杜仲中灰氈毛忍冬素g的制備及在神經保護藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于樹木次生代謝活性成分及天然藥物【技術領域】，具體涉及一種以藥用樹種杜仲為原料制備灰氈毛忍冬素G的方法及灰氈毛忍冬素G在制備神經保護藥物中的用途。本發明以杜仲樹植物材料為原料，經提取、萃取、分離而得到灰氈毛忍冬素G。本發明的制備工藝簡單、成本低、周期短、得率高。試驗證實灰氈毛忍冬素G對模型細胞損傷起到了顯著的保護作用，表明灰氈毛忍冬素G可用于制備神經保護作用藥物，以預防及治療各種神經退行疾病。
【專利說明】杜仲中灰氈毛忍冬素G的制備及在神經保護藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于樹木次生代謝活性成分及天然藥物【技術領域】，具體涉及一種以藥用樹種杜仲為原料制備灰氈毛忍冬素G的方法及灰氈毛忍冬素G在制備神經保護藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]杜仲(Eucommiaulmoides Oliv.)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物，落葉喬木，樹高可達20余米。藥用杜仲為杜仲的干燥樹皮，質脆，比較容易折斷，折斷后有細密、白色、富有彈性的銀絲，是中國特有的貴重中藥材和提取膠原料的中藥材(葉文峰，林產化工通訊，2004，38(5)，40~44)，中國藥典規定杜仲樹皮作為中藥杜仲入藥。杜仲是國家二級珍稀樹種，由于其起源古老，在科學上具有極其重要的研究價值和藥用價值。在我國，杜仲起源于陜、川、甘三省交界的秦嶺山脈，主要分布于四川、云南、貴州、湖北、湖南、河南、安徽、江西等省和自治區(湯詩杰等，林業科技開發，2007，21(2)，8~12 ；Yao LN,et al, Holzforschung, 2010,64 (5), 571 ~575 ；Xu ZS, et al, Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 2010, 58 (12), 7289~7296)。《神農本草經》和《本草綱目》中記載杜仲樹材料入藥后性味甘、味辛、溫、無毒，有補肝腎、益腰酸、強志、安胎、久服耐勞輕身等功效，可用于腎虛腰痛，筋骨無力，妊娠漏血等癥。現代醫學證明杜仲樹材料具有雙向調節血壓、增強細胞免疫功能和非特異性免疫功能、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降低血糖、調節血脂等多方面的功效(辛曉明等，醫學綜述，2007，13 (19)，1507~1509 Jin X，etal, Journal ofEthnopharmacology, 2010,128 (3), 672 ~678 ；Luo XB, et al, Journal ofLiquid Chromatography and Related Technologies,2004,27(I),63 ~81 ;Luo XF, etal,Journal of Ethnopharmacology,2010,129(2),238 ~243 ;Matsuda E,et al,Journalof Natural Medicines,2006,60(2), 126 ~129 ；Kwon SH,et al,Neuroscience Letters,2011,487(1)，123~127)。最`新醫學研究證實杜仲樹材料提取物入藥可對神經細胞起到較好的保護作用(彭紅梅等，中醫學報，2013，28 (I)，72~73)。
[0003]灰租毛忍冬素G,英文名為macranthoin G,化學名為3,4-0-雙咖啡酸基奎尼酸甲醋(methyl3,4-0_dicaffeoylquinate),分子式為C26H26012。灰租毛忍冬素G是一種微黃色粉末，熔點123~124°C，三氯化鐵顯色反應呈陽性(暗綠色)，紫外燈下觀察顯蘭色熒光。灰租毛忍冬素G最先從灰租毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)花蕾中提取分離得到(陳敏等，藥學學報，1994，29 (8)，617~620)，現發現灰氈毛忍冬素G也存在于燈盞細辛(Erigeron breviscapus (Van.)Hand.-Mazz)及忍冬藤(Lonicerajaponica Thunb)等植物中(岳建民等，植物學報，2000，42 (3)，311-315 ;張聰等，中國中藥雜志，2009，34 (23)，3051-3053)。但至今為止，尚無文獻報道杜仲樹植物材料中含有灰氈毛忍冬素G成分。
