PEG修飾的CpG寡核甘酸及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種疫苗和腫瘤免疫治療給藥系統領域的PEG修飾的CpG寡核甘酸及其應用。本發明涉及一種PEG修飾的CpG寡核甘酸；本發明還涉及所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備提高血清中的IL-12表達量藥物中的應用；本發明還涉及所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備誘導對于內源性抗原如腫瘤抗原的免疫源性藥物中的應用。本發明還涉及所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備刺激B細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、髓系樹突狀細胞、巨噬細胞、外周單核細胞的免疫活性藥物中的應用。本發明涉及PEG修飾的CpG；具有增加體內穩定性及免疫調節功能，能提高在體內對于持續存在的抗原的應答反應。
【專利說明】PEG修飾的CpG寡核甘酸及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于疫苗和腫瘤免疫治療給藥系統領域，具體涉及一種PEG修飾的CpG寡核甘酸及其應用。
【背景技術】
[0002]CpG寡聚脫氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides, 0DN)是一些人工合成的以具有免疫激活功能的CpG序列(胞嘧啶-磷酸-鳥嘧啶)基序為核心的寡聚脫氧核苷酸，其結構特征為5’ -PuPuCPGPyPy-3，既5’端有兩個嘌呤或者一個嘌呤接一個胸腺嘧啶，3’端有兩個嘧啶的寡核苷酸序列。
[0003]在19世紀90年代，美國腫瘤醫生Coley將細菌粗提取物用于900名長期腫瘤患者的治療中時，發現有40%的病人腫瘤自行消退。在當時，人們認為是其中的脂多糖發揮作用，而沒有引起足夠的重視。在后來，用卡介苗進行小鼠體內試驗時發現，DNA酶處理過的卡介苗并不具有抗腫瘤作用，這說明細菌DNA才是發生抗腫瘤作用的藥物。之后，有研究證實，細菌DNA有直接的抗腫瘤和免疫刺激的作用。1995年，Krieg等發現細菌DNA中，發生較強免疫作用的是CpG基序，并把這類序列成為免疫刺激序列。與細菌不同，哺乳動物和其他動物的DNA分子中CpG基序的出現頻率很低，同時60%-90%的CpG基序中，胞嘧啶的第五個碳原子發生甲基化，因為這一變動，哺乳動物的DNA分子并不具有免疫刺激作用。CpG基序是CpG DNA產生免疫刺激功能的基本結構，在合成的一段CpG ODN之中，可以有一個基序或者多個CpG基序，CpG基序兩側的嘌呤和嘧啶以及構成不同基序之間的幾個堿基，都會影響CpG基序的免疫刺激功能。關于CpG ODN的結構的早期研究顯示，CpG基序的免疫作用具有種屬特異性，例如對小鼠最有效的CpG基序是5’ -GACGTT-3’，而對人最有效的CpG基序是5’ -GTCGTT-3’。根據CpG ODN結構和在體外對人外周血單核細胞(peripheralblood mononuclear cell, PBMC)刺激作用的不同，一般認為把CpG ODN分為3類:A型，B型，和C型。A型CpG ODN能刺激產生大量干擾素a (IFN-α )，并能大量激活自然殺傷細胞(natural killer, NK) ；`B型CpG ODN能夠刺激B細胞增殖同時分泌大量免疫球蛋白(Immunoglobulin, IgG)、白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)和白介素 10 (Interleukin-10,IL-10) ；C型CpG ODN兼有A型和B型CpG ODN的作用特點。
[0004]含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG 0DN)會被細胞內的Toll樣受體9 (TLR9)識別，激活Thl免疫應答以加強固有和獲得性免疫，一方面，CpG ODN激活TLR9信號誘導了核轉錄因子和其它細胞內信號途徑激活，啟動了快速天然免疫反應，包括多種促炎癥反應細胞因子及抗病毒細胞因子的分泌，如IL-6、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和I型干擾素(IFN);以及免疫調節細胞因子的分泌，如IL-10，以控制炎癥反應的強度，而且，NK細胞和其它天然免疫細胞通過IFN依賴途徑或非IFN依賴的途徑被間接激活。另一方面，CpG ODN活化的B細胞對抗原刺激的敏感性大大提高，加速分化為分泌抗原特異性抗體的漿細胞，從而促進了獲得性免疫應答；CpG ODN激活的pDC向淋巴結和其它次級淋巴組織的T細胞區遷移，表達協同刺激分子水平上調，使其激活初始T細胞和記憶性T細胞的能力增強，并且PDC向CD8T細胞交叉提呈可溶性蛋白抗原的能力增強，強烈促進了依賴Thl途徑的CD4和CD8T細胞的免疫應答。CpG目前其作為免疫佐劑在抗病毒和抗腫瘤治療領域有很廣的應用前景。
