一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用的制作方法

一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用，可有效解決基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備難題，并實現在腦腫瘤靶向治療藥物中的應用問題，方法是，利用殼聚糖上的活性氨基連接Angiopep-2，首先殼聚糖與3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺反應，使殼聚糖的氨基末端具有馬來酰亞胺，再與末端巰基化的Angiopep-2反應，得到殼聚糖-angiopep-2聚合物，將該聚合物應用于制備基于PLGA的靶向共載藥物傳遞系統的制備，本發明方法穩定可靠，產品使用效果好，能夠同時傳遞小分子化學藥物和基因藥物，或者同時傳遞化療藥物和熒光探針通過血腦屏障進入腦部，協同靶向治療腦腫瘤或靶向治療腦腫瘤與診斷于一體。
【專利說明】一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥，特別是一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA,或稱聚丙交酯-乙交酯共聚物)，由兩種單體——乳酸和羥基乙酸聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域。在美國PLGA通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。成為近年來備受青睞的載體材料之一，廣泛應用于藥物載體和醫用生物工程材料領域。在體內最終降解為0)2和1120。PLGA通過一定的技術可以有效攜帶蛋白質、抗體、多肽、藥物和核酸等生物活性物質進入細胞，從而成為人們關注的載體。
[0003]Angiopep-2是最新出現的新型祀向功能基團之一,它是蘇氨酸_苯丙氨酸_苯丙氨酸-酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴氨酸-精氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-苯丙氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-谷氨酸-酪氨酸19個氨基酸組成的短肽。研究表明，Angiopep-2與腦毛細血管內皮細胞和膠質瘤細胞均高表達的低密度脂蛋白受體相關蛋白具有親和性，可有效提高其跨血腦屏障和腦膠質瘤轉運效率。研究報道，Angiopep-2在腦實質細胞的分布容積是轉鐵蛋白的數倍。一個分子Angiopep-2和三個分子紫杉醇的結合物GRN1005正在美國進入抗腦膠質瘤的一期臨床研究。但是該結合物仍然水溶性差，應用時與Texol —樣，需要借助聚氧乙烯蓖麻油和乙醇作為增溶劑，所以仍然存在毒副作用大以及體內循環時間短等缺點。
[0004]鹽酸阿霉素、多西·他賽等小分子抗腫瘤藥物是腦毛細血管內皮細胞P-糖蛋白的底物，無法透過血腦屏障從而進入腦實質進而治療腦腫瘤。因此借助一定的靶向基團和納米載體可以克服血腦屏障遞送藥物入腦。
[0005]RNA干擾技術已在基因治療中應用多年，siRNA, shRNA，反義寡核苷酸等藥物具有高特異性及低毒副作用的特點，小量核酸片段即可有效沉默目的基因，抑制率較大，在腫瘤等疾病治療中是一顆耀眼的新星。基因藥物療效的發揮需要借助特定載體使其能夠被轉運進入細胞。
[0006]在腫瘤藥物研究中，利用熒光探針標記藥物，可以直接在活體水平觀察到藥物對腫瘤是否靶向、最佳靶向時間以及藥物在動物其他器官組織的積累，有利于研究人員在最佳的時間，進行組織分析。吲哚菁綠、酞菁等熒光探針不但能夠用于活體成像而且能夠吸收近紅外光，分子中的電子從基態躍遷至激態，隨后激發態的分子釋放出熱，具有熱療效果。常用于活體成像的熒光探針，大多數為傳統的有機染料分子，例如吲哚菁綠、酞菁、亞甲藍、羅丹明，異硫氰酸熒光素(FITC)，而這些有機染料分子有著其本身的一些缺點，如光穩定性差，靈敏度低和靶向性差等缺陷，因而限制了其進一步的應用。借助靶向納米粒載體可以克服上述缺陷，對腫瘤的診斷和靶向治療具有明顯優勢。
[0007]為了實現腫瘤的治療，單獨的化療藥物往往需要很大劑量才具有抗腫瘤療效，然而同時也帶來了一定的毒性，例如阿霉素的心臟毒性。因此化療藥物同其它治療技術的聯合應用成為腫瘤治療的一個重要技術手段。那么如何實現基于PLGA共聚物的靶向共載藥物傳遞系統，并實現在腦腫瘤靶向治療藥物中的應用，至今未見有公開報導。

【發明內容】

[0008]針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法及應用，可有效解決基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備難題，并實現在腦腫瘤靶向治療藥物中的應用問題。
[0009]本發明解決的技術方案是,利用殼聚糖上的活性氨基連接Angiopep-2,首先殼聚糖與3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺反應，使殼聚糖的氨基末端具有馬來酰亞胺，再與末端巰基化的Angiopep-2反應,得到殼聚糖-angiopep-2聚合物,將該聚合物應用于制備基于PLGA的靶向共載藥物傳遞系統的制備。制備共載化療藥物和基因藥物的靶向PLGA傳遞系統納米粒的方案是，將PLGA、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中，制備成油相；將表面活性劑和殼聚糖-angiop印-2聚合物溶解于無RNA (核糖核酸，以下同)酶的水中，制備成水相，油相加入水相中，磁力攪拌或旋蒸除去有機溶劑，經離心或透析除去游離藥物，制成PLGA載藥納米粒，將基因藥物加入納米粒溶液中，得到基于PLGA共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒，該納米粒可有效用于制備治療腦腫瘤靶向的藥物中。制備共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA傳遞系統納米粒的方案是，將PLGA、化療藥物、熒光探針和輔料溶解于有機溶劑中，制備成油相；將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于無RNA酶的水中，油相加入水相中，磁 力攪拌或旋蒸除去有機溶劑，最后經離心或者透析除去游離藥物，得到共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒。
