穿心蓮的微乳提取方法及其提取物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種穿心蓮的微乳提取方法，其特征在于，包括穿心蓮藥材與生物相容性微乳充分接觸一段時間例如3天，然后抽濾，得到濾液；其中所述生物相容性微乳包括卵磷脂，膽固醇，膽鹽和水，它們的重量比為：1:0.013:1:18。本發明還公開了按照所述微乳提取方法提取得到的穿心蓮的微乳提取物以及含有所述的微乳提取物的藥物、保健食品、營養食品或化妝品組合物。
【專利說明】穿心蓮的微乳提取方法及其提取物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種穿心蓮的微乳提取方法及其提取物，尤其是生物相容性微乳提取方法及其提取物。
【背景技術】
[0002]微乳(microemulsion, ME)是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例自發形成的一種低黏度、各向同性且熱力學穩定的膠體分散體系，外觀為透明或半透明，粒徑一般介于10~IOOnm之間，其作為藥物的載體，可以解決穩定性差、溶解性差、有刺激性、生物利用度低、藥物釋放過快等多種問題。尤其能夠增加難溶性藥物的溶解度，是難溶性藥物的理想載體。 [0003]微乳作為一種新型藥物載體，具有極大的應用潛力。主要具有以下幾個優點:
[0004]①微乳制劑可以提高難溶性藥物的溶解度，并可同時增溶不同極性的藥物。
[0005]②微乳制劑粒徑小，可以有效、快速的通過胃腸道上皮細胞，大大提高藥物的生物利用度。
[0006]③微乳制劑可以制成多種劑型，包括口服制劑，注射制劑和透皮吸收制劑。
[0007]④其處方一經確定，制備方法簡單。
[0008]微乳制劑盡管在提高生物利用度方面有獨到之處，但其存在的問題也不容忽視:微乳中含有大量的表面活性劑和助表面活性劑，它們大多對胃腸道粘膜有刺激性，長期使用可能造成全身慢性毒性反應。因而努力尋找高效低毒的表面活性劑和助表面活性劑，是微乳制劑得以廣泛應用的有效途徑。
[0009]生物相容性藥用輔料:
[0010]由于藥用輔料與藥物一同發揮作用，其安全性問題一直是影響其在藥物制劑中應用的重要問題。理想的藥用輔料應具有以下特性:成型性好、用量小、作用強、生理安全性大、無生物活性、化學性質穩定等。其中具有生物降解性和組織相容性的藥用輔料(生物相容性藥用輔料)最為理想。具有生物相容性的藥用輔料，不與機體發生應答和排異反應，不易產生有害反應；且在機體內溶解性好，能夠減少用量，促進藥物的吸收利用。內源性物質，指來源于機體，與人的生存和健康息息相關的成分。隨著分子生物學和生物化學的不斷發展，越來越多的內源性生物活性物質會展現其藥用價值，被廣泛應用于藥品、保健食品和化妝品領域，而內源性物質作為藥用輔料應用的較少。目前可用于藥用輔料的內源性物質有卵磷脂、膽鹽、膽固醇等。
[0011]卵磷脂是生命的基礎物質，存在于每個細胞之中，更多的是集中在腦及神經系統、血液循環系統、免疫系統以及肝、心、腎等重要器官。卵磷脂屬于一種混合物，其構成成分包括磷酸、膽堿、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂被譽為與蛋白質、維生素并列的“第三營養素”，人類生命自始至終都離不開它的滋養和保護，具有調節血糖、促進神經發育和延緩衰老等功效。
[0012]純凈的卵磷脂(磷脂酰膽堿)常溫下為一種無色無味的白色固體，由于制取或精制方法、儲存條件不同被氧化而呈現淡黃色至棕色。卵磷脂含量在55%以下的大部分應用在保健食品、營養食品中，也可應用做醫藥輔料。60%-80%大部分應用在化妝品、藥用輔料中，90%以上的主要應用在制藥行業。目前，我們國內臨床上使用的“脂肪乳”原料就是采用卵磷脂，其本質是卵磷脂與水乳化的產物，安全性良好，可用于注射給藥。
[0013]膽鹽是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合而形成的鈉鹽或鉀鹽。它是膽汁中參與脂肪消化和吸收的主要成分。膽汁中的膽鹽有很多功用:乳化脂肪，促進脂肪消化；與脂肪酸結合，促進脂肪酸的吸收；促進脂溶性維生素的吸收；抑制腸道細菌的生長；促進膽固醇的溶解。
[0014]膽固醇廣泛存在于動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及留體激素的原料。膽固醇可作為乳化劑使用，其作用為降低界面張力，形成牢固的界面膜。
