古羅糖醛酸寡糖的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開古羅糖醛酸寡糖的應用，將所述古羅糖醛酸寡糖用于制備一氧化氮生成促進劑。經過研究發現，古羅糖醛酸寡糖可激活巨噬細胞表達iNOS?mRNA和蛋白，進而促進NO的生成，因此，可將古羅糖醛酸寡糖作為一氧化氮生成促進劑。
【專利說明】古羅糖醛酸寡糖的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及古羅糖醛酸寡糖作為一氧化氮生成促進劑的新應用。
【背景技術】
[0002]一氧化氮(NO)被美國《Nature》雜志選為1992年的“明星分子”之一，在機體生理功能的調控上具有重要的作用，包括作為內皮細胞松弛因子、神經遞質以及調控宿主防御等。NO在體內主要通過一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸和分子氧生成L-胍氨酸的過程中生成的。NOS有3種同工酶，包括內皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS )、神經型一氧化氮合酶(nNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，存在于多種不同的細胞和組織中。iNOS主要存在于巨噬細胞等免疫細胞中。巨噬細胞是參與免疫反應的重要細胞之一，巨噬細胞參與免疫反應時，通過釋放NO和ROS來殺傷外來侵入微生物和腫瘤細胞，對于機體防御具有重要的作用。
【發明內容】
[0003]鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供古羅糖醛酸寡糖的新應用，將古羅糖醛酸寡糖作為一氧化氮生成促進劑，旨在提供一種新的促進巨噬細胞生成一氧化氮的方法。
[0004]本發明的技術方案如下:
[0005]古羅糖醛酸寡糖的應用，其中，將所述古羅糖醛酸寡糖用于制備一氧化氮生成促進劑。
[0006]古羅糖醛酸寡糖的應用，其中，將所述古羅糖醛酸寡糖用于制備促進巨噬細胞生成一氧化氮的一氧化氮生成促進劑。
[0007]古羅糖醛酸寡糖的應用，其中，所述一氧化氮生成促進劑為藥物或保健食品。
[0008]有益效果:本發明中首次發現GOS能通過激活RAW264.7細胞中iNOS基因和蛋白水平的表達，進而促進NO的生成，并且呈時間依賴性和濃度依賴性。說明GOS可作為一種促進巨噬細胞生成NO的增強劑，對GOS作用NO生成促進劑的新藥研制以及保健食品的開發提供新的方向。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1A為本發明實施例1中促進RAW264.7細胞生成NO的檢測結果圖。
[0010]圖1B為本發明實施例1中GOS促進RAW264.7細胞生成NO的時間梯度實驗檢測
結果圖。
[0011]圖1C為本發明實施例1中GOS促進RAW264.7細胞生成NO的濃度梯度實驗。
[0012]圖2A為本發明實施例2中促進RAW264.7細胞表達iNOS mRNA的檢測結果圖。
[0013]圖2B為本發明實施例2中GOS促進RAW264.7細胞表達iNOS mRNA的時間梯度實驗的檢測結果圖。
[0014]圖2C為本發明實施例2中GOS促進RAW264.7細胞表達iNOS mRNA的濃度梯度實驗的檢測結果圖。
[0015]圖3為本發明實施例3中促進RAW264.7細胞中iNOS蛋白的表達的檢測結果圖。
[0016]圖4A1~4A3分別為本發明實施例4中Ctrl組、LPS組和GOS組的流式儀直方圖。