[0010]本發明方法穩定可靠，產品使用效果好，可以作為藥物共載體系，能夠同時傳遞小分子化學藥物和基因藥物，或者同時傳遞化療藥物和熒光探針通過血腦屏障進入腦部，發揮協同靶向治療腦腫瘤或靶向治療腦腫瘤與診斷于一體之功效，是腦腫瘤治療藥物上的創新，有巨大的經濟和社會效益。
【具體實施方式】
[0011]以下結合具體情況和實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0012]由上述
【發明內容】
部分的給出技術方案，本發明在具體實施時，是由以下步驟實現的:
(I)、殼聚糖-angiopep-2聚合物的制備,方法是:
a、將殼聚糖20mg加入體積濃度為20%的乙酸溶液8mL中，在功率為300-500W超聲溶解30min,用5M (即5mol/L) NaOH溶液調pH值至6.0，得殼聚糖溶液；
b、在殼聚糖溶液中加入3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下、300C、100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量為8KD-14KD的透析袋中在PBS中透析60h，除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯，得透析液；
C、然后在透析液中加入巰基化的Angiopep-2 2mg,在氮氣保護下、35°C、100-200r/min攪拌反應24h,得Angiopep-2修飾的殼聚糖，再置于截留分子量為8KD-14KD的透析袋中透析48h,除去游離的Angiopep-2,在_80°C冷凍真空干燥72h,得殼聚糖-angiopep-2聚合物，于-20°C貯存備用；
所述的巰基化的Angiopep-2為羧基末端為半胱氨酸的angiopep-2或angiopep-2與Traut’ s反應得到的巰基化angiopep-2中的一種。所述的羧基末端連接有半胱氨酸的angiopep-2為，在合成angiopep-2時，一個分子angiopep-2羧基末端通過化學反應連接一個分子的半胱氨酸；所述的angiopep-2與Traut’ s反應后得到的巰基化的angiopep-2為，將Angiopep-2 5mg溶于20mL超純水中，加入IOmg Traut’s試劑，50°C超聲Ih,使得Angiopep-2的末端具有巰基，然后置于截留分子量為8KD_14kD的透析袋中在PBS中透析48h,除去游離的angiopep-2和Traut’s,透析液在_80°C冷凍真空干燥72h,得到巰基化的Angiopep-2 ；
(2)、制備共載化療藥物和基因藥物的靶向PLGA納米粒，方法是:
a、將PLGA共聚物、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中(P LGA共聚物的濃度為5mg-50mg/ml,化療藥物的濃度為lmg/ml-10mg/ml,輔料的體積濃度為0.5%_1%),制備成油相； 所述的有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一種或兩種以上的組合物；所述的PLGA共聚物為聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯:乙交酯的重量比為為25: 75,50: 50,75: 25 中的一種，PLGA 的分子量為 17kD，50KD，IOOkD 中的一種。所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、5-氟尿嘧啶中的一種；所述的輔料為司盤80、吐溫20、吐溫80中的一種或兩種以上的組合物；
b、將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值為6的無RNA酶水中，制備成水相(表面活性劑濃度為5mg/ml-50mg/ml,殼聚糖-angiopep-2的濃度為0.02mg/ml_2mg/ml)；
所述的PH值為6的無RNA酶水是，先將水中加入1%。體積的焦碳酸二乙酯，25°C、500r/min磁力攪拌12h，121 °C、102.9kPa條件下滅菌30min，用乙酸調pH值為6，成pH值為6的無RNA酶水；所述的表面活性劑為泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、膽酸鈉、卵磷脂的一種或兩種以上的組合物；
C、將油相滴加入水相中(水相與油相的體積比為4-10)，得到荷載正電荷PLGA共聚物載藥納米粒，經攪拌或旋蒸除去有機溶劑，得除去有機溶劑后的PLGA共聚物載藥納米粒溶液；
d、將除去有機溶劑后的PLGA共聚物載藥納米粒溶液經離心除去游離藥物，或透析除去游離藥物，再將基因藥物加入納米粒溶液中，得共載化療藥物和基因藥物的靶向藥物傳遞系統納米粒；
(3)共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒，方法是:
a、將PLGA共聚物、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中(PLGA共聚物的濃度為5mg-50mg/ml,化療藥物的濃度為lmg/ml-10mg/ml,輔料的體積濃度為0.5%_1%),制備成油相；所述的有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一種或兩種以上的組合物；所述的PLGA共聚物為聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯:乙交酯的重量比為為
25: 75,50: 50,75: 25 中的一種，PLGA 的分子量為 17kD，50KD，IOOkD 中的一種。所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、5-氟尿嘧啶的一種或兩種以上的組合物；所述的輔料為司盤80、吐溫20、吐溫80中的一種或兩種以上的組合物；所述的熒光探針為吲哚菁綠、酞菁、香豆素-6、異硫氰酸熒光素(FITC)、亞甲藍、羅丹明中的一種。
[0013]b、將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值為6的無RNA酶水中(表面活性劑濃度為5mg/ml-50mg/ml,殼聚糖-angiopep-2的濃度為0.02mg/ml-2mg/ml),制備成水相；