[0004]最新研究表明，灰氈毛忍冬素G的抗氧化作用明顯，是非常好的自由基消除劑(Kim, et al, Food Chemistry,2011,125(I), 55-62 ;Choi, et al, Archives of PharmacalResearch, 2004，27 (2)，164-168)。而且，在生物活性評價實驗中，灰氈毛忍冬素G顯示了非常顯著的對體外NK細胞的激活效果，未見任何抗血小板聚集的活性(陳敏等，藥學學報，1994，29 (8)，617~620)。但迄今為止，尚未見灰氈毛忍冬素G單體成分防治任何神經退行疾病活性的研究報道。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種操作工藝簡單、短周期、低成本、高得率地從杜仲樹植物原料中制備灰氈毛忍冬素G的方法。
[0006]本發明的另一個目的是提供灰氈毛忍冬素G在制備神經保護藥物中的應用。
[0007]本發明的技術方案概述如下:
[0008]從杜仲樹植物原料中制備灰氈毛忍冬素G的方法，包括如下步驟:
[0009](I)取粉碎的杜仲樹植物原料，按質量比為1:1~1:25加入體積百分濃度為
I%~99 %的乙醇水溶液，常溫或加熱或超聲波提取I~6次，每次I~48小時，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1%~20%，得粗提物；
[0010](2)加入粗提物質量I~6倍的水，攪拌，加入粗提物質量I~10倍的正己烷萃取I~6次，分離，將剩余水層加入粗提物質量I~10倍的二氯甲烷萃取I~6次，分離，將再次剩余的水層加入粗提物質量I~10倍的乙酸乙酯萃取I~6次，分離乙酸乙酯層和最后的水層，將乙酸乙酯層減壓濃縮得乙酸乙酯萃取相；
[0011](3)乙酸乙酯萃取相經凝膠色譜柱層析和硅膠色譜柱層析之至少一種制備得到灰氈毛忍冬素G。
[0012]在上述灰氈毛忍冬素`G的制備步驟中，所述杜仲樹植物原料包括杜仲樹的樹干、樹枝、樹葉、樹根、樹皮、根皮、木質部中的一種或幾種。
[0013]灰氈毛忍冬素G在制備神經保護藥物中的應用:
[0014]實驗結果顯示，灰氈毛忍冬素G預處理能顯著降低H2O2誘導的PC12細胞的MDA水平、能顯著增加SOD水平及增加過氧化氫酶活性、能明顯降低H2O2誘導PC12細胞內的活性氧的產生、可以拮抗H2O2誘導的PC12細胞的損傷，提高了細胞的存活率，說明灰氈毛忍冬素G對PC12細胞損傷起到了較好的保護作用。結果表明灰氈毛忍冬素G可用于制備神經保護作用藥物，以預防及治療各種神經退行疾病。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為灰氈毛忍冬素G對正常PC12細胞存活率的影響。
[0016]圖2為灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞存活率的影響。
[0017]圖3為灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞MDA水平的影響。
[0018]圖4為灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞SOD活性的影響。
[0019]圖5為灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞過氧化氫酶活性的影響。
[0020]圖6為灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞內活性氧積累的影響。
【具體實施方式】
[0021]參考下列實施例將更容易、更全面地理解本發明，給出實施例是為了闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明。[0022]實施例1:
[0023]灰氈毛忍冬素G的制備 [0024](I)取粉碎的杜仲樹根皮為原料，按質量比為1:5加入體積百分濃度為95%的乙醇水溶液，常溫提取3次，每次12小時，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的3%，得粗提物；
[0025](2)加入粗提物質量2倍的水，攪拌，加入粗提物質量3倍的正己烷萃取3次，分離，將剩余水層加入粗提物質量3倍的二氯甲烷萃取3次，分離，將再次剩余的水層加入粗提物質量3倍的乙酸乙酯萃取3次，分離乙酸乙酯層和最后的水層，將乙酸乙酯層減壓濃縮得乙酸乙酯萃取相；
[0026](3)乙酸乙酯萃取相經凝膠色譜柱層析制備得到灰氈毛忍冬素G。
[0027]實施例2:
[0028]灰氈毛忍冬素G的制備
[0029](I)取粉碎的杜仲樹木質部為原料，按質量比為1:10加入體積百分濃度為80%的乙醇水溶液，加熱提取5次，每次6小時，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的5%，得粗提物；
[0030](2)加入粗提物質量3倍的水，攪拌，加入粗提物質量4倍的正己烷萃取4次，分離，將剩余水層加入粗提物質量4倍的二氯甲烷萃取4次，分離，將再次剩余的水層加入粗提物質量4倍的乙酸乙酯萃取4次，分離乙酸乙酯層和最后的水層，將乙酸乙酯層減壓濃縮得乙酸乙酯萃取相；
[0031](3)乙酸乙酯萃取相經硅膠色譜柱層析制備得到灰氈毛忍冬素G。