[0017]圖4B為本發明實施例4中ROS熒光強度的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明提供古羅糖醛酸寡糖的新應用，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0019]褐藻膠來源于海帶等海洋植物，來源廣泛、豐富，對其進行酶解可獲得古羅糖醛酸寡糖(G0S)。研究發現，GOS具有很多的生物活性和作用，包括誘導巨噬細胞分泌TNF-α等細胞因子、促進植物及微藻的生長、及抗腫瘤活性等。但對于GOS作為NO增強劑的作用仍未有發現。目前市場上對NO增強劑等這類保健品的開發主要具有改善性功能，增強肌肉力量，防止心血管疾病等作用。經過研究發現，GOS能誘導巨噬細胞生成NO，可將古羅糖醛酸寡糖作為一氧化氮生成促進劑；而NO具有血壓調控，預防中風和心臟病，促進免疫調節，降低膽固醇，改善糖尿病癥狀，以及作為胃腸道動力強抑制劑神經遞質，擴張血管，保護胃黏膜等的作用，因此GOS可作為一種激活巨 噬細胞參與免疫反應的激活劑，本發明中的發現是具有創新性和重要意義的。
[0020]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0021]實施例1:G0S促進RAW264.7細胞生成NO
[0022]將由褐藻膠分離獲得的均聚古羅糖醛酸(PG)經褐藻膠裂解酶降解后獲得G0S。RAW264.7細胞(2 X IO5個/孔)貼壁于96孔板中，4_6h后，棄上清，加入lmg/ml GOS和Img/ml PG,以無血清RPMI1640培養基為陰性對照組(Ctrl)，I μ g/ml脂多糖(LPS)為陽性對照，刺激24h后，應用Griess檢測培養基中的NO生成量，其結果如圖1A所示。在時間梯度實驗中，GOS分別刺激RAW264.7細胞6，12，24，36h后，應用Griess檢測培養基中的NO生成量,其結果如圖1B所示。在濃度梯度實驗中，GOS (0.lmg/ml, 0.5mg/ml, 1.0mg/ml)刺激RAW264.7細胞24h后，按Griess檢測培養基中的NO生成量，其結果如圖1C所示。
[0023]結果表明，與Ctrl組相比，GOS能促進RAW264.7細胞生成NO，并且具有顯著差異性(圖1A)。在時間梯度的實驗中發現，GOS的刺激時間為24h時，RAW264.7細胞生成較多的NO(圖1B)。在濃度梯度實驗中發現，GOS促進RAW264.7細胞生成NO的量隨著GOS濃度的增加而增加，呈濃度依賴性(圖1C)。
[0024]實施例2 =GOS激活RAW264.7細胞中iNOS基因的表達
[0025]RAW264.7細胞(2X106個/孔)貼壁于6孔板中，4_6h后，棄上清，加入lmg/mlG0S,以無血清RPMI1640培養基為陰性對照組(Ctrl)，I μ g/mlLPS為陽性對照，刺激12h后，按總RNA細胞急速抽提試劑盒(上海飛捷生物公司)提取總RNA，其結果如圖2A所示。在時間梯度實驗中，GOS分別刺激RAW264.7細胞4、8、12h后，提取總RNA，其結果如圖2B所示。在濃度梯度實驗中，GOS (0.1, 0.5，lmg/ml)刺激RAW264.7細胞12h后，提取總RNA，其結果如圖2C所示。然后通過反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將總RNA反轉錄成cDNA，再通過 PCR 獲得 iNOS 的基因(iNOS 弓丨物為:FE5' -CAACCAGTATTATGGCTCCT-3'，RE5'-GTGACAGCCCGGTCTTTCCA-3' ；β -actin:FE5/ - GGAGAAGATCTGGCACCACACC-3' ,RE5/ -CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3')。
[0026]結果表明，與Ctrl相比，GOS能夠激活RAW264.7細胞中iNOS基因的表達，并且差異性明顯(圖2A)。并且在時間梯度(圖2B)和濃度梯度實驗(圖2C)中發現，隨著GOS刺激時間的增長和作用濃度的增加，RAW264.7細胞表達的iNOS基因也隨之增加，表明GOS可以激活RAW264.7細胞iNOS基因表達的作用，且呈時間依賴性和濃度依賴性。
[0027]實施例3:G0S激活RAW264.7細胞中iNOS蛋白水平的表達