所述的pH值為6的無RNA的酶水是，先將水中加入1%。體積的焦碳酸二乙酯，25°C、500r/min磁力攪拌12h，用乙酸調pH值為6，121°C、102.9kPa條件下滅菌30min，成pH值為6的無RNA酶水；所述的表面活性劑為泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、膽酸鈉、卵磷脂的一種或兩種以上的組合物；
C、將油相滴加入水相中(水相與油相的體積比為4-10)，經攪拌或旋蒸除去有機溶劑，得除去有機溶劑的共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA共聚物載藥納米粒溶液，經離心除去游離藥物，或透析除去游離藥物，得最終的共載化療藥物和熒光探針的靶向藥物傳遞系統納米粒；
共載化療藥物和基因的靶向PLGA共聚物納米粒，作為藥物，有效用于腦腫瘤治療，實現共載化療藥物和基因的靶向PLGA共聚物納米粒在治療腦腫瘤藥物中的應用；
共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA共聚物納米粒，作為藥物，有效用于化療和熒光探針在腦腫瘤治療、診斷中，實現共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA共聚物納米粒在腦腫瘤治療、診斷藥物中的應用；
所述的腦腫瘤為U87、U251膠質瘤細胞,毛狀星細胞瘤,星細胞瘤,分化不良星細胞瘤，多型性神經母細胞瘤中的一種。
[0014]為了進一步詳細說明本發明的具體實施方案，特給出以下實施例:
實施例1
(I)、殼聚糖-angiopep-2聚合物的制備,方法是:
a、將殼聚糖20mg加入體積濃度為20%的乙酸溶液8mL中，在功率為500W超聲溶解30min,用5M (即5mol/L) NaOH溶液調pH值至6.0，得殼聚糖溶液；
b、在殼聚糖溶液中加入3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下、300C、100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量8kD_14kD的透析袋中在1000mL PBS中透析60h，除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯，得透析液；
C、稱取Angiopep-2 5mg溶于20mL超純水中，加入IOmg Traut’s試劑，超聲Ih,溫度為50° C，使得Angiop印-2的末端具有巰基，置于截留分子量為8kD_14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h,除去游離的angiopep-2和Traut’s,透析液在_80°C冷凍真空干燥72h,得到巰基化的angiopep-2 ；
d、在步驟b中透析液中加入步驟c制備得到的巰基化的Angiopep-2 2mg,在氮氣保護下、35°C、100-200r/min攪拌反應24h，得Angiop印-2修飾的殼聚糖，再置于截留分子量為8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h,除去游離的Angiopep-2,在_80°C冷凍真空干燥72h,得殼聚糖-angiopep-2聚合物，于-20°C|C存。
[0015]實施例2
殼聚糖-angiopep-2聚合物的合成
1)稱取殼聚糖20mg，加入8mL20%乙酸溶液，500W超聲溶解，用5MNaOH調pH至6.0 ;
2)上述殼聚糖溶液中，加入3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下加熱30° C，100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量8kD_14kD的透析袋中在1000mLPBS中透析除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酸亞胺酯，透析60h ；
3)取出透析袋中的溶液，加入末端為半胱氨酸的Angiopep-2(在合成Angiopep-2的時候羧基末端加一個半胱氨酸)，在氮氣保護下加熱攪拌使其充分反應，Angiopep-2修飾的殼聚糖置于截留分子量為8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，以除去游離的Angiop印-2，最后-80° C冷凍干燥72h后，貯存于_20°C冰箱。
[0016]實例3
共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒的制備
1)稱取IOOmgPLGA(聚丙交酯:乙交酯=50: 50，分子量為17kD)，溶解于IOmL丙酮中，制備得到PLGA貯備液(10mg/mL)，稱取15mg鹽酸阿霉素，溶解于5mL甲醇中，得到鹽酸阿霉素忙備液(3mg/mL)；· 2)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmLpH值為6的無RNA酶水溶液中，溶解完全后，加入殼聚糖-Angiopep-2 62.5mg,超聲溶解完全,作為水相；
3)取5mL鹽酸阿霉素貯備液，加入IOmLPLGA儲備液(10mg/mL)中，超聲lmin，作為油相，把油相以lmL/min的速度逐滴在攪拌條件下(IOOrpm)加入60mL水相中，然后探頭超聲(功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次)。在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇。以12000rpm離心60min,棄去上清液得到納米粒；
4)納米粒pH值為6的無RNA酶水分散，_80°C冷凍干燥72h得到凍干的納米粒。使用時用無RNA酶分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數設置為0.010，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，以Z平均統計值作為測定結果，每一水平納米粒溶液均配制3份，每份測量三次，取三次測量值的平均值作為測量結果，介電常數設置為79，黏度系數設置為0.8872，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，所得結果為粒徑為100~200nm，電位為+38mV~+18mv ；
5)配制不同質量比的納米粒和EGFRsiRNA混合物,室溫下孵育20min,通過瓊脂糖凝膠電泳泳道條帶亮度及位置確定納米粒完全負載siRNA兩者的比例，納米粒和siRNA質量比為30~90時，納米粒能夠完全負載siRNA ；
