鏈激酶突變體及其共價修飾形式的制作方法

鏈激酶突變體及其共價修飾形式的制作方法
【專利摘要】本發明涉及鏈激酶的新的突變體、其功能片段和共價修飾形式。提供制備細菌纖溶酶原激活物蛋白鏈激酶、其突變蛋白、物種變體和它們的共價修飾變體的方法，它們的特征是改進的治療性質，如增加的蛋白水解穩定性、延長的血漿半壽期、降低的免疫反應性和增強的血纖蛋白凝塊特異性。所述方法涉及向蛋白質的非必需區中摻入額外的半胱氨酸殘基或者用半胱氨酸殘基取代天然存在的氨基酸，使得所得蛋白質的催化活性保持大部分不變。這些半胱氨酸變體通過共價連接半胱氨酸反應性聚合物如聚乙二醇(PEG)或者來自包括熒光團、自旋標記物或者其他小綴合物的基團的巰基反應性結構部分進行進一步修飾。本文公開了鏈激酶和其共價修飾變體的位點特異性生物活性綴合物。
【專利說明】鏈激酶突變體及其共價修飾形式
[0001]本申請是國際申請號PCT/IN2009/000212，國際申請日2009年3月31日，進入中國國家階段日期為2010年11月30日，中國申請號200980120111.3，發明名稱為“鏈激酶突變體及其共價修飾形式”的分案申請。
發明領域
[0002]本發明涉及鏈激酶突變體及其共價修飾形式。本發明利用鏈激酶和其具有取代、添加、缺失的相關變體或結構域融合構建體的同質的、位點特異的和確定的PEG修飾來允許它們以改進的蛋白質治療劑的形式應用。
[0003]本發明涉及使用硫羥反應性PEG試劑將PEG共價連接到鏈激酶的半胱氨酸變體、鏈激酶的突變蛋白、物種變體或血纖蛋白融合產物。還可以利用α胺基的不同PKa值在酸性PH下實施α胺特異性PEG綴合以產生鏈激酶或其突變蛋白的單-PEG化衍生物。
[0004]本發明還涉及基于結構和功能信息鑒定鏈激酶的多種半胱氨酸變體，或其突變體，包括相關的共價變體(Wang等，1998)。其他單結構域纖溶酶原激活物葡萄球菌激酶(SAK)的結構比較顯示出與SKa結構域的強烈相似性，盡管這兩種酶在氨基酸水平上沒有顯著的序列相似性(Rabijns等，1997)。這表明來自不同來源的纖溶酶原激活物盡管它們的多肽序列非常不同，但是仍然保留了相同的結構折疊。預期其受到進化限制來保持結構完整性，因為細菌纖溶酶原激活物是蛋白質輔因子，因此利用酶原的構象激活所需的多個接觸點。此類結構相似性進一步延伸了本發明的范圍，因為本案中實施的方法可以應用于來自其他屬或種的具有相似的纖溶酶原激活結構域的細菌纖溶酶原激活物。為此，本文中公開的用于產生鏈激酶的生物活性半胱氨酸變體的“規則”將可以用于產生多種其他形式鏈激酶的生物活性的半胱氨酸變體。這些半胱氨酸變體與半胱氨酸反應性PEG的綴合將賦予與本研究中所用的變體所得的益處相似的益處。確定半胱氨酸放置位點的規則很大程度上基于從表面暴露的殘基進行選擇這一想法，所述表面暴露的殘基落入環或螺旋或片層中或者在結構和柔性區的 邊界中。為了確定表面可及性，使用DSSP程序。DSSP(Kabsch等，1983)程序確定了蛋白質的二級結構、幾何特征和溶劑暴露，以蛋白質數據庫(ProteinData Bank)形式給出原子坐標。DSSP以平方埃描述每個殘基的暴露。從微纖溶酶復合體中鏈激酶的高分辨率晶體結構譯解鏈激酶氨基酸殘基的表面可及性(Wang等1998，PDBID1BML)。對于在該結構中缺失的區域(175-181和252-262)，分離的β結構域的晶體結構域(Wang等，1999，H)BIDlc4p)用于確定表面暴露。
[0005]將鏈激酶的半胱氨酸變體、其突變蛋白、物種變體和其共價修飾形式通過連接巰基反應試劑進一步化學修飾，接著根據經驗測試生物活性的實質性保留以及新性質的獲得，所述新性質如降低的免疫原性，或者與抗SK抗體的反應、降低的蛋白水解敏感性、增加的體內存活等等。更具體地，本發明涉及生產工程化的鏈激酶衍生物用于治療循環系統病癥的藥物組合物中。
[0006]發明背景
[0007]循環系統中血栓(血塊)發展可以引起血管阻塞，導致致命的狀況。凝塊的產生和其溶解是高度受控的止血過程。正常止血的任何偏差都導致多種臨床狀況，如中風、肺栓塞、深靜脈血栓形成和急性心肌梗死。止血失敗所引起的病理生理學狀況需要迅速的臨床注意。此類病例的最常用的醫學干預是靜脈內施用血栓溶解劑(Collen等，1988 ;Collen，1990 ； Franc is和Marder，1991)。最常用的血栓溶解劑包括鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)和組織型纖溶酶原激活物(tPA)。在過去已經進行了急性心肌梗死處理中使用不同的溶栓劑的多種藥物經濟學評估(Mucklow, 1995 ；Gillis和Goa, 1996)。Banerjee等，2004,已經論述了鏈激酶的臨床有用性和其作為選用藥的適用性。就臨床效果而言，鏈激酶和tPA幾乎同樣好，但是由于相差幾倍的低成本和稍長的體內半壽期，鏈激酶是世界上最優選的溶血栓藥(Sherry和Marder, 1991, Wu等，1998)。而且，tPA的使用稍微更可能引起中風,其是兩種藥物的主要副作用。然而，鏈激酶是一種細菌蛋白質，本質上是抗原性的，并且可以引起臨床并發癥，如過敏反應或者出血。而且，鏈激酶的循環半壽期(15-30分鐘)不足以有效溶栓(Wu 等，1998)。
[0008]盡管存在這些問題，但是近年來，用溶血纖蛋白藥如鏈激酶(SK)、組織纖溶酶原激活物(TPA)或尿激酶(UK)的溶栓療法已經徹底改變了多種循環系統疾病如深靜脈血栓形成、肺栓塞和心肌梗死的臨床處理。這些藥物通過切割纖溶酶原(PG)中殘基561和562之間易斷裂的肽鍵活化循環系統中的纖溶酶原(PG)而發揮其溶解血纖蛋白的效果。結果，無活性的酶原被轉化成其活性形式:絲氨酸蛋白酶纖溶酶(PN)，其然后在系統中循環并作用于血纖蛋白以將其降解成可溶的降解產物。在這里可提及的是PN，其自身不能將PG活化成PN ;該反應被高度特異性蛋白酶像TPA、SK-纖溶酶原復合體和UK催化，所有這些蛋白酶都具有異常窄的蛋白質底物偏好性，即傾向于以高度位點特異性方式切割PG中易斷裂的肽鍵。然而，不像UK和TPA，SK自身沒有蛋白水解活性，并且它“間接”將PG活化為PN，即通過首先與PG形成高親和力等摩爾復合體，這稱作激活物復合體(Castellino，F.J.，1981綜述)。該激活物復合體然后作為蛋白酶將PG的其他底物分子切割為PN。[0009]盡管在鏈激酶和其他細菌溶栓劑的治療應用中取得了巨大的發展，但是仍然有一些缺點限制了這些多肽藥物的有用性。這些缺點包括它們對蛋白水解酶降解的敏感性、短的循環半壽期、短的保存期、快速腎清除率和它們產生中和性抗體的傾向性。這些缺點有時也是非人源的許多其他多肽藥物所固有的。這方面一般由Roberts等；2002綜述。進行了多種嘗試來克服多肽藥物中的這些缺點，如改變氨基酸序列以減少蛋白酶解或抗原性，將多肽與球蛋白或白蛋白結構域融合以提高半壽期等等(Osborn等.2002)。這些方法對該問題提供了很少幫助并且帶來了相關的負擔。該領域的主要突破是蛋白質PEG化方法，其對多個問題提供了一種解決方法。通過將乙二醇的許多重復亞基聚合形成PEG(聚乙二醇)，產生具有定制的分子量的線性或分枝的PEG聚合物。一旦用PEG共價綴合，蛋白質或多肽就顯示出改善的藥代動力學和藥效學性質，如增加的水溶性、降低的腎清除率和通常充分有限的免疫反應性(Moreadith等.2003，Doherty等，2005，Basu等，2006)。PEG綴合也使得分子對蛋白水解敏感性降低。PEG加入后降低的受體相互作用或降低的與細胞表面蛋白質的相互作用也幫助減少不利的免疫學作用。PEG化的藥物在寬范圍的pH和溫度改變下更穩定(Monfardini等1995)。PEG的使用被FDA批準用于治療劑并且其顯示出幾乎沒有毒性并且被腎臟從身體完整除去或者在糞便中排出。PEG綴合的有益特征可以被潛在賦予SK使得其成為更有效和更安全的溶血栓藥。在文獻中報導了使用相對非特異性化學修飾反應進行SK PEG化的嘗試(Rajagopalan等，1985)。此類修飾的治療用途受到高度受損的纖溶酶原活化能力的嚴重限制。而且，修飾的性質的確定性很差并且在本質上是異質的。該異質性區域是由于用于PEG修飾的化學方法，其不能定向修飾特定位點。這可能是為什么此類修飾策略沒有被用于開發改進的基于SK的溶栓劑的原因。
[0010]本文中使用的術語“鏈激酶”全體表示:鏈激酶的變體、其功能片段、功能突變蛋白、來自不同物種的分離物和通過連接天然或人工來源的寡肽或多肽得到的融合產物中的任一種。
[0011]已知蛋白質中存在的不同的官能團可以用于PEG引入。最常用的技術是蛋白質中賴氨酸殘基或半胱氨酸殘基的衍生化。N-末端的α氨基也可以用于蛋白質中PEG的單一同質綴合(Baker等，2006)。然而，使用半胱氨酸殘基來攜帶摻入的PEG基團是尤其有利的，因為，潛在地，-SH基可以以位點定點特異性方式被靶定，尤其在蛋白質帶有或使得帶有非常有限數目的半胱氨酸殘基的情況下。毫不夸張地說，當蛋白質缺乏任何半胱氨酸殘基時，PEG綴合成為一種藝術形式，因為其對于蛋白質的位點特異性PEG “繪畫”或者裝飾，為半胱氨酸添加、插入或取代留下了幾乎空白的畫布。因為半胱氨酸向無半胱氨酸的背景的潛在加入可以對蛋白質功能具有不利效果。因此，制備半胱氨酸變體的位點選擇需要小心的規劃和執行。相比，例如對于PEG化的基于賴氨酸的修飾，盡管化學方法是成熟的，但是反應中的異質性是一個大的缺點。對于SK的情況，許多賴氨酸殘基都沿著多肽均勻散布，因此限制了同質位點特異性PEG綴合的可能性。更有趣的是，在鏈激酶分子中不存在天然半胱氨酸(Malke等，1985)，從而使得可能產生鏈激酶的多種半胱氨酸變體。通過與血纖蛋白結合結構域融合得到的天然折疊的SK中也沒有自由的半胱氨酸(參考美國專利7，163,817)。這使得可能制備多種含自由半胱氨酸的凝塊特異性鏈激酶的變體而不實際上干擾富含半胱氨酸的蛋白質的正常再折疊(所有半胱氨酸殘基都參與二硫鍵形成)。所引入的自由半胱氨酸可以與多種巰基反應試劑(包括PEG)反應，產生這些蛋白質的半胱氨酸加合物。
[0012]鏈激酶(SK)是由多種·溶血鏈球菌產生的分泌型蛋白質的一般名稱，其能夠誘導血漿凝塊的溶解(Tillet和Garner，1933)。因為它可以從其親本來源或者通過重組DNA技術從其適當的異源宿主容易且經濟地產生，所以SK是非常劃算的并且從而是主要的溶栓藥，特別是對于全世界注重成本的市場而言。發現SK在冠狀動脈血栓形成后的急性心肌梗死的臨床治療中非常有效(ISIS-3，1992)，并且在30年以上的時間里用作血栓溶解劑。然而，它有許多缺點。已知通過鏈激酶介導的纖溶酶原活化產生的纖溶酶在它注射不久后分解鏈激酶(Rajagopalan等，1985, Wu等，1998)。這將鏈激酶的體內半壽期限制到約15分鐘(Wu等，1998)。盡管鏈激酶在循環中比另一種溶血栓選用藥TPA (半壽期短于5分鐘；R0SS，1999 ；Ouriel, 2002)存在明顯更長時間，但是這對于有效的療法仍然很短(Wu等，1998)。因為認識到與可用的纖溶酶原激活物的快速體內清除相關的缺點，正嘗試開發這些化合物的改進的重組變體(Nicolini 等.1992, Adams 等.1991, Lijnen 等.1991 ；Marder.1993,和Wu等.1998)。盡管存在其內在問題，但是鏈激酶因為其相對低廉的成本(例如，與TPA的每次治療約1500美元相比，鏈激酶的每次治療約50美元或更低)而仍然是選用藥，尤其在發展中國家中。
[0013]Tillet和Garner (1933)首次報導鏈激酶引起血塊的溶解。然而，后來確定SK的血纖蛋白溶解活性來自其活化人纖溶酶原(HPG)的能力(Castellino，1979綜述)。鏈激酶主要由β溶血組A、C和G鏈球菌分泌。SK是人PG的激活物，盡管其自身不是蛋白酶，相反，其結合到人PG/PN并且募集其他的HPG分子作為底物并且將這些底物轉化為PN產物。PN在血流中循環。纖溶酶是非特異性蛋白酶，SK注射后全身且立即的PN產生導致多種血液因子的大規模破壞，導致出血危險，以及ECM和基底膜(BM)的溶解，并增強了細菌向宿主體內繼發感染部位的侵入(Esmon和Mather, 1998 ; Lahteenmald等，2001)。從而，迫切需要通過設計改進的SK類似物以使副作用最小化。
