楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用。實驗發現，小分子楊梅素能顯著抑制Smad1/5/8的磷酸化水平，進而抑制住BMP-Smad介導的下游信號通路。基于其天然、綠色、安全的特性，楊梅素為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關疾病的臨床藥物開發有著潛在的應用。
【專利說明】楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用。
(二)【背景技術】
[0002]骨形態發生蛋白(bone morphogehetic proteins, BMPs)是轉化生長因子-ρ(transforming growth factor-β , TGF-β )超家族的一員，最初從礦化的骨骼中提取出來，并發現其能夠誘導異位骨的生長。BMPs是分泌型蛋白，存在于細胞外，并且可以在血清中檢測到。細胞外的BMPs與細胞膜上的BMP受體(BMPR)結合后導致受體激酶的激活，活化的受體會磷酸化細胞內的Smadl/5/8,其與Smad4形成復合物后進入到細胞核內，結合到DNA序列上，從而調節BMP靶基因的轉錄。BMP-Smad信號通路受到多種機制的精細調節，尤其是受到一些負反饋調節作用，如受體的內吞，Smads的去磷酸化和信號分子的降解等。
[0003]BMP-Smad信號通路調節干細胞的自我更新和分化，細胞的增殖、遷移和凋亡，以及胚胎發育和出生后組織體內穩態的維持。BMP-Smad信號通路在腫瘤發生中也起著十分重要的作用。最近越來越多的人和小鼠的遺傳學研究已證明，BMP-Smad的自我平衡在機體的生理過程中扮演著重要的角色，如在骨代謝、干細胞、神經細胞、鐵代謝以及腫瘤的形成中起著重要作用。因此，無論是增強或抑制BMP-Smad都有著重要的生理意義及應用，尤其是BMP-Smad通路的小分子抑制劑在干細胞研究、骨骼重塑治療、異位骨化以及鐵代謝治療方面有著潛在的意義。
(三)
【發明內容】
[0004]本發明目的是提供楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用，為防治BMP-Smad紊亂引起的疾病提供新的藥物。
[0005]本發明采用的技術方案是:
[0006]楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用。
[0007]楊梅素是一種天然的黃酮醇，是存在于許多水果、蔬菜、漿果及藥材等植物中的黃酮類化合物。楊梅素是紅葡萄酒中的酚類化合物之一。楊梅素可抗氧化。體外研究表明，高濃度的楊梅素可降低低密度脂蛋白膽固醇。芬蘭的一項研究發現，高楊梅素攝入的人群其前列腺癌的發生率較低。一項歷時8年的研究發現，山柰酚、槲皮素和楊梅素可降低吸煙者患胰腺癌的風險。目前，楊梅素被廣泛應用于醫藥、食品、保健品和化妝品。美國保健品藥FYI使用楊梅素用作治療預防關節炎和各種炎癥，尤其對懷孕婦女和哺乳期嬰兒適合使用。
[0008]此前，在人源肝癌細胞H印G2中，發明人發現小分子楊梅素能顯著抑制BMP-Smad通路下游基因鐵調素Hepcidin的表達。基于此，進一步研究發現，楊梅素能在體外顯著降低Smadl/5/8信號通路的磷酸化水平， 進而抑制住下游通路基因的轉錄，并呈現較強的時間、劑量依賴性。通過BMP-Smad信號通路激動劑BMP6的刺激，實驗發現楊梅素能顯著抑制BMP6引起的Smadl/5/8的磷酸化水平的增加。此外，通過熒光素酶報告基因手段，實驗發現楊梅素能夠顯著抑制BMP6對BMP-Smad通路下游通路基因的轉錄。[0009]綜上，小分子楊梅素能顯著抑制Smadl/5/8的磷酸化水平,進而抑制住BMP-Smad介導的下游信號通路。基于其天然、綠色、安全的特性，楊梅素為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關疾病的臨床藥物開發有著潛在的應用，如抑制因鐵調素Hepcidin上升引起的鐵代謝紊亂疾病；抑制產后骨骼的再生成疾病、抑制異位骨化如進行性肌肉骨化癥等骨骼性疾病；促進如神經元干細胞、心肌干細胞等分化及其在干細胞再生醫學中的應用；以及其在腫瘤方面的應用都有著重要的意義。
[0010]具體的，所述楊梅素可用于制備防治BMP-Smad紊亂引起的疾病的藥物。
[0011]更為具體的，所述楊梅素可用于制備防治鐵代謝紊亂疾病、抑制產后骨骼的再生成疾病、或者進行性肌肉骨化癥等的藥物。
[0012]本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用，基于其天然、綠色、安全的特性，為因BMP-Smad紊亂引起的疾病治療提供了可能，特別在相關疾病的臨床藥物開發有著潛在的應用。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為楊梅素顯著抑制人肝癌細胞HepG2細胞Smadl/5/8的磷酸化水平；
[0014](A)不同濃度的楊梅素處理H印G2細胞，western blot檢測BMP-SMAD通路蛋白變化水平，處理時間12小時；