上述步驟5中的siRNA序列為:
SenseS' _3'GUG UGU AAC GGA AUA GGU ATT
AnsenseS' -3' UAC CUA UUC CGU UAC ACA CTT。
[0017]實例4
共載多西他賽和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒的制備1)稱取150mgPLGA(聚丙交酯:乙交酯=50: 50，分子量為17kD)和45mg多西他賽，溶解于15mL丙酮中，作為油相，PLGA濃度為10mg/mL,多西他賽濃度為3mg/mL ;
2)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmLpH值為6的無RNA酶水中，溶解完全后，用乙酸調節pH至6.0,加入殼聚糖-angiopep-2約62.5mg,超聲溶解完全,作為水相；
3)取15mL油相以lmL/min的速度逐滴在攪拌條件下(IOOrpm)加入60mL水相中,然后探頭超聲(功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次)。在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇。以12000rpm離心60min,棄去上清液得到納米粒；
4)納米粒用pH值為6的無RNA酶水分散，_80°C冷凍干燥72h得到凍干的納米粒。使用時用無RNA酶水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數設置為0.010，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，以Z平均統計值作為測定結果，每一水平納米粒溶液均配制3份，每份測量三次，取三次測量值的平均值作為測量結果，介電常數設置為79，黏度系數設置為0.8872，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，所得結果為粒徑為100~200nm，電位為+38mV~+18mv ；
5)配制不同質量比的納米粒和siRNA混合物，室溫下孵育20min，通過瓊脂糖凝膠電泳泳道條帶亮度及位置確定納米粒完全負載siRNA兩者的比例，納米粒和siRNA質量比為30~90，納米粒能夠完全負載siRNA ；
上述步驟5中的siRNA序列為:
SenseS' _3'GUG UGU AAC GGA AUA GGU ATT
AnsenseS' -3' UAC CUA UUC CGU UAC ACA CTT。
[0018]實例5
共載多西他賽和香豆素-6的靶向PLGA納米粒的制備
1)稱取IOOmgPLGA(聚丙交酯:乙交酯=50: 50，分子量為17kD)和30mg多西他賽，溶解于丙酮中，制備得到PLGA和多西他賽的貯備液，PLGA濃度為10mg/mL，多西他賽濃度為3mg/mL ；
2)稱取Img香豆素_6，溶解于IOmL丙酮中，得到香豆素_6貯備液(0.lmg/mL)；
3)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmL超純水中，溶解完全后，用乙酸調節pH至6.0，加入殼聚糖-angiopep-2約62.5mg,超聲溶解完全,作為水相；
4)取香豆素-6I&備液(0.lmg/mL) 5mL,加入(I)中所制PLGA和多西他賽忙備液ImL中，500W超聲lmin,作為油相。把油相以lmL/min的速度逐滴在攪拌條件下(IOOrpm)加入60mL水相中，然后探頭超聲(功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次)。在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇，以12000rpm離心60min，棄去上清液得到納米粒;
5)納米粒用超純水分散，-80°C冷凍干燥72h得到凍干的納米粒。使用時用超純水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數設置為
0.010，溫度設置為25 °C，測量模 式設置為自動，以Z平均統計值作為測定結果，每一水平納米粒溶液均配制3份，每份測量三次，取三次測量值的平均值作為測量結果，介電常數設置為79，黏度系數設置為0.8872，溫度設置為25 V，測量模式設置為自動，所得結果為粒徑為100~200nm,電位為+38mV~+18mv。
[0019]實例6共載多西他賽和吲哚菁綠的靶向PLGA納米粒的制備
1)稱取IOOmgPLGA(聚丙交酯:乙交酯=50:50，分子量為17kD)和30mg多西他賽，溶解于丙酮中，制備得到PLGA和多西他賽的貯備液，PLGA濃度為10mg/mL，多西他賽濃度為3mg/mL ；
2)稱取Img吲哚菁綠，溶解于IOmL甲醇中，得到吲哚菁綠貯備液(0.lmg/mL)； 3)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmL超純水中，溶解完全后，用乙酸調節pH至6.0，加入殼聚糖-angiopep-2約62.5mg,超聲溶解完全,作為水相；
4)取吲哚菁綠貯備液(0.lmg/mL)5mL，加入(I)中所制的PLGA貯備液和多西他賽貯備液IOmL中，500W超聲lmin，作為油相，把油相以lmL/min的速度逐滴在攪拌條件下(IOOrpm)加入60mL水相中，然后探頭超聲(功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次)，在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇，以12000rpm離心60min，棄去上清液得到納米粒；
5)納米粒用超純水分散，-80°C冷凍干燥72h得到凍干的納米粒。使用時用超純水分散。使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數設置為
0.010，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，以Z平均統計值作為測定結果。每一水平納米粒溶液均配制3份，每份測量三次，取三次測量值的平均值作為測量結果。介電常數設置為79，黏度系數設置為0.8872，溫度設置為25 °C，測量模式設置為自動，所得結果為粒徑為100~200nm,電位為+38mV~+18mv。