[0014]因為SK是有效的血纖蛋白凝塊溶解劑，所以其在全世界被廣泛用作溶栓藥，然而，其具有自身的局限。SK是從β溶血鏈球菌產生的蛋白質，其在人體中的應用誘導免疫原性(McGrath 和 Patterson, 1984 ；McGrath 等，1985 ；Schweitzer 等，1991)。已知首次 SK施用后產生的高滴度的抗SK免疫球蛋白(Ig)在患者中存在數月到數年(Lee等，1993)。從而，抗 SK 抗體由于施用時中和了 SK (Spottal 和 Kaiser, 1974 ； Jalihal 和 Morris, 1990)或者由于引起一系列過敏反應(McGrath和Patterson, 1984 ;McGrath等，1985)而嚴重限制了其作為未來的重復療法的應用。
[0015]如前面提到的，鏈激酶在血栓溶解療法中的應用除了受其免疫原性限制外還受到該蛋白質相對較短的體內半壽期(幾分鐘)(實際上所有當前使用的溶栓藥都存在這種情況)的限制。觀察到外源蛋白質當被引入脊椎動物循環系統時通常被腎臟快速清除。在鏈激酶的情況下該形勢變得更加嚴重，其中不斷更高劑量的蛋白質(以克服基于抗體的快速中和)可以嚴重增加變態反應的可能性，使得重復施用基本上是無效的和危險的。一般而言，解決這些問題的嘗試在文獻中詳細記載，其中已經表明多種物理和化學改變可用于產生改進的治療劑,例如見:Mateo, C.等 2000.Lyczak, J.B.Morrison, S.L.1994，Syed,
S.等；1997，Alien，T.Μ.1997。迄今這些嘗試中最有希望的是通過共價連接聚環氧烷聚合物，尤其聚乙二醇(PEG)來修飾治療性蛋白質的方法。PEG是非抗原性的惰性聚合物并且已知延長蛋白質在體內的循環半壽期(Abuchowski等，1984 ；Hershfield, 1987 ;Meyers等，1991)。這允許使用的藥物延長作用時間。認為PEG與蛋白質的綴合增加了它們的總體大小并且因此降低了其快速腎清除率。PEG連接也使得蛋白質或多肽水溶性增加并且增加了其在體內條件下的穩定性以及顯著降低免疫原性和增加體內穩定性(Katre等，1987 ；Katre,1990)。美國專利號4，179，337公開了使用與PEG或者聚丙二醇偶聯的蛋白質提供生理活性的非免疫原性水溶性多肽組合物。盡管PEG綴合化學方法多數是一般性的但是PEG聚合物在治療性蛋白質中的策略性放置對于獲得成功的結果是至關重要的。三維結構信息以及通過多種解析研究標記的功能熱點的可用性，有助于設計突變方案來保持功能完整。
[0016]通過用溴化氰產生的SK片段的順序Edman降解分析和酶學方法測定SK的完整氨基酸序列(Jackson和Tang，1982)。結果表明分子量M,為47，408Da，在單條多肽鏈氨基酸序列中含有415個氨基酸。
[0017]1985年，Malke和同事對來自似馬鏈球菌(S.equisimilis)H46A (用于SK生產的原型菌株，其最經常治療性用于人類中)的核苷酸序列。也研究了該基因的轉錄控制并且報導了其復雜啟動子的功能分析(Grafe等，1996)。因此，存在大量信息用于有效使用該基因在相對非致病性微生物中安全地生產鏈激酶。
[0018]附圖簡述
[0019]圖1.SDS-PAGE,顯示了純化的鏈激酶半胱氨酸變體和它們的PEG加合物。[0020]圖A顯示了鏈激酶的α結構域的半胱氨酸變體(SEQ ID Ν0:30)，其中柔性環88-97中的第95位的天冬氨酸已經用半胱氨酸替換。這樣產生的該獨特的半胱氨酸用20KDa的硫羥反應性PEG聚合物甲氧基-PEG馬來酰業胺PEG化，接著純化得到同質的蛋白質-PEG加合物。
[0021]圖B顯示了 SKP結構域的半胱氨酸變體(SEQ ID NO:49)，其中β結構域的250環中的第258位絲氨酸被半胱氨酸替換。這樣產生的該獨特的半胱氨酸用硫羥反應性PEG聚合物甲氧基-PEG馬來酰亞胺PEG化，得到更高分子量的蛋白質-PEG加合物。
[0022]圖C顯示了鏈激酶的半胱氨酸變體，其中鏈激酶的最初序列已經通過在C-末端位置加入半胱氨酸延伸了一個氨基酸(SEQ ID NO:490)。在C-末端這樣產生的硫羥(C-CYS)已經與20KDa的甲氧基-PEG馬來酰亞胺交聯得到更高分子量的蛋白質-PEG加合物。
[0023]圖D顯示了鏈激酶的雙PEG化變體(SEQ ID NO:491)，其中在鏈激酶的初始序列的N和C末端各自放置了一個半胱氨酸。這樣產生的雙半胱氨酸突變體已經用分子量為20KDa的PEG修飾。
[0024]圖2描繪了 pET-23d_SK的環狀圖譜，pET-23d_SK是用于在大腸桿菌(E.coli)中表達鏈激酶的表達載體。該環狀圖譜突出了 pET-23d載體(基于T7-RNA聚合酶啟動子的表達載體)(Studier等，1990)上的一些選擇的獨特RE位點，和所摻入的編碼SK的基因，其用于構建和表達SK和其突變蛋白。
[0025]圖3顯示了通過分光光度法得到的nSK和雙PEG化的鏈激酶變體NC1-414 (SEQ IDNO:491)對HPG活化的進行曲線。可以注意到，進行曲線顯示出雙PEG化的NC1-414活化纖溶酶原的能力顯著滯后，但是nSK不是這樣的情況。
[0026]圖4顯示了 nSK或者雙PEG化NC1-414(SEQ ID NO:491)與人纖溶酶的等摩爾復合體的HPG活化的進行曲線。雙PEG化鏈激酶NC1-414與纖溶酶的預先形成的復合體的使用消除了圖3中看到的時間滯后，從而建立了 PEG化SK的正常纖溶酶原活化能力的纖溶酶依賴性，相反，不管反應中是否存在纖溶酶`，nSK都沒有顯示出滯后。
[0027]發明目的
[0028]本發明的主要目的是提供鏈激酶的突變體，其由于延長的作用和降低的免疫反應性而具有增加功效的潛力。
[0029]本發明的另一目的是選擇性修飾鏈激酶以便增強其藥物代謝動力學性質并且使其成為治療上有用的溶栓劑和具有增加的蛋白水解穩定性和延長的體內半壽期。
[0030]本發明的再一個目的是選擇性修飾鏈激酶以便保留未修飾的分子所顯示出的合乎需要的生物學性質。
[0031]本發明的再一個目的是提供SK的變體，其賦予在靶定位點持續的和更有效的血纖蛋白溶解與降低的免疫反應性。
[0032]本發明的再一個目的是提供以純的或生物學活性形式產生鏈激酶或其活性突變蛋白或者雜合纖溶酶原激活物分子的PEG化半胱氨酸變體的方法。
[0033]發明概述
[0034]因此，本發明提供了鏈激酶的突變體、其功能片段或共價修飾形式。變體包含與SK相關的多肽，其中一個或多個半胱氨酸殘基替代蛋白質的一個或多個非必需氨基酸。優選地，變體包含的半胱氨酸殘基替代選自如下的氨基酸:環區域、α螺旋末端和甚至二級結構形成區、或者如下區域中的氨基酸:在所述區域中在有或無加入的氨基酸延伸的條件下將半胱氨酸殘基加入蛋白質的N-末端或C-末端。
[0035]本發明涉及選擇、產生和使用鏈激酶的一般方法，所述鏈激酶顯示出增加的蛋白水解穩定性、延長的血清清除半壽期和降低的免疫原性。衍生物具有修飾的氨基酸序列但是有效保留它們的生物學活性。本發明還描述了鏈激酶的半胱氨酸變體，其共價連接到不同分子量如5，10，20和40kDa的一個或多個聚乙二醇(PEG)分子。本發明的一個實施方案包括PEG化的鏈激酶衍生物與本領域中已知的用于在身體中有效散布的合適賦形劑、穩定劑和載體的藥物組合物，其用于治療多種循環系統病癥。
[0036]發明詳述
[0037]本發明基于如下實驗發現:一個或多個PEG分子與鏈激酶中策略性取代的或添加的半胱氨酸殘基的共價連接導致生物學活性的PEG化鏈激酶，其與天然鏈激酶相比具有增加的蛋白水解穩定性和延長的清除半壽期以及減少的清除，和更小的免疫反應性。PEG綴合的位點和大小可以在半胱氨酸變體的幫助下定制，其經設計成對于鏈激酶和其活性變體、包括凝塊特異性鏈激酶(在本上下文中可以參考美國專利7，163，817，其描述凝塊特異性鏈激酶變體的設計和構建，由于到在SK蛋白的一個或兩個末端添加血纖蛋白結合結構域而具有增加的血纖蛋白親和力)中的催化功能(纖溶酶原激活)是非抑制性的。在鏈激酶和凝塊特異性鏈激酶多肽中取代、添加或插入一個或多個半胱氨酸使得可以在該多肽的理想位置加入不同分子量的PEG，條件是所述取代和/或添加是以“策略”方式進行，從而完全避免了功能特征的損失，并導致產生未修飾的天然蛋白質中不存在的新的有益特征。PEG放置的選擇基于所選位點的表面可及性和其結構-功能相關性設計。
[0038]本發明的PEG化的鏈激酶與天然分子相比作為治療劑更有用并且使用更方便，因為盡管保留了天然或接近天然狀的生物活性，它們與前者相比時顯示出延長的作用時間，所述天然分子在纖溶酶(原)存在下在體外快速降解，并且在注射后由于快速降解而在非常短的時間內從循環系統被 清除。相反，PEG化的鏈激酶與天然(非PEG化)蛋白質相比顯示出顯著增強的蛋白水解穩定性，免疫反應性更低并且僅在顯著延長的時間后從循環系統中清除。
[0039]因此，本發明的PEG化鏈激酶可以用于治療具有循環系統病癥如靜脈或動脈血栓形成、心肌梗死等的受試者，優點是本發明的PEG化鏈激酶由于延長的作用時間和降低的免疫反應性而具有了增強功效的可能性，其由于最小的抗原性而可能允許重復施用。PEG基團的數目、大小和位置可以以這樣的方式使用使得重新設計鏈激酶以具有不同的半壽期，使得它們的應用有益于具體病癥/臨床綜合征的需要，或者有益于所治療的具體受試者的需要。
[0040]本發明涉及選擇性修飾用于藥物用途的鏈激酶，以增強其藥物代謝動力學性質和提供治療上有用的溶栓劑。本發明也包括鏈激酶的突變體、其天然或人工變體，其保留天然的未修飾分子的理想的生物學性質。本發明的所有變體可以使用本領域已知的常用方法和材料，通過在宿主細胞，如原核宿主細胞如大腸桿菌、或真核宿主細胞如酵母或哺乳動物細胞中表達編碼所需要變體的重組DNA序列來制備。來自不同物種的所編碼鏈激酶的DNA序列信息可以從公開的信息得到。已經研究了鏈激酶基因的多態性并且解釋了它們與發病機理的關聯性(Malke H，1993)。也進行了分子流行病學研究來確定不同的M型的A組鏈球菌菌株和其他鏈球菌種內鏈激酶基因的分布。該研究中檢查的多數菌株通過酪蛋白-纖溶酶原覆蓋測定法(casein-plasminogen overlay assay)顯示為陽性鏈激酶活性。這些研究的總體結果表明，在得自不同鏈球菌種(streptococcal species)的鏈激酶中存在大量的異質性(Huang等；1989)。可能使用具有纖溶酶原活化能力的任一種可用的鏈激酶變體用于半胱氨酸誘變并隨后用巰基反應試劑修飾。
[0041]編碼突變體和物種變體的新的DNA序列可以與天然形式類似地克隆和表達。在遺傳工程化宿主細胞中表達產生的鏈激酶然后可以進行純化，并且如果需要，通過常規方法配制成藥物組合物。
[0042]作為本發明的優選方面，將通過重組方法表達的鏈激酶與合適的硫羥反應試劑在允許硫羥反應性結構部分連接到鏈激酶中所引入的半胱氨酸殘基的巰基的條件下反應。
[0043]術語“硫羥反應物”在本文中定義為具有或者能夠被活化而具有能夠形成與半胱氨酸殘基的巰基(-SH)共價連接的反應基的任何化合物。此類化合物包括聚合物，如聚丙二醇和PEG、基于糖類的聚合物和氨基酸聚合物和生物素衍生物。需要綴合的化合物可以用巰基結構部分，如巰基、硫醇(thiol)、三氟甲基磺酸酯(triflate)、tresylate、氮丙唳(aziridine)或者環氧乙燒(oxiran),或優選地,碘乙酰胺(iodoacetamide)或者馬來酰亞胺(maleimide)活化。綴合基團可以具有不同的分子量，但是對于PEG優選在5000到40，000之間。本發明的一個重要的屬性是賦予PEG化或其他連接的位置選擇性，同時保留蛋白質的正常功能性質。
[0044]因此，本發明提供了具有選自SEQ ID NO:1~24的氨基酸序列的突變鏈激酶多肽，其中取代或插入了至少一個半胱氨酸殘基。表34顯示了對應于SEQ ID NO:1的可能不耐受突變或取代的殘基的殘基。
[0045]在本發明的一個實施方案中，所制備的鏈激酶突變體是具有SEQ ID NO:2_6的鏈激酶功能片段。
[0046]在本發明的一個實施方案中，所制備的鏈激酶突變體是具有SEQ ID N0:7_19的鏈激酶突變蛋白。
[0047]在本發明的一個實施方案中，所制備的鏈激酶突變體是具有SEQ ID NO:20-21的鏈激酶物種變體。
