聯苯胺(TMB)，0.003%H202)，37°C共孵育 10 分鐘。最后每孔加入50 μ I 2Μ H2SO4破壞HRP活性以終止反應。在酶標儀(BIORAD Model 550)上測量450nm每孔OD值，EC50是達到最大吸光值一半的紐蘭格林多肽的濃度。EC50值越低，受體與紐蘭格林多肽的親和力越高。
[0095]NRG (全長野生型神經調節蛋白@2肽段)、殿653、殿655、NRG57、NRG59和NRG61的EC50值如表1所示。
[0096]表1 NRG、NRG53、NRG55、NRG57、NRG59 和 NRG61 的 EC50 值
【權利要求】
1.一種紐蘭格林多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1中前53、55、57和59的氨基酸。
2.權利要求1所述的紐蘭格林多肽，其氨基酸序列為SEQID N0:3。
3.權利要求1所述的紐蘭格林多肽，其氨基酸序列為SEQID N0:5。
4.權利要求1所述的紐蘭格林多肽，其氨基酸序列為SEQID N0:7。
5.權利要求1所述的紐蘭格林多肽，其氨基酸序列為SEQID N0:9。
6.一種藥物制劑，其含有紐蘭格林多肽以及藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:1中前53、55、57和59的氨基酸。
7.權利要求6所述的藥物制劑，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID N0:3。
8.權利要求6所述的藥物制劑，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID N0:5。
9.權利要求6所述的藥物制劑，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID N0:7。
10.權利要求6所述的藥物制劑，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID NO:9。
11.一種紐蘭格林多肽在用于制備治療心力衰竭藥物中的用途，包括給需要治療的個體施用有效劑量的紐蘭格林多肽，所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQ ID ΝΟ:1中前53、55、57和59的氨基酸。
12.權利要求11所述的用途，其中所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID NO:3。
13.權利要求11所述的用途，其中所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID NO:5。
14.權利要求11所述的用途，其中所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID NO:7。
15.權利要求11所述的用途，其中所述紐蘭格林多肽的氨基酸序列為SEQID NO:9。
16.權利要求11所述的用途，其中所述個體是人。
17.權利要求11所述的用途，其中紐蘭格林多肽是通過靜脈給藥的。
【文檔編號】A61P9/06GK103772498SQ201310645946
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2009年11月9日 優先權日:2009年11月9日
【發明者】周明東 申請人:上海澤生科技開發有限公司