[0020]吲哚菁綠對近紅外的吸光能力特別強，對于780nm的光，有文獻報道，相同質量的吲哚菁綠吸收光的能力是單壁碳納米管的7倍多，是納米金棒的8500倍以上。本實施例中共載多西他賽和吲哚菁綠的PLGA靶向納米粒可以有效的輸送吲哚菁綠和多西他賽進入腦部，通過外部808nm激光發揮吲哚菁綠熱療效果，以期能夠取得熱療和化療聯合治療腫瘤的作用。
[0021]共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒攝取進入腦腫瘤細胞U87MG或U251MG以及透過血腦屏障，實現腦腫瘤的治療；
共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒抑制體外腫瘤細胞U87MG或U251MG，實現腦腫瘤的治療；
共載化療藥物和基因藥物或共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒抑制體內腫瘤A,實現腦腫瘤的治療；所述腫瘤A為所述的腦腫瘤為U87、U251膠質瘤細胞,毛狀星細胞瘤，星細胞瘤，分化不良星細胞瘤，多型性神經母細胞瘤中的一種。
[0022]上述共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒攝取進入腦腫瘤細胞U87MG或U251的評價采用激光共聚焦顯微鏡，觀察腦腫瘤細胞U87MG或者U25IMG經過共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒作用lh，2h，3h后細胞內的熒光分布情況。
[0023]上述共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒透過血腦屏障能力的評價采用激光共聚焦顯微和活體成像技術。小鼠尾靜脈注射共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒lh，2h，3h后取出腦組織，制備冷凍切片，直接在活體成像儀中觀察藥物在腦部的分布情況。或者用 I U g/mL 的 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenyI indole,DAPI)染色15min，用pH7.4的PBS沖洗兩次，自然晾干，在激光共聚焦顯微鏡下觀察腦組織中藥物分布情況。[0024]上述共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒透過血腦屏障能力的評價可以采用活體成像技術。小鼠尾靜脈注射共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒，注射lh, 2h，3h后，將小鼠麻醉，置于活體成像儀中觀察藥物在腦中的分布情況。腦部熒光越多越亮，藥物透過血腦屏障的能力越強。[0025]本發明方法穩定可靠，所得產品質量好，具有能夠同時傳遞小分子化學藥物和基因藥物，或者同時傳遞化療藥物和熒光探針通過血腦屏障進入腦部，發揮協同靶向治療腦腫瘤或靶向治療腦腫瘤與診斷于一體之功效，共載化療藥物和基因藥物的靶向PLGA納米粒或者共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒可以將更多的藥物遞送進入腦部，使得不能透過血腦屏障的藥物能夠透過血腦屏障，降低藥物在外周的分布，提高腦部藥物濃度，增加藥物應用的安全性，并經試驗取得了有益的技術效果，有關試驗資料如下:
1、載藥系統轉運進入U87 MG細胞的考察
由于流式細胞儀測定siRNA轉染率要求藥物具有熒光，因此在實施本實例的過程中，實例3中載藥系統中的siRNA改為羧基熒光素(FAM)標記的siRNA，堿基組成和實例3中的EGFR siRNA 相同。
[0026]將U87 MG細胞培養在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的MEM培養基中，培養條件為37°C、5% CO2，每2~3天傳代一次。收集對數期細胞，用有血無抗體調整細胞懸液濃度，6孔板每孔加入2 mL,鋪板使待測細胞調密度至2 X IO5個/孔。置于5% CO2, 37°C孵育24 h，至細胞單層鋪滿孔底出孔平底板)。棄去培養基，用無血無抗培養基清洗細胞孔2次，加入共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒，其中鹽酸阿霉素的濃度為
3.6 u g/mL, siRNA濃度為50nmol/L。培養5h后，每個孔用PBS清洗兩次，用不含EDTA的胰酶消化細胞2min，加入含有血清的培養基終止消化，收集細胞，1000rpm離心5min，棄去上清，用PBS垂懸細胞，用BD Accuri? C6流式細胞儀進行檢測。數據分析應用Flow Jo7.6.1軟件首先進行熒光補償，然后在FL2和FLl通道分別分析細胞對鹽酸阿霉素和siRNA的轉染率。
[0027]實驗結果表明，載藥系統中siRNA的轉染率為79%，鹽酸阿霉素的轉染率為85%。
[0028]2、納米粒系統透過血腦屏障進入腦部的情況試驗
取正常BALB/c-nu小鼠，尾靜脈注射實例5中共載多西他賽和香豆素-6的靶向PLGA納米粒(香豆素-6劑量0.16mg/kg)。在預定時間點(注射后lh，2h和3h)采用水合氯醛麻醉小鼠后剪開胸腔，動作要快，經左心室插入頭皮針連接的20mL注射器，頭皮針磨鈍，從以身體縱軸45°C方向進針，針尖插入升主動脈內，可以看見，動作要輕柔，同時剪開右心兒，推入20mL生理鹽水推完以后迅速的換4 1:多聚甲醛20mL。剪開頭皮，取出腦，用OCT膠包埋，置于-20°C預冷，固定腦組織，在-20°C用冷凍切片機切片，切片厚度5 ii m，置于載玻片上。用I U g/mL的DAPI避光染色15min，用pH7.4的PBS清洗三次以除去多余的DAPI。在激光共聚焦纖維鏡下觀察納米粒進入腦部的情況并拍照。
[0029]腦組織切片中的綠色熒光亮點越多，顏色越深，細胞核周圍的亮點越多越深，納米粒透過血腦屏障的量越多。結果表明，在lh，2h，3h，載藥系統在腦部均有分布，并且2h和3h納米粒在腦部的分布明顯增多。2h和3h腦內納米粒的分布沒有明顯差異。
[0030]3、納米粒體外抗腫瘤實驗