[0015]中藥穿心蓮具有抗炎、止痛活性。目前多采用水提法，醇提法以及堿提酸沉法來提取穿心蓮中的有效成分以供藥用，但這些方法均存在一定弊端。水提取一般可將黃酮、多糖等水溶性成分提取出來，但由于穿心蓮內酯水溶性較低，水提取的提取率不高。醇提取液中穿心蓮內酯含量較高，中等濃度的醇也適于提取黃酮苷類，但醇提法提取時間長、溶劑用量大、操作麻煩，得率較低，不利于資源的充分利用。堿水提取方法，穿心蓮內酯開環產物易溶于水，調節PH后仍可還原為內酯，因此對兩種內酯的提取率尚可，但堿性環境下總黃酮的提取率明顯下降。可見，由于穿心蓮的有效成分極性差別較大，單一的提取溶媒很難對其有效成分進行較全面的提取。因此，尋找一種適宜的，能夠同時增溶多種極性成分的溶媒來提取穿心蓮，是保證全面、高效的提取穿心蓮有效成分的關鍵。
【發明內容】
[0016]本發明一方面提供一種生物相容性微乳及其制備方法。
[0017]本發明另一方面提供一種穿心蓮的生物相容性微乳提取方法及其提取物。
[0018] 申請人:對生物相容性微乳及生物相容性微乳提取穿心蓮的方法進行了廣泛深入的研究，從而完成了本發明。
[0019]本發明提供了:
[0020]1.一種生物相容性微乳，其特征在于，包括卵磷脂，膽固醇，膽鹽和水，它們的重量比為:1:0.013:1:18。
[0021]2.按照項目I的微乳，其中還包括肉豆蘧酸異丙酯，
[0022]其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:0.3:18。
[0023]3.按照項目I的微乳，其中還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油，
[0024]其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油和水的重量比為:1:0.013:1:1:18。
[0025]4.按照項目I的微乳，其中還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油和肉豆蘧酸異丙酯，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:18。
[0026]5.按照項目4的微乳，其中還包括95%乙醇，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯，95%乙醇，水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:8:18。
[0027]本發明微乳中還可以包括聚氧乙烯氫化蓖麻油和/或肉豆蘧酸異丙酯的替代性物質，這些物質對于本領域技術人員來說是已知的。
[0028]在本發明的一種具體實施方案中，本發明微乳僅由卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯，95%乙醇，水組成，它們的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:8:18。
[0029]膽鹽/卵磷脂作為混合表面活性劑對難溶性油相膽固醇有良好的增溶作用，并且膽鹽/卵磷脂及其降解產物都是在機體生理條件下存在的成分，可被機體完全吸收，具有高度的安全性，并且膽鹽與卵磷脂合用時可顯著降低卵磷脂降解產物(溶血磷脂)的溶血毒性。所以膽鹽、卵磷脂、膽固醇形成的微乳液是良好的藥物載體。
[0030]本發明生物相容性微乳載藥體系基于人體內源性物質(膽鹽、膽固醇、卵磷脂)并且用量低，所述生物相容性微乳的優勢在于:1.可以有效解決由于微乳表面活性劑含量過高而引起的不良反應(微乳劑表面活性劑的含量一般在30%以上，常用藥用輔料具有一定的毒性，常常會引起一系列的不良反應，這也是限制微乳廣泛應用的主要原因)。2.配方組成為人體內源性生物相容材料，易被人體接受，不產生應答和排異反應，不易產生有害作用。3.生物相容性材料在體內溶解性好，易被機體吸收，有助于能夠提高藥物的生物利用度。
[0031]本發明生物相容性微乳可以應用在保健食品、營養食品中，也可應用做醫藥輔料。本發明生物相容性微乳還可以作為“脂肪乳”，可用于注射給藥。
[0032]本發明也提供了:
[0033]6.一種項目1-5任一項中所述微乳的制備方法，包括下面步驟:
[0034]( I)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和任選的聚氧乙烯氫化蓖麻油和/或95%乙醇，溶解；
[0035](2)將處方量膽固醇和任選的肉豆蘧酸異丙酯混合，溶解；
[0036](3)將處方量將膽鹽加入水中，溶解；
[0037](4)向步驟(1)制得溶液中加入步驟(2)的溶液，攪拌均勻，再加入步驟(3)的溶液。
[0038]7.按照項目6的制備方法，其中步驟(1)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和聚氧乙烯氫化蓖麻油，優選卵磷脂、聚氧乙烯氫化蓖麻油和95%乙醇。
[0039]8.按照項目6或7的制備方法，其中步驟(2)將處方量膽固醇和肉豆蘧酸異丙酯混合。
[0040]9.按照項目6-8任一的制備方法，其中步驟(1)、(2)和(3)所述溶解是在37°C水浴中進行的。
[0041]本發明也提供了:
[0042]10.一種穿心蓮的微乳提取方法，其特征在于，包括穿心蓮藥材與生物相容性微乳充分接觸一段時間例如3天，然后抽濾，得到濾液；其中所述生物相容性微乳包括卵磷脂，膽固醇，膽鹽和水，它們的重量比為:1:0.013:1:18。
[0043]11.按照項目10的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括肉豆蘧酸異丙酯，[0044]其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:0.3:18。
[0045]12.按照項目10的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油，
[0046]其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油和水的重量比為:1:0.013:1:1:18。
[0047]13.按照項目10的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油和肉豆蘧酸異丙酯，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:18。
[0048]14.按照項目13的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括95%乙醇，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯，95%乙醇，水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:8:18。
[0049]15.一種項目10-14任一項中所述微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳采用包括下面步驟方法制備:
[0050](I)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和任選的聚氧乙烯氫化蓖麻油和/或95%乙醇，溶解；
[0051](2)將處方量膽固醇和任選的肉豆蘧酸異丙酯混合，溶解；
[0052](3)將處方量膽鹽加入水中，溶解；
[0053](4)向步驟(1)制得溶液中加入步驟(2)的溶液，攪拌均勻，再加入步驟(3)的溶液。
`[0054]16.按照項目15的微乳提取方法，其中步驟(1)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和聚氧乙烯氫化蓖麻油，優選卵磷脂、聚氧乙烯氫化蓖麻油和95%乙醇；步驟(1)、( 2 )和(3 )所述溶解是在37°C水浴中進行的。
[0055]17.按照項目10-14任一項中所述微乳提取方法，其中所述充分接觸包括振蕩或攪拌。
[0056]18.一種穿心蓮的微乳提取物，其特征在于，其是按照項目10-17任一項微乳提取方法提取得到的。
[0057]19.一種藥物、保健食品、營養食品或化妝品組合物，其中包括項目18所述的微乳提取物，優選所述組合物為口服制劑、噴霧劑或外敷劑。
[0058]本發明的穿心蓮的微乳提取物作為藥物、保健食品、營養食品可以口服施用，作為藥物還可以口腔或鼻腔噴霧施用，作為化妝品可以外敷施用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0059]圖1穿心蓮內酯標準曲線