[0048]在本發明的一個實施方案中，所述鏈激酶物種變體顯示出與具有SEQ ID N0:1的天然鏈激酶有75% -100%的氨基酸同源性。
[0049]在本發明的另一個實施方案中，至少一個半胱氨酸殘基取代位于鏈激酶的至少一個區域中的至少一個氨基酸，所述區域選自由下列各項組成的組:SEQ ID NO:1或其突變蛋白或其功能變體的48-64環、88-97環、區域103-106、或119-124或螺旋形成區196-207或環形成區170-181或環形成區254-264或者卷曲螺旋區318-347或者區域360-372，其中所述變體具有如通過標準測定法測量的生物活性。
[0050]在另一個實施方案中，突變鏈激酶多肽包含I到3個半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代位于對應于鏈激酶天然氨基酸序列(SEQ ID NO:I)的至少一個區域中，所述區域選自由下列各項組成的組:氨基酸殘基48-64環、氨基酸殘基88-97環、氨基酸殘基102-106的區域、氨基酸殘基119-124的區域、氨基酸殘基196-207的螺旋形成區、氨基酸殘基170-181的環形成區、氨基酸殘基254-264的環形成區、氨基酸殘基318-347的卷曲螺旋區和氨基酸殘基360-372的區域，其中該突變體可以活化纖溶酶原。
[0051]如本文所用，術語對應于用于指參考蛋白質，例如野生型鏈激酶(SK)或SEQ IDN0:1內列舉的位置，和與參考蛋白質上位置比對的查詢的蛋白質(例如突變SK)中的那些位置。從而，當主題SK的氨基酸序列，例如SEQ ID NOs:2，3，4，5等與參考SK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1比對時，主題SK序列中“對應于”參考SK序列中某些列舉的位置的氨基酸是與參考SK序列的這些位置比對的那些氨基酸，但是不一定在參考SK序列中這些確切的數字表示的位置上。例如，SEQ ID N0:4中的Gly34Cys突變體將“對應于” SEQ ID NO:1中Gly49Cys突變體。
[0052]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體還包含與C-末端、N-末端或者兩個末端融合的血纖蛋白結合結構域。
[0053]在另一實施方案中，如0035III中提到的突變體，其中血纖蛋白結合結構域包含至少一個半胱氨酸取代。
[0054]在另一實施方案中，如0035IV中提到的突變體，其中血纖蛋白結合結構域通過柔性連接寡肽連接到突變鏈激酶。
[0055]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶還包括至少一個額外的氨基酸取代，該氨基酸取代對應于選自SEQ ID NO:1的Asn90Ala，Hisl07Ala，Ser108Ala, Asp227Tyr, Asp238Ala, Glu240Ala, Arg244Ala, Lys246Ala, Leu260Ala,Lys278Ala, Lys279Ala 和 Asp359Arg 的氛基酸取代。
[0056]在另一實施方 案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶包含缺失，該缺失對應于選自Asn90，Asp227和Asp359的氨基酸缺失。
[0057]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶還包含N-和/或C-末端氨基酸延伸。
[0058]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶在對應于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置上包含至少一個半胱氨酸突變。
[0059]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶在對應于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置包含至少兩個半胱氨酸突變。
[0060]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變鏈激酶在對應于SEQ IDNO:1 的 G49, S57, A64, 188，S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173,D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303,L321，L326，A333，D347，D360或R372的位置包含三個半胱氨酸突變。
[0061]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其中該突變體能夠治療下述疾病或病癥，其選自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中風、血管事件、心絞痛(angina)、肺栓塞、短暫性腦缺血發作、深靜脈血栓形成、冠狀動脈介入步驟后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心臟手術、血管手術、心力衰竭、X綜合征和其中發生至少一個冠狀動脈狹窄的病癥。[0062]在另一實施方案中，如00351中提到的突變體，其還包含在至少一個半胱氨酸突變體上取代的半胱氨酸反應性結構部分。
[0063]在另一實施方案中，如35XIII中提到的突變體，其中所述半胱氨酸反應性結構部分是聚乙二醇(PEG)。
[0064]在另一實施方案中，如35XIV中提到的突變體，其中PEG是分子大小為5000道爾頓到40，000道爾頓的線性或分枝聚合物。
[0065]在另一實施方案中，如35XIV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有增加的蛋白水解穩定性。
[0066]在另一實施方案中，如35XIV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有降低的抗原性和降低的體內免疫原性。
[0067]在另一實施方案中，如35XIV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有緩慢的腎清除率和增加的體內半壽期。
[0068]本發明的另一實施方案涉及融合多肽，該融合多肽包含鏈激酶結構域和血纖蛋白結合結構域，該鏈激酶結構域包含一到三個半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代位于血纖蛋白結合結構域內或者位于對應于鏈激酶的天然氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的至少一個區域內，該區域選自SEQ ID NO:1的氨基酸殘基48-64的環、氨基酸殘基88-97的環、氨基酸殘基102-106的區域、氨基酸殘基119-124的區域、氨基酸殘基196-207的螺旋形成區、氨基酸殘基170-181的環形成區、氨基酸殘基254-264的環形成區、氨基酸殘基318-347的卷曲螺旋區和氨基酸殘基360-372的區域，其中該突變體可以活化纖溶酶原并且結合血纖蛋白。
[0069]在另一實施方案中，如35XIX中提到的突變體，其中所述血纖蛋白結合結構域融合到鏈激酶結構域的N末端、鏈激酶結構域的C末端、或者鏈激酶結構域的兩個末端。
[0070]在另一實施方案中，如35XXI中提到的突變體，其中所述血纖蛋白結合結構域融合到鏈激酶結構域的N末端，并且所述融合多肽包含選自SEQ ID NO:22的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372，K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438, L443, A450, D464, D477和R489的至少一個半胱氨酸突變。
[0071]在另一實施方案中，如35XXI中提到的突變體，其中所述血纖蛋白結合結構域融合到鏈激酶結構域的C末端，并且所述融合多肽包含選自SEQ ID NO:23的G49，S57，A64，I88，S93，D95，D96，D102，S105，D120，K121，D122，E148，K156，D173，D174，L179，D181，S205，A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303, L321, L326, A333, D347,D360, R372, H401, A402, D447和G465的至少一個半胱氨酸突變。
[0072]在另一實施方案中，如35XXI中提到的突變體，其中所述血纖蛋白結合結構域融合到鏈激酶結構域的N-末端和C末端，并且所述融合多肽包含選自SEQ ID NO:24的H16，A17, D62, G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239,E265, K273, D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372, K373, K374, S375, L377, E398, K399,F404, D420, L438, L443, A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564 和 G582 的至少一個半胱氨酸突變。
[0073]在另一實施方案中，如35XIX中提到的突變體，其中該突變體能夠治療下述疾病或病癥，其選自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中風、血管事件、心絞痛、肺栓塞、短暫性腦缺血發作、深靜脈血栓形成、冠狀動脈介入步驟后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心臟手術、血管手術、心力衰竭、X綜合征和其中發生至少一個冠狀動脈狹窄的病癥。
[0074]在另一實施方案中，如35XIX中提到的突變體，其還包含在至少一個半胱氨酸突變體上取代的半胱氨酸反應性結構部分。
[0075]在另一實施方案中，如35XXV中提到的突變體，其中所述半胱氨酸反應性結構部分是聚乙二醇(PEG)。
[0076]在另一實施方案中，如35XXVII中提到的突變體，其中PEG是分子大小為5000道爾頓到40，000道爾頓的線性或分枝聚合物。
[0077]在另一實施方案中，如35XXV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有增加的蛋白水解穩定性。
[0078]在另一實施方案中，如35XXV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有降低的抗原性和降低的體內免疫原性。
[0079]在另一實施方案中，如35XXV中提到的突變體，其中該突變體與未PEG化的突變鏈激酶相比具有緩慢的腎清除率和增加的體內半壽期。
[0080]在本發明的再一個實施方案中，SEQ ID NO:22-24是共價修飾的雜合多肽，其包含鏈激酶(SK)的至少一個功能片段和血纖蛋白結合結構域4和5、人纖連蛋白的血纖蛋白結合結構域(FBDs)I和2。
[0081 ] 在本發明的再一個實施方案中，SK的功能片段和所述血纖蛋白結合結構域通過柔性連接寡肽連接。
[0082]在本發明的再一個實施方案中，上述突變體包含N和/或C-末端氨基酸延伸。
`[0083]在本發明的再一個實施方案中，半胱氨酸取代選自G49，S57，A64，188，S93，D95，D96, D102, S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173, D174, L179, D181, S205, A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303, L321, L326, A333, D347, D360, R372的至少一個氨基酸，其中所述變體具有如通過標準測定法測量的生物活性。