[0015](B)濃度為50 u g/mL楊梅素從Oh至24h處理H印G2細胞對Ifepcidin表達通路相關蛋白的影響，western blot檢測BMP-SMAD通路蛋白水平；
[0016]圖2為楊梅素顯著抑制BMP6誘導的BMP-Smad信號通路下游基因的表達；
[0017]A:楊梅素(50 ii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細胞12小時，對H印G2細胞Hepcidin mRNA表達的抑制效果；
[0018]B:楊梅素(0~IOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細胞12小時，對HepG2細胞Hepcidin表達的抑制效果，western blot分析磷酸化Smadl/5/8 ；
[0019]圖3為楊梅素顯著抑制BMP6誘導的BMP-Smad信號通路下游基因的轉錄；
[0020]不同濃度的楊梅素(O-lOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共處理H印G2細胞24小時，熒光素酶報告基因檢測HAMP基因的轉錄情況。
(五)【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0022]實施例1:
[0023]1.材料和方法
[0024]1.1實驗原料制備
[0025]Myricetin購自SIGMA公司。溶于無菌二甲基亞砜DMSO中，配置成所需濃度。人源BMP6購自R&D Systems公司。
[0026]1.2細胞株
[0027]人肝癌細胞株IfepG2及人腎臟細胞株HEK293由中國科學院上海生命科學院細胞庫提供。培養條件:含10% FBS (GIBCO)的DMEM高糖型培養基(GIBCO)，37°C、5%C02飽和濕度培養箱。
[0028]1.3RNA 提取和 Realtime-PCR
[0029]Trizol (Life Technologies)法提取細胞和組織的RNA,具體操作按說明書進行。參考其次文獻，NanodroplOOOSpectrophotometer 上檢測 RNA 純度(0D260/0D280 ~1.9 ~
2.1)及 RNA 濃度(ng/μ 1)，調整 RNA 濃度到 I μ g/μ I。2.0 μ g RNA 經 DNase (Promega)處理后，M-MLV 反轉錄酶(Promega)和 Oligo (dT)18primer (Takara Bio Inc.)進行反轉錄。CFX96Real_Time System (Bio-Rad)中進行 Realtime PCR,檢測體積為 IOul,試劑米用iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad),引物序列如下:HAMP:
[0030]forward CAGCTGGATGCCCATGTTC
[0031]reverse CAGCAGCCGCAGCAGAA ；
[0032]ACTIN:
[0033]forward CACGGCATCGTCACCAACT
[0034]reverse CACGCAGCTCATTGTAGAAGGT ；
[0035]1.4Luciferase突光素酶報告基因檢測
[0036]按照FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 轉染系統說明，于轉染前
I日接HEK293接種于24孔板，5 X IO4/孔，第2日當細胞約60%融合時，更新細胞培養液，共同轉染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和內參Renilla報告基因質粒。共轉24h后，根據實驗設計，加藥處理不同的濃度、時間后，裂解收集細胞，離心取上清，用Dual-LuciferaseReporter Assay System 測定裂解細胞上清內 Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，計算HAMP Luc/Renilla Luc比值。每種處理各個設3復孔。
[0037]1.5ffestern blot
[0038]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技術研究所)裂解細胞或組織后，提取總蛋白。細胞蛋白取30ug，肝組織蛋白取lOOug，經10%SDS-PAGE膠電泳后，轉移至PVDF膜，該膜與特異性抗體4°C孵育過夜。洗漆三遍，與過氧化物酶標記的二抗(ant1-rabbit or ant1-mouse IgGl: 4000濃度稀釋，Proteintech Group)室溫孵育 I 小時后，Westernblot 試劑盒(ECL system,Pierce, ThermoScientific)顯色。
[0039]所用一抗如下:兔抗anti_pSmadl/5/8antibody (1:1000 濃度稀釋；CellSignaling Technology),兔抗 ant1-Smadlantibody (1:1000 濃度稀釋；Cell SignalingTechnology)以及鼠抗 ant1-β-actin (1:2000 濃度稀釋；Sigma-Aldrich)。