[0060]圖2血藥濃度一時間曲線圖
【具體實施方式】
[0061]下面通過具體實施例詳細描述本發明，但是無論如何不得解釋為對本發明的限制。
[0062]儀器與材料[0063]儀器MD110-2型電子分析天平，81B-2型恒溫磁力攪拌器，納米粒徑測定儀(Malvern)，8002型水浴鍋。TGL-16G型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，MVS-1漩渦混合器(北京東方開物科學器材有限公司)，TP-300超聲清洗機(天鵬電子新技術有限公司)，HPllOO型高效液相色譜儀，SPD210AV檢測器。
[0064]材料PC50卵磷脂(上海太偉藥業，批號20120301)，膽固醇(美國SIGMA公司，批號MKBD9436V)，豬膽鹽(北京雙旋微生物培養基制品廠，批號20120420)，肉豆蘧酸異丙酯(美國SIGMA公司，批號20120322)，聚氧乙烯氫化蓖麻油(德國巴斯夫公司，批號512882)，95%乙醇(分析純)，雙蒸水。
[0065]制備例I
[0066](I)按處方比例，稱取10克卵磷脂，置于燒杯內，恒溫熱水浴溶解，磁力攪拌均勻后，備用。
[0067](2)將0.13克膽固醇在恒溫熱水浴溶解，備用。
[0068](3)將10克膽鹽加入18克水中，恒溫熱水浴溶解,備用。
[0069](4)向步驟(1)制得溶液中緩慢加入步驟(2)的溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，再加入步驟(3)的溶液。即得到本發明的微乳。
[0070]制備例2
[0071](I)按上述項目5的微乳處方比例，稱取10克卵磷脂，10克聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40)，8克95%乙醇，置于燒杯內，37°C水浴溶解，磁力攪拌均勻后，備用。
[0072](2)按上述項目5的微乳處方，將0.13克膽固醇加入3克肉豆蘧酸異丙酯中，37°C水浴溶解，備用。
[0073](3)按上述項目5的微乳處方，將10克膽鹽加入18克水中，37°C水浴溶解，備用。
[0074](4)向步驟(1)制得溶液中緩慢加入步驟(2)的溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，再加入步驟(3)制得的溶液。即得到本發明一種優選的微乳。
[0075]實驗例I
[0076]制備例2的微乳理化性質:
[0077]1.粒徑及形態:
[0078]采用馬爾文粒徑儀測定粒徑及粒子分布系數PDI值，3次測定粒徑分別為:19.03nm, 19.23nm, 19.20nm。PDI 依次為:0.165，0.147，0.147。4 萬倍電鏡視圖顯示，該微乳的形態為球形小體，大小均勻為納米級。粒徑在10~IOOnm之間,符合微乳液的定義。
[0079]2.穩定性:
[0080](I)高速離心加速實驗:取適量所制得的微乳液于離心管中，置于高速離心機中，室溫條件下，以3500r.min-1進行離心,離心兩次,每次IOmin,離心后,觀察；微乳劑仍保持澄清透明，未見油水分層，表明所制得的微乳液動力學穩定性良好。
[0081](2) 50°C水浴對微乳劑穩定性的影響取適量所制得的微乳液于西林瓶內，密封瓶口，置于50°C水浴中觀察，經過3天水浴，微乳劑仍保持澄清透明，未見油水分層，表明所制得的微乳高溫下性質穩定。
[0082]( 3 )微乳室溫外觀穩定性的考察將微乳于室溫放置三個月，觀察現象。結果微乳在室溫條件下，未發生分層情況，表明按照優選的微乳處方制備的微乳常溫下性質穩定。(4)微乳冷藏外觀穩定性的考察將微乳于冰箱(4°C )放置三個月，結果膽固醇微乳在4°C的條件下，未發生分層情況，且無冰片析出，表明按照優選的微乳處方制備的微乳在低溫下性質穩定。
[0083]實驗例2
[0084]制備例2的微乳生物相容性:
[0085]樣品配制:
[0086]培養液:含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。每升培養液中含有RPMI1640培養基粉10.4g，胎牛血清100ml，青霉素10萬單位，少量酚紅，碳酸氫鈉水溶液調至PH值
7.0-7.4，加雙蒸水配制。