[0005]但自從上世界90年代CpG ODN發現具有激活免疫應答的功效至今，卻仍然沒有一個成熟的CpG藥品上市。輝瑞公司的CpG7909停止在臨床三期的研究階段，主要是由于CpG7909在與化藥聯合使用治療非小細胞肺癌沒有增加療效，這些失敗的案例，體現了現有CpG藥物結構上的缺陷。我們的數據表明，普通CpG ODN和常規的在磷酸二酯鍵骨架上的修飾結構在血清中穩定性還是很差，連接PEG有助于大大提高其血清穩定性。但人們一般認為，并有大量文獻支持，PEG修飾會阻礙含PEG的分子與免疫細胞的相互作用，特別是根據文獻報道，CpG的受體TLR9主要分布在內吞體內側，所以PEG修飾的CpG ODN將不再具有免疫活性。但我們通過研究發現，PEG修飾的CpG ODN不僅能作用于B細胞和DC細胞分泌細胞因子，還能提高體內血清中IL-12的濃度，甚至在體內實驗中還優于未修飾的CpG。
[0006]此外，PEG修飾(PEGylation)雖然已經被成功應用于多種蛋白分子以及納米載藥系統的修飾，可以大大提高蛋白的血清穩定性和半衰期，但卻幾乎很少用來修飾寡核苷酸(ODN)分子，包括siRNA，microRNA, Cpg ODN等，主要原因在于ODN的作用靶點大多在細胞內，經過PEG修飾的ODN分子量更大，進入細胞的效率應該更低。業內更青睞的方法，是利用一些納米載藥系統，來保護ODN的穩定性，提高細胞攝取。但我們發現，對于特定的CpGODN系列序列修飾PEG，并不會阻滯其進入細胞產生免疫刺激作用，甚至在體內作用中效果還有提高，從而揭示了 CpG ODN作為腫瘤治療藥物的新機理和新方向。
【發明內容】
[0007]本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明涉及一種PEG修飾的CpG寡核甘酸及其應用。本發明涉及PEG修飾的CpG ;具有增加體內穩定性及免疫調節功能，能提高在體內對于持續存在的抗原的應答反應。
[0008]本發明是通過以下的技術方案實現的，
[0009]第一方面，本發明涉及一種PEG修飾的CpG寡核甘酸。
[0010]優選地，所述PEG的mw≥10K。
[0011]優選地，所述寡核甘酸的骨架是全硫代修飾、部分硫代修飾或者無硫代修飾的。
[0012]優選地,所述PEG修飾的位點為5’ -末端或者3’ -末端。
[0013]優選地，所述結構為式I或式2所示，所述OLIGO其中的寡核苷酸包含1_5個單位的CpG單元；
[0014]
【權利要求】
1.一種PEG修飾的CpG寡核甘酸。
2.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述PEG的mw>>10K。
3.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述寡核甘酸的骨架是全硫代修飾、部分硫代修飾或者無硫代修飾的。
4.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述PEG修飾的位點為5’ -末端或者3’ -末端。
5.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述結構為式I或式2所示，所述OLIGO其中的寡核苷酸包含1-5個單位的CpG單元；
6.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述CpG寡核甘酸的序列為: 序列如SEQ ID N0.1所示的CpG-7， 序列如SEQ ID N0.2所示的CpG-8, 序列如SEQ ID N0.3所示的CpG-13, 序列如SEQ ID N0.4所示的CpG1826, 序列如SEQ ID N0.5所示的CpG7909, 序列如SEQ ID N0.6所示的CpG-H7, 序列如SEQ ID N0.7所示的CpG-H8, 序列如SEQ ID N0.8所示的CpG-Hl3， 序列如 SEQ ID N0.9 所示的 CpG-H1826。
7.如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸，其特征在于，所述PEG修飾的CpG寡核甘酸可通過包括如下步驟的方法合成而得； 路線a，將巰基修飾的CpG加入到Tris-HCL中，吹N25min，再加入三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽，混勻，再加mPEG2QK-Mal，整個過程中N2保護，渦旋混勻，25°C，500-1300rpm反應5h ;將得到的產物的混合物用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷層溶液，反復萃取三次，用氮氣揮干，加入超純水溶解；最后將所得到的合成產物用3500Da的透析膜制成的透析管4°C透析過夜，透析結束樣品凍干，即得；
8.—種如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備提高血清中的IL-12表達量藥物中的應用。
9.一種如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備誘導對于內源性抗原如腫瘤抗原的免疫源性藥物中的應用。
10.一種如權利要求1所述的PEG修飾的CpG寡核甘酸在制備刺激B細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、髓系樹突狀細胞、巨噬細胞、外周單核細胞的免疫活性藥物中的應用。
【文檔編號】A61P37/02GK103789315SQ201310554458
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】徐宇虹, 向小飛, 岳洋, 吳彩興, 王輝 申請人:上海交通大學