[0032]實施例3:
[0033]灰氈毛忍冬素G對過氧化氫H2O2誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)氧化應激損傷的保護作用
[0034](I)PCl2細胞的培育
[0035]PC12細胞在含有5% FBS、10 % HS、100U / ml青霉素及IOOyg / ml鏈霉素的RPMI1640培養基中于37°C下5%濃度的CO2孵箱中培養。
[0036](2)灰氈毛忍冬素G對正常PC12細胞存活率的影響
[0037]以MTT法測定以不同濃度(0、3.125、6.25、12.5、25及50μΜ)灰氈毛忍冬素G處理24h后的PC12細胞的存活率。其結果如圖1所示，相比于未經灰氈毛忍冬素G處理的對比組，各組PC12細胞的相對存活率幾乎為100%，即灰氈毛忍冬素G對H2O2未誘導的正常PC12細胞幾乎沒有毒性影響。
[0038](3)灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞存活率的影響
[0039]以不同濃度(0、6.25、12.5、25及50μΜ)的灰氈毛忍冬素G處理PC12細胞30min，然后用0.75mM H2O2誘導6h。以MTT法判斷灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護活性，其存活率如圖2所示。結果表明，相比于對比組(灰氈毛忍冬素G和H2O2處理的PC12細胞組)，用0.75mM H2O2誘導6h后，PC12細胞存活率下降到26.6%,而在6.25，12.5，25及50 μ M的灰氈毛忍冬素G保護下，PC12細胞存活率分別升高到34.0% ,52.4% ,68.3%及82.0%，即灰氈毛忍冬素G預處理可以拮抗H2O2誘導的PC12細胞的損傷，提高細胞的存活率。
[0040](4)灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導PC12細胞內MDA水平、SOD活性及過氧化氫酶活性的影響[0041]將PC12細胞按每孔6X IO5個細胞接種到6孔培養板上以4ml培養基孵育16h，再以不同濃度(0、6.25、12.5、25及50μΜ)的灰氈毛忍冬素G處理后繼續培養30min，再以
0.75mM H2O2誘導6h。然后以分光光度法確定PC12細胞的MDA水平、SOD活性和過氧化氫酶活性，試驗結果如圖3、圖4、圖5所示。結果表明，隨著濃度的增加，灰氈毛忍冬素G能顯著降低H2O2誘導的PC12細胞的MDA水平，可以顯著增加SOD及過氧化氫酶活性，即灰氈毛忍冬素G預處理可以明顯的抑制過氧化氫誘導PC12細胞的損傷。
[0042](5)灰氈毛忍冬素G對H2O2誘導的PC12細胞內活性氧積累的影響
[0043]將PC12細胞按每孔I X IO5個細胞接種到6孔培養板上以2ml培養基孵育16h，再以不同濃度(0、25及50μΜ)的灰氈毛忍冬素G處理后繼續培養30min，再以0.75mM H2O2誘導6h，將細胞破碎后以PBS洗3遍，加入20 μ M DCFH-DA在37°C下避光孵育處理30min。用流式細胞儀進行細胞內活性氧的測定，激發光波長為498nm，檢測波長為522nm。試驗結果如圖6所示。結果表明，0.75mM H2O2誘導6h使細胞內活性氧水平增加到305.18%，而隨著濃度的增加的灰氈毛忍冬素G的預處理則可以明顯降低H2O2誘導PC12細胞內的活性氧的產生，進一步說明灰氈毛忍冬素G預處理對PC12細胞損傷起到`了較好的預防作用。
【權利要求】
1.從杜仲中制備灰氈毛忍冬素G的方法，其特征是包括如下步驟: (1)取粉碎的杜仲樹植物原料，按質量比為1:1~1:25加入體積百分濃度為1%~99%的乙醇水溶液，常溫或加熱或超聲波提取I~6次，每次I~48小時，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1%~20%，得粗提物； (2)加入粗提物質量I~6倍的水，攪拌，加入粗提物質量I~10倍的正己烷萃取I~6次，分離，將剩余水層加入粗提物質量I~10倍的二氯甲烷萃取I~6次，分離，將再次剩余的水層加入粗提物質量I~10倍的乙酸乙酯萃取I~6次，分離乙酸乙酯層和最后的水層，將乙酸乙酯層減壓濃縮得乙酸乙酯萃取相； (3)乙酸乙酯萃取相經凝膠色譜柱層析和硅膠色譜柱層析之至少一種制備得到灰氈毛忍冬素G。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述杜仲樹植物原料包括杜仲樹的樹干、樹枝、樹葉、樹根、樹皮、根皮、木質部中的一種或幾種。
3.灰氈毛忍冬素G在制備神`經保護藥物中的應用。
【文檔編號】A61P25/00GK103553922SQ201310549050
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】司傳領, 吳磊, 胡衛成, 黃曉鳳, 杜振國 申請人:天津科技大學