[0087]樣品液制備:按制備例2制備的微乳2ml，滅菌，加20ml培養液，37°C震蕩浸提24h，0.45um無菌微孔濾膜過濾，分裝備用。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液將浸提液稀釋為25%、50%、75%、100%的不同濃度。
[0088]陰性對照液:37°C放置24h的完全培養液。
[0089]陽性對照液:含0.5%苯酚的培養液。
[0090]細胞株:小鼠成纖維細胞株L929。
[0091]細胞培養:
[0092]培養條件:37 °C，5%C02，飽和濕度。
`[0093]試驗方法:MTT法。取處在對數生長期的L929細胞，用培養液稀釋制成濃度為5 X 104/ml的L929單細胞懸液，接種在96孔培養培養板各孔，每孔0.20ml，培養24h，使L929細胞貼壁。吸出溶液，依次加入0.20ml陰性對照液、不同濃度微乳樣品液和陽性對照液各6孔。培養48、96、144h后吸出溶液，加入0.20ml新鮮的培養液及20ul的5mg/ml的MTT溶液，輕輕搖勻，37°C溫育4h。移出溶液，用0.20ml生理鹽水清洗2次，每孔加入
0.20mlDMS0 (二甲基亞砜)，輕輕震蕩lOmin，酶聯免疫測定儀于550nm處測定吸光度OD值。
[0094]結果:見表-1
[0095]表-1
[0096]MTT光度法測定的生物相容性微乳液培養L929時相對細胞存活率
【權利要求】
1.一種穿心蓮的微乳提取方法，其特征在于，包括穿心蓮藥材與生物相容性微乳充分接觸一段時間例如3天，然后抽濾，得到濾液；其中所述生物相容性微乳包括卵磷脂，膽固醇，膽鹽和水，它們的重量比為=1:0.013:1:18。
2.按照權利要求1的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括肉豆蘧酸異丙酯， 其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:0.3:18。
3.按照權利要求1的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油， 其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油和水的重量比為:1:0.013:1:1:18。
4.按照權利要求1的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括聚氧乙烯氫化蓖麻油和肉豆蘧酸異丙酯，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯和水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:18。
5.按照權利要求4的微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳還包括95%乙醇，其中卵磷脂，膽固醇，膽鹽，聚氧乙烯氫化蓖麻油，肉豆蘧酸異丙酯，95%乙醇，水的重量比為:1:0.013:1:1:0.3:8:18。
6.一種權利要求1-5任一項中所述微乳提取方法，其中所述生物相容性微乳采用包括下面步驟方法制備: (1)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和任選的聚氧乙烯氫化蓖麻油和/或95%乙醇，溶`解； (2)將處方量膽固醇和任選的肉豆蘧酸異丙酯混合，溶解； (3)將處方量膽鹽加入水中，溶解； (4)向步驟(1)制得溶液中加入步驟(2)的溶液，攪拌均勻，再加入步驟(3)的溶液。
7.按照權利要求6的微乳提取方法，其中步驟(1)按處方比例稱取一定量的卵磷脂和聚氧乙烯氫化蓖麻油，優選卵磷脂、聚氧乙烯氫化蓖麻油和95%乙醇；步驟(1)、(2)和(3)所述溶解是在37°C水浴中進行的。
8.按照權利要求1-5任一項中所述微乳提取方法，其中所述充分接觸包括振蕩或攪拌。
9.一種穿心蓮的微乳提取物，其特征在于，其是按照權利要求1-8任一項微乳提取方法提取得到的。
10.一種藥物、保健食品、營養食品或化妝品組合物，其中含有權利要求9所述的微乳提取物，優選所述組合物為口服制劑、噴霧劑或外敷劑。
【文檔編號】A61K8/97GK103690580SQ201310551790
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】牛欣, 馮前進, 杜紅 申請人:山西中醫學院