將U87MG腦膠質瘤細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將U87MG細胞培養在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的MEM培養基中，培養條件為37°C、5% CO2,每2~3天傳代一次。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 u 1，鋪板使待測細胞調密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入實例3中的共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒，其中鹽酸阿霉素濃度濃度為0.18 u g/mL, 0.36 u g/mL, 0.78 u g/mL, EGFRsiRNA的濃度為50nmol/L，以不加入本發明的藥物轉運系統為對照組，設置復孔為4~6個。細胞板置于5%C02培養箱中孵育48 h，終止培養，吸出含藥培養基，每孔用150 u I PBS洗2遍，加入預冷的10% TCA 200 u 1,4 °C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 u I的SRB溶液，靜置放置10 min，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結合的SRB用150 u I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在565nm處測定每孔的OD值。抑制率的計算公式:抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值。 [0031]結果表明，藥物作用48h后，載藥系統對U87細胞的細胞抑制率分別為43%(鹽酸阿霉素濃度為0.18 u g/mL, EGFR siRNA濃度為50nmol/L)，65% (鹽酸阿霉素濃度為0.36 u g/mL, EGFR siRNA 濃度為 50nmol/L)，76% (鹽酸阿霉素濃度為 0.78 u g/mL, EGFR siRNA 濃度為 50nmol/L)o
4、載藥系統在腦腫瘤治療中的應用
所有的動物實驗都依照鄭州大學倫理委員會評估和認可的指南進行。
[0032]I)在超凈臺中用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉BALB/c-nu裸鼠。
[0033]2)首先用碘伏消毒待手術區，用手術剪在前顱處剪開頭皮，在顱骨前約3mm，右約2mm進針5mm，拔出1mm，以I yl/min的速度注射U87MG腫瘤細胞懸液10 (IX 107)。注射后，停留lOmin，拔出針。
[0034]3)縫合手術切口，用碘伏消毒手術區。在IVC動物房飼養7天后，分為四組，組別分別為生理鹽水組，載鹽酸阿霉素的靶向PLGA納米粒組，載EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組，共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組，其中鹽酸阿霉素劑量為3mg/kg, EGFR siRNA的劑量為1.2mg/kg。隔一天給藥一次，給藥5次，記錄動物的存活期，利用GraphPad Prism 5.0計算各組動物的中位生存期。
[0035]實驗結果，生理鹽水組，載鹽酸阿霉素的靶向PLGA納米粒組，載EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組，共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組動物的中位生存期分別為18±0.8天，2.1±2.0天，19±3.0天，28±2.7天。實驗結果表明，共載鹽酸阿霉素和EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組能夠顯著提高動物的中位生存期(與生理鹽水相比P〈0.05)，而載鹽酸阿霉素的靶向PLGA納米粒，載EGFR siRNA的靶向PLGA納米粒組的動物中位生存期與生理鹽水相比均沒有顯著性差異。
[0036]上述表明，本發明提供了一種基于PLGA的祀向藥物共載傳遞系統、制備方法以及在腦腫瘤治療中的應用。本發明的基于PLGA的靶向藥物共載傳遞系統，對生物體的毒性很低，物理以及化學穩定性良好，質量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。基于PLGA的祀向藥物傳遞系統，Angiopep-2作為祀頭,該納米粒載藥系統可以透過血腦屏障，測試結果表明無論是體外還是體內都可以很好的抑制腫瘤細胞以及腫瘤組織的發生和發展，具有很好抗腦腫瘤的效果。預期可以用于聯合裝載化療藥物和基因藥物或者聯合裝載化療藥物和熒光探針，是腦腫瘤治療藥物上的一大創新。與現有技術相比具有以下突出的有益技術效果:
I)本發明的Angiopep-2修飾的殼聚糖作為一種新型的載體材料和PLGA共同制備荷正電的PLGA納米粒載藥系統，可以同時裝載各種化療藥物和基因藥物，具有廣譜性。
[0037]2)本發明提供的基于PLGA的靶向納米粒載藥系統所用材料均生物可降解，無毒副作用，生物相容性好，具有緩釋和靶向性，價廉易得，產品質量好，使用安全，成本低，僅是同類藥物成本的1/3。
[0038]3)本發明提供的基于PLGA的靶向納米粒載藥系統可以透過血腦屏障，體內外都具有抗腦膠質瘤的效果。
[0039]4)本發明提供的共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒不但可以實現腦腫瘤的靶向治療，而且可以實現活體腫瘤靶向示蹤，經臨床116名腦腫瘤患者應用，除I人無明顯效果外，其余均取得了不同程度的有益療效，有效率達99%以上，其效果之好是未曾料到的，有實際的臨床意義，經·濟和社會效益巨大。
【權利要求】
1.一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于，利用殼聚糖上的活性氨基連接Angiopep-2，首先殼聚糖與3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺反應，使殼聚糖的氨基末端具有馬來酰亞胺，再與末端巰基化的Angiopep-2的巰基反應,得到殼聚糖-angiopep-2聚合物,將該聚合物用于基于PLGA的靶向共載藥物傳遞系統的制備，制備共載化療藥物和基因藥物的靶向PLGA納米粒的方法是，PLGA、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中，制備成油相；將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于加有無RNA酶水中，成水相，油相加入水相中，磁力攪拌或旋蒸除去有機溶劑，經離心或透析除去游離藥物，制成PLGA載藥納米粒，將基因藥物加入納米粒溶液中，得到基于PLGA共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒；制備共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒的方法是，將PLGA、化療藥物、熒光探針和輔料溶解于有機溶劑中，制備成油相；將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于無RNA酶的水中，油相加入水相中，磁力攪拌或旋蒸除去有機溶劑，經離心或者透析除去游離藥物，得到共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒。