[0084]在本發明的再一個實施方案中，半胱氨酸取代選自SEQ ID N0.22的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372，K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438，L443，A450, D464，D477，R489的至少一個氨基酸，其中所述變體具有如通過標準測定法測量的生物活性。
[0085]在本發明的再一個實施方案中，半胱氨酸取代選自SEQ ID N0.23的G49，S57，A64，I88，S93，D95，D96，D102，S105，D120，K121，D122，E148，K156，D173，D174，L179，D181，S205,A251, 1254，N255, K256, K257, S258, L260, E281，K282，F287, D303, L321, L326, A333, D347,D360，R372，H401，A402，D447，G465的至少一個氨基酸，其中所述變體具有如通過標準測定法測量的生物活性。
[0086]在本發明的再一個實施方案中，半胱氨酸取代選自SEQ ID N0.24的H16，A17，D62，G80, G166, S157, A181, 1205，S210, D212, D213, D219, D222, D237, K238, D239, E265, K273,D290, D291, L296, D298, S322, 1371，N372, K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D420,L438, L443, A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564, G582 的至少一個氨基酸，其具有如通過標準測定法測量的生物活性。
[0087]在本發明的再一個實施方案中，取代的半胱氨酸殘基用半胱氨酸反應性結構部分修飾。
[0088]在本發明的再一個實施方案中，取代的半胱氨酸殘基用聚乙二醇修飾。
[0089]在本發明的再一個實施方案中，上述PEG分子是分子大小為5000道爾頓到40，000道爾頓的線性或分枝聚合物。
[0090]在本發明的再一個實施方案中，上述變體與它們最初未修飾的對應物相比具有增加的蛋白水解穩定性。
[0091]在本發明的再一個實施方案中，上述變體與它們最初未修飾的對應物相比具有降低的抗原性和體內免疫原性。
[0092]在本發明的再一個實施方案中，上述變體與它們最初未修飾的對應物相比具有緩慢的腎清除率和因此增加的體內半壽期。
[0093]在本發明的再一個實施方案中，所述藥物組合物包含任選與可藥用賦形劑一起的至少一種半胱氨酸變體。
[0094]在本發明的再一個實施方案中，所述藥物組合物可用于治療下述疾病或病癥，其選自心肌梗死、血管血栓形成、肺栓塞、中風、血管事件、心絞痛、肺栓塞、短暫性腦缺血發作、深靜脈血栓形成、冠狀動脈介入步驟后的血栓形成再阻塞、外周血管血栓形成、心臟手術、血管手術、心力衰竭、X綜合征和其中發生至少一個冠狀動脈狹窄的病癥。
[0095]具體地，本發明描·述了鏈激酶或其突變蛋白的PEG化半胱氨酸變體或雜合的纖溶酶原激活物的PEG化半胱氨酸變體(所述雜合的纖溶酶原激活物包含鏈激酶(SK)之間或者SK的修飾形式或其能夠活化纖溶酶原(PG)的合適部分之間的多肽鍵聯合，和人纖連蛋白的血纖蛋白結合區，該血纖蛋白結合區選自人纖連蛋白的血纖蛋白結合結構域(例如，結構域4和5的配對、或結構域I和2的配對，或其修飾形式))，使得雜合的纖溶酶原激活物具有獨立地結合血纖蛋白的能力，從而由于它們對血塊物質(即血纖蛋白)的增強的親和力而變成凝塊特異性的(美國專利號7，163，817)。
[0096]提供了鏈激酶或其截短形式的單PEG化或雙PEG化或多PEG化的半胱氨酸變體，其不僅對于PG活化能力具有活性，而且顯示出新的和出乎意料的功能屬性。例如，SK的雙PEG化的半胱氨酸變體(其中額外的半胱氨酸置于多肽的兩個末端，即N和C末端)在其人纖溶酶原活化特征方面顯示出出乎意料的特性，因為其與未修飾的SK相比具有顯著更慢的初始纖溶酶原(PG)活化速率，但是當在體外測定PG活化時，在幾分鐘的初始滯后之后，變得完全能夠以相似于未修飾SK的方式活化纖溶酶原。不能立即自身活化(天然未修飾的SK為立即自身活化，其幾乎在接觸時活化PG)是由于其依賴血纖蛋白的作用方式。相反，天然SK不需要任何纖溶酶被活化，但是幾乎在其與PG復合時被活化。從而，在注射到體內后，這種SK變體將通過血管系統開始其旅程，但是仍然為無活性的或者部分活性的狀態。然而，在其接觸凝塊那一刻在凝塊的緊鄰附近，其優先被活化，已知凝塊富含纖溶酶而全身循環系統不是這樣(由于存在纖溶酶特異性Serpins [絲氨酸蛋白酶抑制劑]如α _2_抗纖溶酶和α -2-巨球蛋白)，游離的纖溶酶在“開放”循環系統中被快速失活)，從而避免或者顯著減小了與天然SK施用同時發生的系統性PG活化，天然SK施用在施用時立即活化PG，具有隨后的副作用，如出血和血管系統的多種蛋白質組分的大規模破壞。該性質，即纖溶酶依賴性活化，以及延長的清除半壽期和低免疫原性和抗原反應性，將不僅導致在全身循環中游離纖溶酶的產生總體上減少，而且導致以相對較低的劑量為多種循環疾病反復施用血栓溶解劑而避免不需要的免疫反應的能力。凈結果將是通過顯著降低的治療有效劑量的血栓溶解劑維持靶標處持續并且更有效的血纖蛋白溶解，并且減小副作用，如降低的免疫反應性，和減輕用常規SK經常看到的出血性并發癥。
[0097]本發明提供了鏈激酶或其突變蛋白的PEG化半胱氨酸變體或雜合的纖溶酶原激活物(其包含鏈激酶(SK)之間或者SK的修飾形式或其合適部分之間的多肽鍵聯合)的PEG化半胱氨酸變體，如通過纖溶酶原激活測定法測量，所述變體顯示出與天然鏈激酶相當的體外生物活性，在一些情況下發生的活性降低通過該衍生物的延長的半壽期和/或更低的清除速率而被很好的彌補。
[0098]本發明提供了鏈激酶的PEG化的半胱氨酸變體，在該纖溶酶原激活物暴露于合適的動物或人類纖溶酶原后僅僅超過5分鐘的滯后期后，所述變體顯示出纖溶酶原活化的特征。
[0099]本發明提供了用表達載體轉化或轉染的原核或真核細胞，在所述表達載體中，克隆了表達鏈激酶、其突變蛋白或共價修飾形式的基因，并且能夠表達鏈激酶或其突變蛋白或雜合纖溶酶原激活物的半胱氨酸變體。為了有效表達，對編碼鏈激酶、其突變蛋白和共價修飾形式的DNA序列針對基于細菌或酵母的表達宿主的密碼子偏好進行優化。
[0100]本發明詳述了為了臨床和研究應用以純的和生物學活性形式產生鏈激酶或其活性突變蛋白或雜合纖溶酶原激活物分子的PEG化半胱氨酸變體的方法。
[0101]本發明考慮那些半胱氨酸變體的PEG化，其使用模板多核苷酸，其中用于表達SK的SK編碼多核苷酸通過誘變、通過已知的生物化學或化學DNA合成技術或它們的組合進行修飾，使得保留纖溶酶原激活物活性。
[0102]本發明考慮SK或其截短形式的半胱氨酸變體，其被PEG化但還具有通過多肽連接融合的額外的血纖蛋白結合結構域，使得所得的嵌合體/融合多肽除了顯示出纖溶酶原活化能力外，還顯示出血纖蛋白結合特征。血纖蛋白結合結構域和SK之間的融合可以是直接的，但是也可以通過短的接頭肽區融合，所述接頭肽區包含在構象上不是剛性而是柔性的一段氨基酸序列，如主要由Gly，Ser, Asn, Gln和相似氨基酸組成的那些序列。
[0103]使用標準質粒在強啟動子如tac, trc, T7RNA聚合酶等的控制下,在大腸桿菌中表達SK或其突變蛋白或共價修飾形式的半胱氨酸變體，所述質粒也含有引起所結合的開放閱讀框高水平表達所需的公知特征，所述開放閱讀框編碼SK或其突變蛋白或共價修飾的SK構建體。
[0104]使用標準質粒在酵母表達系統中表達SK或其突變蛋白或物種變體或共價修飾形式的半胱氨酸變體，其中N-末端信號肽被優化用于成熟多肽的有效細胞外分泌。這些信號肽的序列信息可以從酵母表達系統的分泌蛋白得到。此外，此類信息也可以從超分泌并且含有優化的信號序列的其他重組蛋白得到。
[0105]本發明提供了一種方法，其中將使用化學、機械或酶學方法從含有SK或SK嵌合多肽的單、雙或三半胱氨酸變體的細胞得到的粗細胞裂解物進行空氣或巰羥-二硫化物試劑催化反應，或者酶催化的巰羥-二硫化物氧化再折疊以再折疊成含有天然半胱氨酸配對(采用SK的共價修飾形式)的生物活性構象，同時保持額外的半胱氨酸自由用于巰基反應性化學修飾。
[0106]本發明提供了一種方法，其中將使用化學、機械或酶學方法從含有SK的共價修飾形式的單、雙、三或多半胱氨酸變體的細胞得到的粗細胞裂解物用還原和氧化的谷胱甘肽或其他此類試劑的混合物進行氧化和再折疊，所述其他此類試劑有效用于如通過合適的氧化還原電位的巰羥-二硫化物交換(例如，半胱氨酸和胱氨酸)的此類氧化折疊反應，所述氧化折疊反應允許共價修飾形式的SK再折疊成它們的生物活性構象同時保持額外的半胱氨酸自由以用于巰基反應性化學修飾。
[0107]使用標準遺傳方法，SK、其突變蛋白或共價修飾形式的半胱氨酸變體在真核生物如酵母或動物或植物細胞中作為主基因組中摻入的遺傳單位或作為本領域已知的自主遺傳單元表達，以便獲得所摻入的開放閱讀框的高水平表達，該開放閱讀框編碼SK或其突變蛋白或共價修飾的SK構建體。
[0108]本發明提供了一種方法，其中SK或SK嵌合纖溶酶原激活物蛋白的PEG化的半胱氨酸變體可以用作血栓溶解療法或者預防多種血管血栓形成。激活物可以根據常規步驟配制為適于施用于人類的藥物組合物，并且可以包括但不限于穩定劑，如人血清白蛋白、甘露醇等，增溶劑，或者麻醉劑，如利多卡因(Iignocaine)等，以及穩定和/或促進該變體的體內遞送的其他試劑或其組合。
[0109]本發明提供了包含SK或雜合纖溶酶原激活物的PEG化的半胱氨酸變體和穩定劑、以及增溶劑、麻醉劑等的藥物組合物，所述穩定劑包括但不限于，人血清白蛋白、甘露醇等。
[0110]本發明將在下面的實施例中更詳細解釋，然而，實施例不意在限制本發明的范圍。本發明的其他變體、組合和改進將是本領域技術人員顯而易見的。從而，類似的工作或其小心的模擬甚至可能在本發明中沒有公開的和屬于人或非人來源的不同分離物的其他鏈激酶變體中產生相似或改進的特征。
[0111]實施例中使用的 一般方法
[0112]通常，利用分子生物學和蛋白質科學領域中公知的分子方法和技術。這些方法和技術易于從一些標準來源如屬于本【技術領域】的教科書和實驗手冊得到，如SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)(I1.sup.nd edition,Cold Sparing Harbor Press, New York, 1989 ；McPherson, M.J., Quirke, P.,和 Taylor,G.R.， [Ed.]PCR:A Practical Approach(PCR:實用方法)，IRL Press, Oxford,1991,Current Protocols in Protein Science (現代蛋白質科學方法)，由 John Wiley & sons,Inc出版。對于免疫學實驗,參考來自Immunochemical Protocols (免疫化學方法)，HudsonL7Hay FC(1989)第3版.Blackwell Scientific的教科書和實驗手冊。然而,這并不限制描述本發明的具體實驗背景中的詳細解釋，尤其當引入修改以建立步驟時，無論何時相關，在實施例中指出。
[0113]試劑