[0028]RAW264.7細胞(2父106個/孔)貼壁于6孔板中，4-611后，棄上清，加入111^/1111 G0S,以無血清RPMI1640培養基為陰性對照組(Ctrl)，I μ g/mlLPS為陽性對照，刺激24h后，提取細胞總蛋白，通過Western Blot檢測RAW264.7細胞中的iNOS蛋白水平，其結果如圖3所示。
[0029]結果表明，與Ctrl相比，GOS能夠激活RAW264.7細胞表達iNOS蛋白，并且差異性明顯(圖3)。
[0030]實施例4:G0S促進RAW264.7細胞產生ROS
[0031]RAW264.7細胞(5父105個/孔)貼壁于24孔板中，4_6h后，棄上清，加入lmg/mlG0S,以無血清RPMI1640培養基為陰性對照組(Ctrl)，I μ g/mlLPS為陽性對照，刺激24h。去除細胞培養液，加入5μ M DCFH-DA (二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯)孵育20min。然后去除上清，用RPMI1640培養基洗滌細胞2次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。最后用預冷的PBS (磷酸鹽緩沖溶液)洗滌I次后，加入PBS吹打細胞，然后轉移至流式細胞管中，置于流式細胞儀進行檢測，激發波長488nm，發射波長525nm，其結果如圖4A1~圖4A3所示。
`[0032]應用DCFH-DA熒光探針，通過流式細胞術檢測細胞內DCF的熒光強度，即可對單細胞內的ROS (活性氧族)進行原位實時檢測，并根據熒光強度研究細胞內ROS的水平，其結果如圖4B所示。
[0033]從流式儀直方圖(圖4A1~圖4A3)及檢測到的DCF熒光強度(圖4B)可知，與Ctrl相比，小鼠巨噬細胞RAW264.7經GOS刺激后，檢測到的ROS熒光強度增強，并且差異性顯著，說明GOS能夠促進RAW264.7細胞產生ROS。
[0034]根據上述實施例1~4，利用酶解法將來源于褐藻膠的PG酶解成G0S，進行促進巨噬細胞生成NO活性的研究，得出以下結論:
[0035]第一:G0S能夠促進RAW264.7細胞生成NO，當刺激時間為24h時，NO的生成量最多，且呈濃度依賴性；
[0036]第二:G0S能激活RAW264.7細胞中iNOS基因的表達，且其作用呈時間依賴性和濃度依賴性；
[0037]第三:G0S能激活RAW264.7細胞中iNOS蛋白水平的表達；
[0038]第四:GOS能促進RAW264.7細胞產生ROS。
[0039]綜上所述，本發明研究中首次發現GOS可激活巨噬細胞表達iNOS mRNA和蛋白，進而促進NO的生成，說明GOS可作為一種促進巨噬細胞生成N0、R0S等自由基分子的增強劑，從而為作為免疫激活劑的應用提供實驗基礎。NO的生成具有擴張血管，維持正常血壓，防止心血管疾病；增強血液循環，改善性功能；調節胰島素分泌，改善糖尿病癥狀；增強肌肉力量，增強人體體質等作用。GOS作為一種NO生成促進劑，同樣可能具備以上作用，可以作為防治以上疾病潛在的新藥和保健食品，具有廣闊的市場開發前景。
[0040]應當理解的是，本發明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。`
【權利要求】
1.古羅糖醛酸寡糖的應用，其特征在于，將所述古羅糖醛酸寡糖用于制備一氧化氮生成促進劑。
2.根據權利要求1所述的古羅糖醛酸寡糖的應用，其特征在于，將所述古羅糖醛酸寡糖用于制備促進巨噬細胞生成一氧化氮的一氧化氮生成促進劑。
3.根據權利要求1或2所述的古羅糖醛酸寡糖的應用，其特征在于，所述一氧化氮生成促進劑為藥物或保健食品`。
【文檔編號】A61P1/04GK103550197SQ201310556772
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】續旭, 吳小婷, 王青青, 李森, 萬敏 申請人:深圳大學