2.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)、殼聚糖-angiopep-2聚合物的制備,方法是: a、將殼聚糖20mg加入質量濃度為20%的乙酸溶液8mL中，在功率為300-500W超聲溶解30min，用5M NaOH溶液調pH值至6.0，得殼聚糖溶液； b、在殼聚糖溶液中加入3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下、30°C、100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量為8KD-14KD的透析袋中在PBS中透析60h，除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯，得透析液；` C、然后在透析液中加入巰基化的Angiopep-2 2mg,在氮氣保護下、35°C、100-200r/min攪拌反應24h,得Angiopep-2修飾的殼聚糖,再置于截留分子量為8KD-14KD的透析袋中透析48h,除去游離的Angiopep-2,在-80°C冷凍真空干燥72h,得殼聚糖-angiopep-2聚合物，于-20°C貯存備用； 所述的巰基化的Angiopep-2為羧基末端為半胱氨酸的angiopep-2或angiopep-2與Trautj s反應后得到的巰基化angiopep-2中的一種；所述的羧基末端連接有半胱氨酸的angiopep-2為，在合成angiopep-2時一個分子angiopep-2羧基末端通過化學反應連接一個分子的半胱氨酸；所述的angiopep-2與Traut’ s反應后得到的巰基化的angiopep-2為，將Angiopep-2 5mg溶于20mL超純水中，加入IOmg Traut’s試劑，50°C超聲Ih,使得Angiopep-2的末端具有巰基，然后置于截留分子量為8KD_14kD的透析袋中在PBS中透析48h,除去游離的angiopep-2和Traut’s,透析液在_80°C冷凍真空干燥72h,得到巰基化的Angiopep-2 ； (2)、制備共載化療藥物和基因藥物的靶向PLGA納米粒，方法是: a、將PLGA共聚物、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中，PLGA共聚物的濃度為5mg-50mg/ml,化療藥物的濃度為lmg/ml-10mg/ml,輔料的體積濃度為0.5%_1%，制備成油相； 所述的有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一種或兩種以上的組合物；所述的PLGA共聚物為聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯:乙交酯的重量比為為25: 75,50: 50,75: 25 中的一種，PLGA 的分子量為 17kD，50KD，IOOkD 中的一種；所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、5-氟尿嘧啶中的一種；所述的輔料為司盤80、吐溫20、吐溫80中的一種或兩種以上的組合物； b、將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值為6的無RNA酶水中，制備成水相，表面活性劑濃度為5 -50mg/ml,殼聚糖-angiopep-2的濃度為0.02 -2mg/ml ； 所述的pH值為6的無RNA酶水是，先將水中加入1%。體積的焦碳酸二乙酯，25°C、500r/min磁力攪拌12h,用乙酸調節pH為6,121°C、102.9kPa條件下滅菌30min ;所述的表面活性劑為泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、膽酸鈉、卵磷脂的一種或兩種以上的組合物； c、將油相滴加入水相中，水相與油相的體積比為4-10，得到荷載正電荷P LGA共聚物載藥納米粒，經攪拌或旋蒸除去有機溶劑，得除去有機溶劑后的PLGA共聚物載藥納米粒溶液； d、將除去有機溶劑后PLGA共聚物載藥納米粒溶液經離心除去游離藥物，或透析除去游離藥物，再將基因藥物加入納米粒溶液中，得共載化療藥物和基因藥物的靶向藥物傳遞系統納米粒； (3)共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA納米粒，方法是: a、將PLGA共聚物、化療藥物和輔料溶解于有機溶劑中，PLGA共聚物的濃度為5_50mg/ml，化療藥物的濃度為1-10mg/ml，輔料的體積濃度為0.5_1%，制備成油相； 所述的有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇中的一種或兩種以上的組合物；所述的PLGA共聚物為聚丙交酯、乙交酯的共聚物，聚丙交酯:乙交酯的重量比為為25: 75,50: 50,75: 25 中的一種，PLGA 的分子量為 17kD，50KD，IOOkD 中的一種；所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、紫杉醇、多西他賽、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、5-氟尿嘧啶的一種或兩種以上的組合物；所述的輔料為司盤80、吐溫20、吐溫80中的一種或兩種以上的組合物；所述的熒光探針為吲哚菁綠、酞菁、香豆素-6、異硫氰酸熒光素(FITC)、亞甲藍、羅丹明中的一種； b、將表面活性劑和殼聚糖-angiopep-2聚合物溶解于pH值為6的無RNA酶水中，表面活性劑濃度為5 -50mg/ml,殼聚糖-angiopep-2的濃度為0.02 -2mg/ml,制備成水相； 所述的pH值為6的無RNA的酶水是，先將水中加入1%。體積的焦碳酸二乙酯，25°C、500r/min磁力攪拌12h，用乙酸調pH值為6，121°C、102.9kPa條件下滅菌30min，成pH值為6的無RNA酶水；所述的表面活性劑為泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、膽酸鈉、卵磷脂的一種或兩種以上的組合物； C、將油相滴加入水相中，水相與油相的體積比為4-10，經攪拌或旋蒸除去有機溶劑，得除去有機溶劑的共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA共聚物載藥納米粒溶液，經離心除去游離藥物，或透析除去游離藥物，得共載化療藥物和熒光探針的靶向藥物傳遞系統納米粒。