[0114]在基于T7RNA聚合酶啟動子的表達載體pET_23d中進行SK基因的克隆，并在得自Novagen Inc.(Madison, WI)的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中轉化。熱穩定的DNA聚合酶(Pfu)、限制性內切核酸酶、T4DNA連接酶和其他DNA修飾酶來自New EnglandBiolabs (Beverly, MA)。寡核苷酸引物由下列公司之一提供:加拿大的Biobasic, Inc.,美國的 Integrated DNA technologies,或美國的 Sigma-Aldrich。DNA 的純化和 PCR 擴增產物從瓊脂糖凝膠的提取用來自Qiagen GmbH(德國)的試劑盒進行。使用熒光染料的自動化DNA測序在Applied Biosystems3130xl遺傳分析儀16毛細管DNA測序儀上進行。Glu-纖溶酶原購自 Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,德國)或通過親和層析(Deutsch 和 Mertz,1970)從人血衆純化。N-末端氨基酸測序用Applied Biosystems測序儀476A和491clc型進行。尿激酶、EACA、氰基硼氫化鈉、L-賴氨酸購自美國圣路易斯的西格瑪化學公司(SigmaChemical C0., St.Louis, USA)。苯基瓊脂糖(Phenyl Agarose) 6XL和DEAE Sepharose (FastFlow)購自瑞典烏普薩拉的法瑪西業生物技術(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden),而N1-NTA珠來自Qiagen。所有其他試劑都是可得到的最高的分析級別。
[0115]酪氨酸-纖溶酶原覆蓋用于檢測SK活性:通過在軟瓊脂中覆蓋酪蛋白和人纖溶酶原檢測不同SK衍生物的活性。修改Malke和Ferretti，1984的最初方法，其中將純化的SK(0.5微克)直接點在LB-Amp瓊脂板上標記的凹陷處。然后平板在37°C溫育10分鐘；之后，通過在含有所述點的平板上方輕輕倒出溶液A和B的混合物覆蓋酪蛋白-HPG-瓊脂。溶液A如下制備:將Ig脫脂乳在15ml50mM Tris, Cl (pH7.5)中加熱，然后將其在水浴中保持在37°C備用。溶液B如下制備:在15ml50mM Tris.Cl (pH7.5)中在50°C加熱0.38g瓊脂糖。溶液回火到37°C后，加入3μ I TritonX-1OO (0.04% ν/ν)和200ygHPG。然后平板在37°C溫育并觀察由于HPG活化之后酪蛋白水解引起的透明區域的產生(暈圈形成)。 [0116]對于蛋白水解穩定性,將每種PEG化的衍生物和天然SK與蛋白水解酶如胰蛋白酶或纖溶酶溫育。用于反應中的蛋白酶濃度為所述蛋白質濃度的500-10，000倍。反應物在搖動條件下25°C保持2到4小時。對于測試和對照，在LB-Amp瓊脂板上點樣相同量的受胰蛋白酶作用的蛋白質，并在平板的酪蛋白-纖溶酶原覆蓋后測量殘留活性。
[0117]蛋白質的SDS-PAGE分析:基本上根據Laemmli，U.K.，1970進行SDS-PAGE，如果需要進行微小改動。簡言之，通過與等體積的2倍樣品緩沖液(0.1M Tris Cl，pH6.8 ；6% SDS ；30%甘油；15% β-巰基乙醇和0.01%溴酚藍染料)混合制備蛋白質樣品。對于非還原性SDS-PAGE，在樣品緩沖液中不包括β -巰基乙醇。在裝入凝膠前，將樣品在沸水浴中加入5分鐘。不連續凝膠系統通常在濃縮膠中具有5% (丙烯酰胺濃度)和在分離膠中具有10%(丙烯酰胺濃度)。首先使用Laemmli緩沖液在15mA的恒定電流下進行電泳，直到樣品濃縮，然后轉換到30mA直到電泳結束。電泳結束時，將凝膠浸入甲醇:乙酸:水(4:1:5)中的0.1%考馬斯藍R250中，輕微震蕩，然后在脫色溶液(20%甲醇和10%冰醋酸)中脫色直到背景變得透明。
[0118]PEG化的蛋白質可以通過Kurfiirst (Kurfirst MM., 1992)開發的標準方法用碘額外染色，其特異染色PEG分子。對于純化的PEG變體的碘染色，簡言之，在電泳后，將凝膠浸入5%戊二醛(Merck)溶液中室溫下15分鐘用于固定。之后，如下對PEG進行凝膠染色。首先，將凝膠置于20ml高氯酸(perchloric acid) (0.1 Μ)中15分鐘,然后加入5ml0.5%氯化鋇溶液和2ml0.1M碘溶液(Merck，Titrisol9910)。染色的PEG化蛋白質條帶在幾分鐘內出現。對于SDS PAGE的雙重染色，將碘染色的凝膠使用如[0044]中描述的Laemmli方案通過考馬斯藍R250進一步染色。
[0119]動力學測定法(Shi等，1994，Wu等，1987，Wohl等，1980)用于測定PEG修飾的或未修飾的SK或者其共價修飾變體對HPG的活化，特別當需要測定動力學常數時。加入不同濃度的PEG修飾的或未修飾的SK或者其共價修飾形式(10nM-200nM)至多孔板中至100微升終體積，該多孔板含有在測定緩沖液(50mM Tris-Cl緩沖液，pH7.5，含有0.5_lmM顯色底物和 0.1M NaCl)中的 l-2uM HPG。使用的顯色底物(S-2251，Roche Diagnostics GmbH，德國)為纖溶酶特異的并且在切割時產生黃色產物，其可以在405nm監測。向孔中加入所有其他組分后加入蛋白質等分試樣并將第一次分光光度吸光度設為O。然后在來自美國分子裝置(Molecular Devices USA)的Versa-Max可調微平板讀出器中隨時間測量405nm下吸光度的改變。從英國WHO，Hertfordshire得到的似馬鏈球菌鏈激酶的合適稀釋液用作參照標準來校準未知制劑中的國際單位。
[0120]用于確定PEG修飾的或未修飾的SK和其共價修飾形式的HPG活化活性的穩態動力學常數的測定法。
[0121]為了測定HPG活化的動力學參數，向如上述多孔板中含有不同濃度HPG(0.035到
2.0微摩爾)的測定緩沖液中加入固定量的PEG修飾的或未修飾的SK或其共價修飾形式(0.05-0.1納摩爾)。然后在25°C下10-40分鐘內405nm下用分光光度計測量吸光度的改變。然后通過標準方法(Wohl等，1980)從Michaelis-Menton倒數曲線計算HPG活化的動
力學參數。
[0122]將多種PEG化的SK或其突變蛋白和天然SK用碘125 (I125來自PerkinElmerSingapore Pte Ltd)進行放射性碘化。使用 1dogen(1, 3,4,6_ 四氯 _3 α-6 α - 二苯基 glucoluril(1,3,4,6-Tetrachloro-3α-6 a-diphenylglucoluril))方法(Fraker &Speck, 1978)。根據Fraker和Speck所用的方法,將1dogen溶解在氯仿中并通過噴射氮氣蒸發溶劑而涂布在硼硅玻 璃管壁上。為了碘化，將磷酸緩沖鹽水(PBS)中的蛋白質溶液加入1dogen涂布的管中，并與I125混合。約10_30分鐘后,通過在含有Sephadex G25細小基質的柱(Amersham Biosciences)上脫鹽將放射性標記的蛋白質與游離的放射性碘分離。
[0123]遺傳構建體
[0124]鏈激酶的構建
[0125]含有SK基因的pET載體(pET-23d_SK)的設計和構建已經在Nihalani等，(1998)中描述。其涉及在PBR322中克隆來自似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)H46A的SK基因(Pratap等，1996)，接著亞克隆到pET_23d (含有來自噬菌體T7主要衣殼蛋白的高度有效的核糖體結合位點的表達載體)(Studier和Moffatt, 1986),并進一步修飾該基因的5’末端以減小形成二級結構的傾向。其在編碼SK的開放閱讀框開始處具有Met的起始密碼子的框內并置以便將蛋白質表達為Met-SK。詳細參考可以見Sahni等，2007(美國專利號:7，163,817)
[0126]在SK的情況下也使用修整的模板設計SK突變蛋白以便得到高細胞內表達能力。pET-23d-SK的環狀圖已經在圖2中描述。制備SK的截短衍生物的方案由Nihalani等，1998詳細解釋。除了基因測序外,通過在Applied Biosystems-Perkin Elmer蛋白質測序儀476A或491clc型上蛋白質的氣相N-末端氨基酸測序也建立了 SK和其截短衍生物的真實性。
[0127]通過制備SK編碼DNA和人纖連蛋白的血纖蛋白結合結構域之間的雜合DNA多核苷酸構建SK的共價修飾形式和其在大腸桿菌中的克隆和表達在美國專利號7，163，817中詳細解釋。簡言之，將血纖蛋白結合結構域融合到鏈激酶N-末端或者C-末端或者N和C兩個末端以產生鏈激酶的多種共價修飾形式。
實施例
[0128]實施例1
[0129]選擇用于產生鏈激酶的半胱氨酸變體的蛋白質殘基或區域
[0130]用于取代或缺失的殘基選擇對于保持經修飾多肽的功能性是關鍵的。因此，半胱氨酸誘變計劃需要晶體結構中存在的結構信息和通過解析研究得到的功能知識。在數年內的廣泛結構和功能研究已經收集了關于鏈激酶的不同區域在纖溶酶原活化中的作用的大量信息。為了決定其中可以優選用半胱氨酸取代的天然存在的氨基酸的殘基或者區域，我們利用了存在于SK的三維結構或其分離的結構域中的信息以及它們的功能相關性。用于半胱氨酸誘變的殘基的選擇部分基于確定所述殘基的表面可及性。半胱氨酸插入位點也局限于鏈激酶的柔性區域。為了確定表面暴露，使用DSSP程序。DSSP代碼經常用于以單字母代碼描述蛋白質二級結構。DSSP是“蛋白質二級結構字典(Dictionary of ProteinSecondary Structure) ”的首字母縮寫。DSSP(Kabsch 和 Sander, 1983)程序定義了蛋白質的二屆結構、幾何特征和溶劑暴露，以蛋白質數據庫的形式給出原子坐標。DSSP以平方埃描述每個殘基的暴露。DSSP程序在給定PDB文件上的運行產生了縮寫的DSSP形式輸出。可以在DSSP形式輸出中在標題Acc下得到表面可及性值。為了確定表面暴露，使用微纖溶酶復合體中鏈激酶的解析的晶體結構(Wang等1998，PDB ID1BML)。對于在該結構中缺失的區域(175-181和252-262)，分離的β結構域的晶體結構(Wang等，1999，PDB IDlc4p)用于確定表面暴露。在晶體結構中缺失的一些環被移植在通過實驗獲得的結構中，并且通過分子建模工具確定最優選的構象。不一定在結構中檢測到但是被定義為與它們存在于柔性區中一樣高度可及的殘基也被選擇用于半胱氨酸誘變。表1顯示了 SK (SEQ ID NO: I)的不同半胱氨酸變體的表面可及性值，所述變體被半胱氨酸取代。然而，該表并不限制SK的其他天然存在的氨基酸的半胱氨酸取代的范圍。通過程序DSSP計算的可及性值被直接作為表面暴露的度量。DSSP程序列出了許多表面暴露的殘基。但是在決定用于半胱氨酸取代的殘基時進行小心的選擇。該選擇包括沿著三個不同結構域，即鏈激酶的α、β和Y結構域均勻擴散的突變。也選擇落入二級結構區中`的突變。選擇還包括一些殘基的半胱氨酸替換，所述殘基顯示出非常低的表面可及性，僅僅確保原則上鏈激酶的每個殘基都可以被半胱氨酸替換并且用硫羥反應性試劑成功修飾。
[0131]盡管存在核苷酸和多肽序列多樣性，但是在不同的細菌纖溶酶原激活物之間存在強烈的結構相似性。一個結構域的葡萄球菌激酶與鏈激酶的α結構域有結構同源性。來自乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)的兩結構域牛纖溶酶原激活物也顯示出與鏈激酶的α和β結構域的結構相似性。在不同細菌纖溶酶原激活物中蛋白質三維結構的進化保守性使得可能計劃分離自不同的細菌物種的其他鏈激酶變體的半胱氨酸修飾。
[0132]實施例2
[0133]鏈激酶的半胱氨酸變體的遺傳構建