[0040]1.6統計方法
[0041]所用統計采用R軟件分析，實驗數據以MeaniSD表示。細胞和動物實驗的組間比較采用Tukey’ s檢驗(AN0VA)，兩組間比較以Student’s t-test檢驗，以P〈0.05認為有統計學意義。
[0042]2 結果
[0043]2.1楊梅素顯著抑制人肝癌細胞HepG2細胞Smadl/5/8的磷酸化水平
[0044]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技術研究所)裂解細胞或組織后，提取總蛋白。通過western-blot，檢測信號通路BMP-SMAD表達情況，結果見圖1。
[0045]Western Blot結果顯不，隨著楊梅素濃度的增加,磷酸化Smadl/5/8蛋白表達水平亦顯著降低(圖1A)，并且6小時后，Smadl/5/8蛋白磷酸化的水平顯著被抑制(圖1B)，表明楊梅素能顯著降低Smadl/5/8的磷酸化水平。
[0046]2.2楊梅素顯著抑制BMP6誘導的BMP-Smad信號通路下游基因的表達
[0047]BMP6是生理條件下最強的H印cidin刺激劑，為了探楊梅素對BMP6誘導的Hepcidin表達的抑制效果,將楊梅素(50 ii g/mL)先于BMP6 (10ng/mL)30min加入到HepG2細胞的培養液中，培養12小時后，檢測Hepcidin mRNA表達量，結果見圖2。
[0048]BMP6可使H印cidin mRNA表達量升高到正常值的4_5倍。楊梅素能夠減弱BMP6的刺激作用，H印cidin mRNA的表達量僅為正常值的40%(圖2A)。Western Blot結果顯示，BMP6可明顯增加Smadl/5/8蛋白磷酸化水平，隨著楊梅素濃度的增加，BMP6刺激條件下的磷酸化Smadl/5/8蛋白表達水平亦顯著降低(圖2B)。
[0049]由此推測楊梅素通過祀向BMP-Smad信號通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平,進而抑制其通路下游信號基因的水平，如鐵調素Hepcidin的表達。
[0050]2.3楊梅素顯著抑制BMP6誘導的BMP-Smad信號通路下游基因的轉錄
[0051]利用HEK293 細胞株，按照 FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 轉染系統，共同轉染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和內參Renilla報告基因質粒。共轉24h后，不同處理后，裂解收集細胞，離心取上清，用Dual-Luciferase Reporter Assay System測定裂解細胞上清內 Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，計算 HAMP Luc/RenillaLuc比值，結果見圖3。
[0052]為了探討楊梅素對BMP誘導條件下，BMP-Smad通路下游基因HAMP的轉錄的抑制效果，將不同濃度的楊梅素(0-100 Ii g/mL)分別先于BMP6 (lOng/mL) 30min加入到轉染后的HEK293細胞培養液中，24小時后，同樣利用雙熒光素酶檢測報告基因檢。
[0053]實驗發現，BMP6可使HAMP Luc相對活性升高到約為正常值的2.5倍，顯著增強HAMP基因的轉錄水平。不同濃度的楊梅素能夠減弱BMP6的該種刺激作用，甚至使BMP6對HAMP基因轉錄的誘導作用消失(20-100 ii g/mL)，HAMP Luc相對活性約為正常值的7% (圖3)。
[0054]基于此,楊梅素可顯著抑制BMP-Smad信號通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平，進而調控其下游信號基因的表達及轉錄。
【權利要求】
1.楊梅素在制備BMP-Smad通路小分子抑制劑中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治BMP-Smad紊亂引起的疾病的藥物。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治鐵代謝紊亂疾病的藥物。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治抑制產后骨骼的再生成疾病的藥物。
5.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述楊梅素用于制備防治進行性肌肉骨化癥的藥物。
【文檔編號】A61P21/00GK103655541SQ201310572080
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】王福俤, 穆明道, 伍愛民, 杜曉利, 安鵬, 吳謙, 邵丹丹, 沈筱筠 申請人:浙江大學