3.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于，所述的殼聚糖-angiopep-2聚合物的制備,方法是: a、將殼聚糖20mg加入質量濃度為20%的乙酸溶液8mL中，在功率為500W超聲溶解30min,用5M NaOH溶液調pH值至6.0，得殼聚糖溶液； b、在殼聚糖溶液中加入3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下、300C、100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量8kD_14kD的透析袋中在1000mL PBS中透析60h，除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸-N-羥基琥珀酸亞胺酯，得透析液； C、稱取Angiopep-2 5mg溶于20mL超純水中，加入IOmg Traut’s試劑，超聲Ih,溫度為50°C，使得Angiop印-2的末端具有巰基，置于截留分子量為8kD_14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h,除去游離的angiopep-2和Traut’s,透析液在_80°C冷凍真空干燥72h,得到巰基化的angiopep-2 ； d、在步驟b中透析液中加入步驟c制備得到的巰基化的Angiopep-2 2mg,在氮氣保護下、35°C、100-200r/min攪拌反應24h，得Angiop印-2修飾的殼聚糖，再置于截留分子量為8kD-14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h,除去游離的Angiopep-2,在_80°C冷凍真空干燥72h,得殼聚糖-angiopep-2聚合物，于-20°C|C存。
4.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于，所述的殼聚糖-angiopep-2聚合物的制備,方法是: 1)稱取殼聚糖20mg，加入8mL20%乙酸溶液，500W超聲溶解，用5MNaOH調pH至6.0 ; 2)上述殼聚糖溶液中，加入3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酸亞胺酯5mg，在氮氣保護下加熱30° C，100r/min磁力攪拌反應48h，反應完成后，反應液置于截留分子量8kD_14kD的透析袋中在1000mLPBS中透析除去未反應的3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酸亞胺酯，透析60h ； 3)取出透析袋中的溶液，加入末端為半胱氨酸的Angiopep-2，在氮氣保護下加熱攪拌使其充分反應，Angiopep-2修飾的殼聚糖置于截留分子量為8kD_14kD的透析袋在1000mLPBS中透析48h，以除去游離的Angiop印-2，-80。C冷凍干燥72h，貯存于_20°C冰箱。
5.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于: 1)稱取IOOmgPLGA,聚丙交酯:乙交酯=50: 50，分子量為17kD，溶解于IOmL丙酮中，制備得到PLGA貯備液10mg/mL，稱取15mg鹽酸阿霉素，溶解于5mL甲醇中，得到鹽酸阿霉素C:備液 3mg/mL ； 2)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmL含有體積Iq^DEPC的水溶液中，溶解完全后，用乙酸調節pH至6.0,加入殼聚糖-Angiopep-2 62.5mg,超聲溶解完全,作為水相； 3)取5mL鹽酸阿霉素貯備液，加入IOmLPLGA儲備液中，超聲lmin，作為油相，把油相以lmL/min的速度逐滴在IOOrpm攪拌條件下加入60mL水相中，然后探頭超聲，功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次，在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇，以12000rpm離心60min,棄去上清液得到納米粒。
6.根據權利要求1所述的基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒的制備方法，其特征在于: I)稱取150mgPLGA，聚丙交酯:乙交酯=50:50，分子量為17kD，和45mg多西他賽，溶解于15mL丙酮中，作為油相，PLGA濃度為10mg/mL,多西他賽濃度為3mg/mL ；2)稱取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmLDEPC水中，溶解完全后，用乙酸調節pH至6.0，加入殼聚糖-angiopep-2約62.5mg,超聲溶解完全,作為水相； 3)取15mL油相以lmL/min的速度逐滴在IOOrpm攪拌條件下加入60mL水相中，然后探頭超聲，功率200W，工作時間3s，間歇時間6s，工作次數20次，在室溫下磁力攪拌6h除去有機溶劑丙酮和甲醇，以12000rpm離心60min,棄去上清液得到納米粒。
7.權利要求1所述方法制備的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒，在治療腦腫瘤藥物中的應用。
8.根據權利要求6所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的靶向共載藥物傳遞系統納米粒在治療腦腫瘤藥物中的應用，其特征在于，共載化療藥物和基因的靶向PLGA共聚物納米粒在治療腦腫瘤藥物中的應用，或共載化療藥物和熒光探針的靶向PLGA共聚物納米粒在腦腫瘤治療、診斷藥物中 的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103623430SQ201310615647
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】王蕾, 郝永偉, 張云, 趙亞林, 孟德輝, 李懂, 史進進, 張振中 申請人:鄭州大學