[0134]一般通過使用本領域已知的常規方法構建用于表達鏈激酶的所有遺傳構建體。例如在'PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR 方法:方法和應用指南)'，Innis.Μ.Α.等編輯，1990.，Academic Press Inc.，San Diego, Calif,和'PCR Protocols:Current Methods and Applications (PCR方法:現代方法和應用)',B.A.White, 1993 編輯，Humana Press, Inc.，Totowa, N.J.，USA 中描述了 DNA 操作以慘入突變的方法。如下制備細菌和酵母表達盒:將編碼需要的鏈激酶的DNA分子插入到合適載體(或者將親本模板DNA插入到載體中并如本文需要那樣誘變序列)，然后用本領域已知的常規方法用所述表達盒轉化宿主細胞。用多種方法如PCR誘變技術(Innis等，1990)、誘變試劑盒，如 Stratagene (" Quick-Change Mutagenesis" kit, San Diego, Calif.)或Promega(Gene Editor Kit,Madison ffis.)出售的那些試劑盒將特定突變引入需要的構建體中。通常，設計寡核苷酸以將核苷酸改變摻入鏈激酶的編碼序列中，其導致天然存在的殘基被需要的殘基取代、缺失或添加。還設計誘變引物在成熟蛋白起始處，即靠近N-末端氨基酸或者突變蛋白的最后一個氨基酸，即在鏈激酶和其截短構建體的C-末端氨基酸之后加入半胱氨酸。使用類似的策略在鏈激酶或者表2中SEQ IDs代表的其任何形式的任何兩個選擇的氨基酸之間插入半胱氨酸殘基。使用標準方法，對SK的多種形式產生相應含半胱氨酸的突變體。不同突變體的轉化克隆然后進行篩選并在Applied Biosystems 3130x1遺傳分析儀16毛細管DNA測序儀上用熒光染料通過自動化DNA測序來驗證。
[0135]表2列出了表達下面之一的不同多肽構建體:鏈激酶、其突變蛋白、物種變體、或者共價修飾形式。鏈激酶的天然全長多肽序列已經被指定為SEQ ID N0:1。SK的截短形式(其中C-末端31個殘基被缺失)通過SEQ ID NO:2描述。SK的截短形式(其中N-末端15個殘基被缺失)通過SEQ ID NO:3描述。含有SK的N-末端15個氨基酸和C-末端31個殘基的缺失的多肽在SEQ ID NO:4中給出。SK的功能片段(其中缺失N-末端49個殘基)被指定為SEQ ID NO:5。其中缺失的N-末端59個和C-末端31個殘基的鏈激酶構建體已經在SEQ ID NO:6中給出。在α結構域中含有天冬酰胺90的丙氨酸取代的SK全長多肽(殘基1-414)通過SEQ ID Ν0:7表示。具有酪氨酸取代丙氨酸的全長SK的β結構域突變多肽在SEQ ID NO:8中給出。類似地，SEQ ID NO:9代表SK的β結構域突變體，其中238位的天冬氨酸殘基用丙氨酸取代。SEQ ID NO:10指定給鏈激酶的β結構域突變體，其中240位的谷氨酸用丙氨酸取代·。SEQ ID Ν0:11和SEQ ID NO: 12分別代表全長SK中244和246位殘基處精氨酸向丙氨酸和賴氨酸向丙氨酸的突變。在SEQ ID Ν0:13中給出了 SK的β結構域的250環突變體，其中260位的亮氨酸殘基用丙氨酸取代。SEQ ID NO: 14顯示了SK的Y結構域突變體，其中359位的天冬氨酸殘基用精氨酸取代。SEQ ID Ν0:15代表SK的雙突變體，其中組氨酸92和絲氨酸93都被丙氨酸取代。SEQ ID NO:16代表SK的另一雙突變體，其中278和279位的兩個連續的賴氨酸殘基用丙氨酸取代。SEQ ID NO:17、SEQID NO:18和SEQ ID NO:19分別給出了 SK的突變體，其中α結構域中90位天冬酰胺、β結構域中227位天冬氨酸或者Y結構域的359位天冬氨酸被缺失。SK的成熟和活性形式可以從鏈球菌屬的許多種和亞種變體得到。為了驗證半胱氨酸誘變和后續不同形式SK的PEG化的可行性,我們選擇了來自鏈球菌(Streptococcus)種，即釀膿鏈球菌(pyogenes)和停乳鏈球菌(dysgalactiae)的SK的變體。來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的SK物種變體在SEQ ID NO:20中給出并且來自停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)的SK物種變體在SEQ ID N0:21中給出。SEQ ID NO:22給出了 SK的共價修飾形式，其中血纖蛋白結合結構域存在于SK的N末端。SK的C-末端血纖蛋白結合結構域融合產物被指定為SEQ ID NO:230在SK的N和C末端都含有血纖蛋白結合結構域的雜合多肽由SEQID NO:24給出。SK的血纖蛋白結構域融合形式的遺傳構建在美國專利號7，163,817中詳述。包括天然全長SK、其突變蛋白、物種變體和共價修飾形式的不同多肽進一步用于產生半胱氨酸變體。
[0136]對表2中提到的不同形式SK產生的半胱氨酸變體已經被指定唯一的SEQ ID。表3到28列出了各變體以及它們唯一的SEQ ID。
[0137]表3:對天然全長SK(SEQ ID NO:1)設計的變體。
[0138]表4:對截短的SK1-383(SEQ ID NO:2)設計的變體。
[0139]表5:對截短的SK16_414(SEQ ID NO:3)設計的變體。
[0140]表6:對截短的SK16-383(SEQ ID NO:4)設計的變體。
[0141]表7:對截短的SK50-414(SEQ ID NO:5)設計的變體。
[0142]表8:對截短的SK60_383(SEQ ID NO:6)設計的變體。
[0143]表9:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:7)設計的變體。
[0144]表10:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:8)設計的變體。
[0145]表11:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:9)設計的變體。
[0146]表12:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:10)設計的變體。
[0147]表13:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:11)設計的變體。
[0148]表14:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:12)設計的變體。
[0149]表15:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:13)設計的變體。
[0150]表16:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:14)設計的變體。
[0151]表17:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:15)設計的變體。
[0152]表18:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:16)設計的變體。
[0153]表19:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:17)設計的變體。
[0154]表20:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:18)設計的變體。
[0155]表21:對突變的SK多肽(SEQ ID NO:19)設計的變體。
[0156]表22:釀膿鏈球菌MGAS10270(SEQ ID N020)的半胱氨酸變體。
[0157]表23:停乳鏈球菌馬樣亞種(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)(SEQ ID N021)的半胱氨酸變體。
[0158]表24:具有N-末端融合的血纖蛋白結合結構域的SK (SEQ ID NO:22)的半胱氨酸變體。
[0159]表25:具有C末端融合的血纖蛋白結合結構域的SK (SEQ ID NO:23)的半胱氨酸變體。
[0160]表26:具有N-末端和C-末端融合的血纖蛋白結合結構域的SK (SEQ ID NO:24)的半胱氨酸變體。
[0161]表27:SK的半胱氨酸插入突變體。
[0162]表28:SK的變體,其中半胱氨酸置于N或C-末端,有或沒有肽延伸。
[0163]這些實例表明可以對幾乎所有形式的SK產生半胱氨酸變體，所述形式如天然全長的、截短的、N或C-末端延伸的或者與其他多肽序列的融合。我們也產生了 SK的取代、插入或缺失突變體的半胱氨酸變體。這證明本發明可應用于所有形式的SK用于半胱氨酸誘變和隨后用硫羥反應試劑修飾。[0164]從實施例2得到的構建體用于所進行的所有進一步實驗以實現本發明。然而，應該理解鏈激酶的半胱氨酸變體列表僅僅是示例性的而不是排他性的。根據本發明的備選和額外半胱氨酸變體的設計和合成在本領域技術范圍之內。可以方便地使用常規技術和方法容易地實現此類變體的合成。
[0165]實施例3
[0166]生物活性鏈激酶的過表達和純化
[0167]待純化的天然鏈激酶蛋白(nSK)、其突變體和其隨后的半胱氨酰突變體都各自從它們的BL21 (DE3)甘油儲液在LB-Amp平板上劃線生長的單個菌落生長。在搖動條件(180-280rpm)下，將pET-23d_SK或SK變體接種到含有100微克/mL氨芐青霉素(LB-Amp培養基)的IOml LB培養基中并在30-37°C下培養8-16小時產生原代培養物。該預先接種物用于以2-10% ν/ν接種500ml LB-Amp培養基并允許在30-37 °C，180_280rpm下生長到0.D6tltlnm(在600納米下測量的光密度)為0.5-1.0。在該階段，其用IPTG(終濃度0.5-1.0毫摩爾)誘導(Chaudhary等，1999 ；Dhar等,2002)并在40°C在搖動條件下進一步生長6-12小時。然后在6000-7000g下離心10分鐘收獲細胞。然后將沉淀用冰冷的緩沖液(終濃度 100-150mM NaCl, 10-50mM Tris-Cl, pH8.0，和 l_5mM EDTA)洗滌兩次并在4°C下進行超聲處理，處理條件為30秒超聲脈沖接著停止相等時間。然后將細胞裂解物以高rpm(10000-14000g)離心15分鐘。SDS-PAGE分析表明90%需要的蛋白質已經進入包含體(IB)。然后在室溫恒定溫和震蕩條件下在8M尿素中溶解IB45分鐘。上清液中的蛋白質在上樣緩沖液(20mM PB中0.4MNaCl)中10倍稀釋(Sundram等，2003)后折疊。樣品然后在苯基瓊脂糖6XL珠上層析并在水中洗脫。將如此得到的蛋白質通過陰離子交換層析在DEAE-Sepharose?柱(GE-Amersham Biosciences)上進一步純化。合并HIC后的蛋白質級分并加入Tris.Cl pH7.5至終濃度20mM Tris.Cl，之后將其裝入填充DEAE-Sepharose (Fast Flow)的用 20mM Tris.Cl (pH7.5)預先平衡的柱子上。用含有 20mMTris.Cl (pH7.5)的緩沖液洗滌后，用20-25mMTris.Cl中鹽的線性梯度(0-0.5M NaCl)洗脫結合的蛋白質。洗脫的SK蛋白質純度通常大于95%，其通過SDS-PAGE分析。用Bradford的蛋白質估計方法(Bradford., 1976)測量每個級分中蛋白質的量并通過280nm下的吸光度證實。所有層析步驟在4°C下進行。含有蛋白質的級分與標準SK和分子量標準一起在SDS-PAGE上分析。適當地合并需要的級分以得到SK或SK突變體的同質制備物。
[0168]在美國專利7，163，817中描述了在大腸桿菌中SK和血纖蛋白結合結構域(FBDs)形成的多種構建修飾的構建體的過表達和純化以及它們的體外再折疊，其中將表達的蛋白質進行體外再折疊并通過柱層析純化。簡言之，將溶解的包含體用蒸餾水稀釋到lmg/ml的最終蛋白質濃度；加入下面的額外組分(給出了在稀釋的混合物中的終濃度):Tris-Cl，pH8.0,50mM ；NaCl 100-150mM ；EDTAl-5mM ;還原和氧化的谷胱甘肽 1.25mM:0.5mM 的混合物。在填充血纖蛋白-sepharose珠的層析柱上分離和純化再折疊群體。關于再折疊蛋白質的再折疊、純化和表征的詳細描述參見Sahni等；2007(美國專利號7，163，817)。
[0169]實施例4
[0170]鏈激酶的半胱氨酸變體與聚乙二醇的共價綴合
[0171]鏈激酶的半胱氨酸變體的硫羥基用不同大小如5KDa，20KDa和40KDa的馬來酰亞胺活化的線性甲氧基PEG而選擇性PEG化(JenKem Technology, USA)。關于PEG化反應，將待PEG化的多肽保持在含有100-150mM NaCl的50_100mM Tris-Cl緩沖液pH8.0中。向其中加入5摩爾過量PEG試劑。計算摩爾過量時考慮要與PEG試劑反應的自由硫羥基數目而不僅僅是蛋白質的摩爾濃度。將反應混合物在室溫下攪拌1.5-4小時，然后通過加入ImMDTT終止反應。通過DEAE sepharose柱(GE-Amersham Biosciences)上的陰離子交換層析從游離PEG和未反應的SK純化PEG化的蛋白質。用pH7.4的25mM磷酸鈉緩沖液稀釋反應混合物10-15倍，之后將其上樣到填充DEAE-Sepharose (Fast Flow)的預先用相同緩沖液平衡的層析柱上。用含有25mM磷酸鈉的緩沖液洗滌后，用25mM磷酸鈉中的線性鹽梯度(0-0.5M NaCl)洗脫結合的蛋白質。備選地，如果一些PEG化的衍生物不能通過離子交換與未反應的PEG完全分離,將這些反應物進行在Sephadex75 (Amersham Biosciences)上的大小排阻層析，使用中性pH和最終NaCl濃度100-150mM的緩沖液。而且，在一些情況下，顯示出二硫鍵結合的二聚體的純化的半胱氨酰基化蛋白質樣品首先通過加入IOmM DTT還原。DTT處理的樣品在填充S^hadex G-25 (細小)珠的層析柱上脫鹽，立即用于PEG綴合。由于分子間二硫鍵形成的SK的同二聚體形式也可以用大小排阻層析在S印hadex75上分離，并且由于其大尺寸和緩慢清除而比單體鏈激酶在治療用途方面更有用。
[0172]通過SDS PAGE證實所有情況下的PEG交聯。凝膠電泳表明在除去未反應的蛋白質和游離PEG試劑后得到的級分中PEG化蛋白質>95%。圖1顯示了 SK的一些單和二 PEG化的變體。圖A顯示了鏈激酶的α結構域的一個代表性(D95C，SEQ ID N0:30)PEG化半胱氨酸變體，其中天然存在的天冬氨酸殘基已經用半胱氨酸替換并且用分子量20KDa的甲氧基PEG馬來酰亞胺綴合。圖B描述了鏈激酶的β結構域的一個代表性(S258C，SEQ IDNO:49)PEG化半胱氨酸變體，其中β結構域中的250環中的天然存在的絲氨酸殘基已經用半胱氨酸替換并且用20KDa分子量的甲氧基PEG馬來酰亞胺綴合。圖C顯示了鏈激酶的Y結構域的一個代表性(C_Cys，SEQ ID NO:490)PEG化半胱氨酸變體，其中一個半胱氨酸已經置于SK的C-末端并且用20KDa分子量的甲氧基PEG馬來酰亞胺綴合。圖D顯示了 SK的一個雙PEG化的半胱氨酸變體(SEQ ID NO:493)，其中一個半胱氨酸置于分子的N-末端和C-末端各端并且用20KDa分子量的甲氧基PEG馬來酰亞胺綴合。進行SK的兩個末端處的PEG綴合，假設兩個大的PEG基團將在柔性袋(flexible cocoon)中包住蛋白質并且在延長的時間內延長其體內存活。 同時，免疫顯性區的廣泛掩蔽可以在受試者中引起注射分子的可忽略的免疫反應性。合并含有PEG化蛋白質的級分并配制用于活性測定，在一些情況下，通過MALD1-T0F質譜法進一步表征。質譜法還證實鏈激酶和其共價修飾形式的PEG加合物的預期分子量。
[0173]實施例5
[0174]酪蛋白-纖溶酶原覆蓋用于快速檢測纖溶酶原活化能力
[0175]通過在軟瓊脂中覆蓋酪蛋白和HPG檢測SK和SK嵌合體的不同半胱氨酸變體的活性。修改了 Malke和Ferretti, 1984的初始方法，其中將純化的SK(0.1-0.5微克)直接點到LB-Amp瓊脂平板上經標記的凹陷上。然后將平板在37°C溫育10分鐘；之后，通過在含有點的平板上方小心傾倒溶液A和B的混合物覆蓋酪蛋白-HPG-瓊脂。溶液A如下制備:將Ig脫脂乳在15ml50mM Tris, Cl (pH7.5)中加熱，然后將其在水浴中保持在37°C備用。溶液B如下制備:在15ml50mM Tris.Cl (ρΗ7.5)中在50°C下加熱0.38g瓊脂糖。溶液回火到37。。后，加入3 μ I TritonX-100 (0.04% ν/ν)和 100-200 μ g HPG并溫和混合，不產生泡沫。然后平板在37°C溫育1-4小時并觀察由于HPG活化之后酪蛋白水解引起的透明區域的產生(暈圈形成)。考慮瓊脂糖培養基中圍繞孔的裂解區(暈圈)的面積以比較鏈激酶和其共價修飾變體的纖溶酶原活化能力。鏈激酶的所有半胱氨酸變體都保持了大部分纖溶酶原活化能力，如通過酪蛋白-HPG覆蓋測定法檢測。取鏈激酶的半胱氨酸變體用于與5000道爾頓到40，000道爾頓的不同分子量的硫羥反應性PEG進行PEG綴合并使用酪蛋白-HPG覆蓋測定法測定它們的活性和與PEG綴合的活性，驗證纖溶酶原活性能力的損失。鏈激酶的所有PEG修飾的變體在酪蛋白裂解測定法下顯示出重要的纖溶酶原活化能力并且在治療上有用。然而，臨床上需要的合適半壽期與降低的免疫原性的理想組合使得一些衍生物比其他的更有用。相比，一些情況下降低的活性可以通過增加的蛋白水解能力和PEG蛋白質加合物的體內半壽期彌補。
[0176]備選地，也如[0046]和[0047]中解釋的，測量纖溶酶原活化能力。表29顯示了一些代表性PEG化SK變體的HPG活化能力和動力學常數。表30概述了含有血纖蛋白結構域融合的共價修飾鏈激酶的不同PEG化變體的活性范圍。
[0177]截短形式SK(50-414和60-383)和它們的PEG化變體的活性測量需要補充合成的肽1-49用于最佳氨基裂解和纖溶酶原活化能力。文獻中已經記載了缺少對應于1-59區的N-末端肽的SK截短變體，其是弱的纖溶酶原激活物，并且在反應混合物中補充SK1-59肽時對于最佳氨基裂解和纖溶酶原活化能力顯示出增加的活性(Nihalani等，1998和Sazonova等，2004)。不含有1-49或者更短的N-末端肽的SK的PEG化衍生物顯示出對纖溶酶原活化的血纖蛋白依賴性；因此它們的作用主要局限于凝塊，使得它們是凝塊特異性的。
[0178]實施例6
[0179]鏈激酶的 PEG化半胱氨酸變體的蛋白水解穩定性
[0180]對于蛋白水解穩定性，將50微克每種PEG化的衍生物和天然SK (作為對照)與50微升50mM Tris-Cl和IOOmM NaCl溫育。向其中加入胰蛋白酶到PEG化蛋白質:胰蛋白酶的最終比例為1000:l(w/w)。反應物在搖動條件下25°C下保持2到4小時。將胰蛋白酶化蛋白質的等分試樣點樣到LB-Amp瓊脂板上并以與實施例5中對于檢測SK活性所解釋的類似的方式測量殘留活性。點樣來自對照反應的相等等分試樣，對照反應中，向反應物中僅僅加入胰蛋白酶或者僅僅SK或SK雜合物。在這種情況下，對每種胰蛋白酶化的PEG化鏈激酶或者共價修飾變體測量瓊脂糖覆蓋物上裂解區。裂解區面積成為受保護的鏈激酶或其變體的殘留纖溶酶原活化能力的直接度量。當不同的SK變體用單、雙或三PEG結構部分綴合并與胰蛋白酶或纖溶酶溫育時，在該研究中該測定法顯示出對不同SK變體的顯著保護。我們發現將一個以上的PEG基團連接到SK變體使得蛋白水解穩定性倍增。
[0181]備選地，通過使用前面描述的一步分析法使用生色底物通過分光光度法[0046]測試其纖溶酶原活化能力，也證實了胰蛋白化PEG化鏈激酶或其共價修飾變體的殘留活性測量。向在測定緩沖液(50mM Tris-Cl緩沖液，pH7.5，含有0.5_lmM生色底物和0.1M NaCl)含有1_2μ M的HPG的多孔板中加入不同濃度(1-1OnM)的胰蛋白酶化SK和PEG化SK變體至最終體積100微升。向孔中加入所有其他組分后加入蛋白質等分試樣。然后在來自Molecular Devices Inc., USA的Versa-Max型可調微平板讀出器中測量405nm下吸光度隨時間的改變。通過該方法得到的結果與通過酪蛋白裂解測定法得到的結果一致。發現當與胰蛋白酶溫育時在鏈激酶和其共價修飾形式的所有PEG化形式中保留了顯著功能活性。未PEG化的鏈激酶當進行相似條件時僅僅顯示出可檢測的活性并且易于被胰蛋白酶消化。
[0182]也在還原SDS-PAGE上檢查了進行胰蛋白酶處理的樣品以物理上觀察蛋白水解穩定性，和由于蛋白水解導致的截短片段的產生。這得到了受保護蛋白質進行胰蛋白酶消化的定性評估。為此，從反應混合物以不同時間間隔取等分試樣并通過加入20M過量大豆胰蛋白酶抑制劑(GE-Amersham Biosciences)抑制以終止任何進一步的胰蛋白酶活性。在不同時間點(5-180min)收集的樣品在10% SDS-PAGE上進行電泳并分析受保護的完整蛋白質。從該工作得到的結果也證實了我們的胰蛋白酶化蛋白質的功能檢查。在測定條件下更多殘留的纖溶酶原激活能力也反映在當在SDS-PAGE上檢查物理完整性時蛋白質的更多保護中。
[0183]實施例7
[0184]N和C末端延伸的SK變體和它們的PEG修飾形式
[0185]為了建立在鏈激酶或其變體的N或C末端的一些氨基酸的任意延伸將不變地產生與用它們未延伸的對應物所得到的相同結果，將SK或其半胱氨酸變體在N-末端或C-末端用小的氨基酸延伸進行修飾。
[0186]使用兩種不同策略制備N-末端延伸形式，得到兩種不同長度的多肽，即一個具有6個氨基酸的延伸，另一個具有20個氨基酸的延伸。使用重疊延伸策略,將編碼6個組氨酸殘基的18個核苷酸的延伸置于成熟鏈激酶的N-末端氨基酸之前。該修飾的產物為N-末端延伸的蛋白質，其具有額外的6個氨基酸。為了摻入20個氨基酸的延伸，將編碼SK或其變體的盒從 pET23d 轉化為 pET15b (Cat.N0.69661-3，Novagen, Inc.US)。將盒置于 pET15b中得到了 20個氨基酸的N-末端延伸，其包括一段6個組氨酸殘基和凝血酶切割位點。用凝血酶可以實現從多肽切割N-末端延伸。這除去了一段組氨酸標記并且產生了僅具有SK的氨基酸序列的經加工的多肽。SEQ ID N0496顯示了由于在pET15b中克隆得到的SK的氨基酸序列。
[0187]為了產生C-末端延伸產物，使用`重疊延伸策略將一段6個組氨酸殘基加入剛好SK或其變體的最后一個氨基酸之后。這導致額外的6個殘基置于C-末端。使用金屬親和層析或者實施例2中解釋的純化方法純化蛋白質得到同質的純化產物。隨后，使用實施例4中解釋的化學方法用PEG修飾SK或其變體的這些純化的N或C-末端延伸產物。功能活性和蛋白水解穩定性的生物化學表征產生了與它們的未延伸對應物所得的結果相似的結果。這給出了有力的證據斷定SK或其變體的其他N-或C末端延伸產物將產生相似的結果。技術人員可以想到延伸SK或其變體的N-和C-兩個末端以產生鏈激酶的功能形式的無數可能性，所述功能形式可以用于半胱氨酸取代、插入或添加和隨后用PEG或其他巰基反應試劑對它們進行巰羥修飾。
[0188]實施例8
[0189]對SK變體分配新的功能屬性，其中PEG基團連接到SK或其截短變體的兩個末端，即N和C末端。
[0190]觀察到對研究中的鏈激酶和其任何截短的功能變體的N-和C末端同時加入PEG基團使得其活性依賴于纖溶酶。當我們觀察到雙PEG化的SK變體在纖溶酶原激活圖譜中顯示出幾分鐘的滯后(見圖3)時，指定了該新的功能屬性。讓我們驚奇的是，當雙PEG化的SK變體在與纖溶酶復合后檢查纖溶酶原激活時，其顯示出纖溶酶原激活的正常(即天然SK樣)動力學(見圖4)。不能立即自活化(天然的未修飾SK是立即自活化，其幾乎在接觸時就活化PG)是由于其作用的纖溶酶依賴模式。相反，天然SK不需要任何纖溶酶被活化，而是其與PG—旦復合就幾乎被活化。在實驗中，在纖溶酶原激活的進展曲線的不同時間點(即在早期(滯后期中)、快速活化期等)從反應物抽取樣品，并用SDS-PAGE分析以跟蹤產物的類型，觀察到在產生截短的片段后緊接著活化，其中在多肽末端含有PEG的肽區段被纖溶酶的作用切除。通過質譜法分析得到相似的結果。這些結果清楚地建立了 PEG修飾的SK的纖溶酶原活化與去除PEG基團之間的相關性，表明纖溶酶介導的活化機理，其中大的PEG基團一旦被除去，允許SK片段與纖溶酶原相互作用，正如nSK —樣，并將其快速活化。因此，末端PEG基團的存在——除了賦予(不管位置如何)預期的對蛋白水解的穩定影響、免疫反應性等之外——還導致出乎意料地產生纖溶酶依賴的“開關”，其在血栓溶解療法中具有非常有益的作用。
[0191]在截短SK的其他雙PEG的半胱氨酸變體中發現了纖溶酶依賴性的功能屬性，即內在的“纖溶酶開關”，其中將額外的半胱氨酸置于多肽的兩個末端，即N和C末端，其在人纖溶酶原激活特征方面顯示出出乎意料的性質，因為它與未修飾的SK相比顯示出活化纖溶酶原(PG)的顯著更慢的初始速度，但是當測定體外PG活化時，在幾分鐘的初始滯后之后，變得完全能夠以類似于未修飾SK的方式活化纖溶酶原。表4顯示了 SK和兩種不同的雙PEG化SK變體的HPG活化的穩態動力學參數。NC1-414表示SK變體，其中半胱氨酸已經加入天然存在的N-末端氨基酸之前和C-末端氨基酸之后以產生SK的雙半胱氨酸突變體。NC1-383表示SK的截短變體，其中一個半胱氨酸分別被加入天然存在的N-末端氨基酸之前和與第383個氨基酸相鄰的三個連續甘氨酸殘基之后。數據表明兩種雙PEG化的變體在變得完全有功能之前都顯示出顯著的初始滯后。當從消除滯后期之后的反應進行曲線的線性期計算時，動力學參數表明初始滯后結束后一旦完全活化，兩種雙PEG化的變體當與SK比較時在它們的PG活化能力方面變得有顯著活性。用兩種雙PEG化SK變體(其中PEG連接到末端)得到了相似結果，表明該新的功能屬性有效地依賴于位置的并且不僅僅依賴于同一分子中存在雙PEG修飾。從而，只要SK的任何功能片段中N和C-末端的兩個末端之一或兩者被PEG化，纖溶酶依賴性`都被賦予該分子。
[0192]此外，將對本領域技術人員顯而易見的是，此類功能屬性也可以通過在兩個末端中和周圍的任何修飾(如合適的賴氨酸側鏈)而賦予該分子，由于鏈激酶的蛋白水解加工將也導致纖溶酶原激活特征的纖溶酶依賴性滯后，其中通過蛋白水解除去此類“封端”基團，其可以是PEG結構部分、其他蛋白質結構域、完整蛋白質如白蛋白等等，允許多肽的其余部分相對于纖溶酶原活化變成功能活性的。因此，當使用可利用的任何化學方法將PEG基團連接在末端時可以預期類似的效果。一種此類化學方法利用N-末端的α氨基的差別性PKa值來將胺反應性PEG基團特異性綴合在α胺處。末端的不同的截短組合的類似屬性表明只要兩個PEG基團置于兩個末端中或周圍的任意位置，就可以在分子中產生纖溶酶依賴性。
[0193]從而，注射到體內后，此類SK變體將通過血管系統輸送，而仍然處于無活性的或部分活性狀態。然而，其將在接觸凝塊時在凝塊附近優先變得活化，已知凝塊是富含纖溶酶的而全身循環不富含纖溶酶((由于存在纖溶酶特異性Serpins [絲氨酸蛋白酶抑制劑]如α -2-抗纖溶酶和α -2-巨球蛋白)，游離的纖溶酶在“開放”循環中被快速失活)，從而避免或者顯著減小了與天然SK施用同時發生的系統性PG活化，天然SK施用在施用時立即活化PG，這具有隨后的副作用，如出血和血管系統的多種蛋白質組分的大規模破壞。該性質，即纖溶酶依賴性活化，以及延長的清除半壽期和低免疫原性和抗原反應性，將不僅導致在全身循環中游離纖溶酶的產生總體上減少，而且導致以相對較低的劑量為多種循環疾病反復施用血栓溶解劑而避免不需要的免疫反應的能力。凈結果將是通過顯著降低的治療有效劑量的血栓溶解劑維持靶標處持續并且更有效的血纖蛋白溶解，并且減小副作用。
[0194]在該屬性上的進一步改進是通過將PEG基團置于SK50-414或SK60-383變體的兩個末端賦予雙PEG化分子血纖蛋白依賴性。該結果是可能的，因為“催化性開關”(SK殘基1-59)的缺失改變了 SKa結構域的構象，并且將此類截短的片段轉化為血纖蛋白依賴的纖溶酶原激活物，如Reed等，1999和Sazonova等，2004報道。設計此類雙PEG化變體的預期結果是纖溶酶依賴性和改進的血纖蛋白依賴性/親和力。這兩者屬性，即纖溶酶依賴性和血纖蛋白親和力/選擇性使得該分子成為高度針對血纖蛋白凝塊的PG激活物。此類分子可以有效避免全身性PG活化的問題，并且允許僅僅在血纖蛋白凝塊附近發生嚴格的PG活化。
[0195]實施例9
[0196]鏈激酶的PEG化半胱氨酸變體的藥物代謝動力學分析
[0197]用于動物中注射的所有蛋白質通過穿過由多粘菌素B (Polymyxin)瓊脂糖(BioRad Inc., Palo Alto, CA,美國)凝膠組成的柱子完全處理以除去內毒素。代表每個結構域中半胱氨酸摻入的多種單PEG化的SK衍生物和天然SK(作為對照)用1dogen (Fraker&Speck.1978)方法用125I放射性碘化,并通過穿過Sephadex G-25脫鹽柱與游離的放射性碘分離。用3%異氟烷(iso-fluorane)麻醉⑶I小鼠(23_25g)并通過將尾巴暴露于100瓦熒光燈誘導 輕微血管舒張。然后通過尾靜脈對小鼠注射在無菌鹽水中的約7微克放射性碘化的蛋白質，使用尾部處理或者從后眼窩竇隨時間收集約50微升全血樣品并保持在肝素化的eppendorf管中。處理樣品以產生血衆并在Perkin-Elmer Y -閃爍計數器中評估125I活性。測定血漿125I活性后，向每份血漿等分試樣加入等體積的20% TCA,以測定保持與完整蛋白質結合的125I活性量。將樣品快速渦旋混合并置于冰上15分鐘。等分試樣以約3000x g離心10分鐘，從每個樣品吸取含有游離標記或者與片段化蛋白質結合的標記的上清液。分析所得的TCA沉淀的沉淀物的125I活性。通常，處理一式兩份樣品并將值平均。
[0198]注射鏈激酶的PEG化半胱氨酸變體后不同血漿樣品中殘留的酸可沉淀的放射性用于體內半壽期測定。半壽期研究結果表明當它們與單或雙或三個PEG結構部分綴合時，不同的PEG變體的不同程度的體內保留。結果表明加入多于一個PEG基團，所得的半壽期也增加。一些所選的PEG化SK變體的半壽期總結在表32中，其顯示了對于鏈激酶的不同的單、雙和三PEG化的半胱氨酸變體，清除半壽期平均增加5到120倍。發現SK的PEG化半胱氨酸變體的血漿保留時間取決于PEG連接的位置。α 88-97環PEG變體顯示出體內保留時間的最大增加(~15-20倍)，而SK的β結構域PEG變體顯示出體內保留的中等增加(~10-12倍)。Y結構域PEG變體顯示出體內半壽期接近4-5倍增加。通常，所有PEG化的鏈激酶當與天然SK(12-15分鐘)相比時顯示出半壽期的多倍增加。這表明PEG化半胱氨酸變體的體內半壽期的顯著增加，并且表明PEG化SK的延長的作用時間。PEG化后用其他半胱氨酰SK變體得到了相似的結果。公知PEG化變體的延長的作用時間是PEG結構部分的結果并且不依賴于SK上PEG聚合物的位置。從而，通過半胱氨酸殘基連接PEG結構部分將導致PEG化或SK嵌合變體具有延長的作用時間特征，這允許較少施用PEG化的化合物而在延長的時間內保持高血液水平的該化合物。
[0199]當連接兩個PEG基團時清除半壽期的相加性表明可以通過以所需的數目、位置綴合PEG基團以及通過改變PEG聚合物大小，隨意地或者定制操縱清除半壽期。
[0200]實施例10
[0201 ] 鏈激酶的PEG化半胱氨酸變體的免疫反應性 [0202]通過基于ELISA的方法檢查nSK和SK與其共價修飾的形式的PEG化半胱氨酸變體針對兔中產生的SK(多克隆)抗血清的反應性。ELISA的步驟如下。
[0203]1.將SK和PEG化SK變體首先在0.2M碳酸氫鹽緩沖液，pH9.2中稀釋得到100微升含有0.75微克到1.5微克蛋白質的溶液，并將其加到微量滴定板(Nunc96-孔微量板，Cole-Parmer USA)的每個孔中。
[0204]2.將抗原包被的平板用石蠟覆蓋并在冷室中在含有濕紙巾的潮濕盒子中過夜溫育或者在室溫并且潮濕、溫和搖動的條件下溫育2小時。
[0205]3.將平板倒空，并且將未占據的位點用200μ I封閉緩沖液在室溫封閉I小時，所述封閉緩沖液含有在磷酸緩沖鹽水(PBS)中的5-10%脫脂乳。
[0206]4.將平板倒空并且用由PBS組成的洗滌緩沖液洗滌四次。
[0207]5.首先在PBS中稀釋一級抗體溶液，得到50000倍的稀釋倍數。向每孔加入100 μ I稀釋的抗體。然后在溫和搖動下室溫下溫育平板45-60分鐘。
[0208]6.再次倒空平板并用洗滌緩沖液洗滌四次。
[0209]7.在PBS中適當稀釋針對抗原的辣根過氧化物酶(Horse-redish peroxidase)標記的抗體。向每孔中加入100 μ I該稀釋液并在室溫溫育I小時。
[0210]8.再次倒空平板并用IX PBS洗滌六次。
[0211]9.向每孔加入ΙΟΟμΙΙΧ TMB(四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine)液體底物，Sigma-Aldrich,美國)并在室溫下放置平板10分鐘。
[0212]為了停止反應，向每孔加入50 μ IlN硫酸并在450nm通過分光光度計讀出顯色。
[0213]為未修飾的nSK和SK的多種PEG化變體得到的ELISA中450nm下的吸光度值用于評估它們針對兔中產生的SK多克隆血清的免疫反應性的相對水平。ELISA研究表明在SK的三個結構域的任一個中綴合一個20KDa的PEG基團將其針對SK多克隆血清的反應性降低到20%以下。綴合兩個20KDa的PEG基團，即一個在SK的N末端，另一個在C末端，將它們針對SK多克隆血清的反應性降低到10%以下。綴合三個20KDa的PEG基團，即SK的每個結構域一個，使得反應性基本上檢測不到。所以，PEG結構部分與SK的不同區域的綴合明顯降低了它們對SK多克隆血清的反應性。體外測試表明降低的抗體反應性，確定了一旦PEG化的蛋白質被注射到活動物中，就降低了免疫反應的誘導。
[0214]表33列出了 PEG化SK變體中保留的免疫反應性百分比，這是將野生型未修飾SK的反應性視作100%。本發明從而公開了具有顯著降低的免疫反應性而具有完整的溶血栓效力的PEG化的鏈激酶變體。
[0215]本發明的優點[0216]本發明的優點在于公開了鏈激酶、其突變蛋白、物種變體和共價修飾形式的半胱氨酸變體的設計。本發明中公開的與半胱氨酸變體的位點特異性PEG綴合對鏈激酶分子賦予了多種有用的治療性質，如增加的蛋白水解穩定性、增加的體內半壽期和降低的免疫反應性。更具體地，本發明涉及生產工程化的鏈激酶衍生物用于治療循環系統病癥的藥物組合物中。
[0217]表1
[0218]為半胱氨酸取代所選的多種氨基酸的溶劑可及性值
[0219]
SK或變體.Τ_胱鉍酸突變位置可及性
188α結構域的88-97環30
S93α結構域的88-97環42
D95α結構域的88-97環
D96α結構域的88-97環58
D102α結構域的β458
S105β4，前123
D120β5和β6之間的區域65
Κ12〗β5和β6結構域 之間的區域1Q9
D122α結構域的β5和β6結構域之間的區域 101
Ε148α和β結構域的接頭區118
Κ156α和β結構域的接頭區109
Dl73β結構域的β?和β2之間的環145
D174β結構域的β?和β2之間的環111
L179β結構域的β254
[0220]
【權利要求】
1. 一種多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO:22-24組成的組的氨基酸序列。
2.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含具有選自由SEQ ID NO:22-24組成的組的氨基酸序列的多肽。
3.一種治療血栓形成的方法，所述方法包括具有選自由SEQ ID NO:22-24組成的組的氨基酸序列的多肽。
4.具有選自由SEQID NO:22-24組成的組的氨基酸序列的多肽在制備用于治療血栓形成的藥物中的用途。
5.一種多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
6.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含SEQ ID NO:24的多肽。
7.一種利用SEQ ID NO:24的多肽治療血栓形成的方法。
8.SEQ ID NO:24的多肽在制備用于治療血栓形成的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P7/02GK103627690SQ201310559849
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2009年3月31日 優先權日:2008年3月31日
【發明者】謝卡爾·庫馬, 尼拉·馬赫什瓦里, 吉里什·薩尼 申請人:科學與工業研究委員會