一種大黃中有效成分的磁性提取富集方法
【專利摘要】本發明公開了一種大黃中有效成分的磁性提取富集方法：大黃藥材或大黃固體制劑按照藥典進行提取，制得大黃提取液，大黃提取液與介孔四氧化三鐵納米顆粒、離子液體加水配成富集混合液，每1230μL富集混合液中包括以下組分：大黃提取液20μL、納米介孔四氧化三鐵8～20mg、離子液體0.2～0.6mg，余量為水，pH值9～13；所述富集混合液裝入離心管，置于渦旋儀上渦旋10～30s，靜置后用磁鐵靠近離心管底部，將介孔四氧化三鐵納米顆粒聚集于離心管底部，棄去上層水溶液，得富集后的介孔四氧化三鐵納米顆粒，用含有質量分數1～4%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，制得富集的大黃浸膏；所述離子液體為溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽，優選為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。本發明方法富集速度快，富集效果好，重復性和再現性高。
【專利說明】一種大黃中有效成分的磁性提取富集方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于天然藥物提取制備領域。它涉及一種中藥提取富集方法，具體地說，它涉及由離子液包裹介孔四氧化三鐵納米材料作為吸附劑，提取、富集中藥大黃中有效成分的新方法。
【背景技術】
[0002]大黃是傳統瀉下類中藥的代表，為歷版《中國藥典》和歷代醫家本草收載的常用中藥，來源于寥科植物藥用大黃、掌葉大黃或唐古特大黃的干燥根及根莖，具有瀉下攻積、逐瘀通經、利濕退黃、清熱瀉火、涼血解毒之功效。大黃中含有多種有效成分，其中以蒽醌類、二蒽酮類、芪類、鞣質和多糖研究最多，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等有效成分作為代表。其藥理作用主要有調節胃腸功能、保護心腦血管、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤、保肝及抗衰老等。
[0003]在分析化學中，樣品預處理的好壞直接影響分析結果的靈敏度和準確度。目前，樣品分離富集最常用的方法仍是溶劑萃取法，而且多以甲醇或含鹵溶劑(諸如二氯甲烷、三氯甲烷)為主，這類傳統的分離富集方法存在費時、溶劑毒性大、用量多、環境污染嚴重等缺點。為提高分離富集效率，人們一直在探索新的分離富集技術。
[0004]目前較為先進的中藥分離富集方法包括蒸餾法、頂空萃取法、固相微萃取法、超臨界流體萃取法、分子印跡技術、膜富集技術、分子蒸餾及其耦合技術以及磁性富集技術等。
[0005]磁性介孔材料，兼具磁性材料和介孔材料的雙重優勢。如高吸附性、可磁分離性、高比表面積和孔徑均一，具有重大的研究意義和廣泛的應用前景，深受廣大化學和材料工作者的青睞。因磁性介孔材料其優越的性能，故而在污水處理、催化反應、藥物控釋、生物分子的分離提純領域有廣泛的應用。目前，磁性介孔材料在中藥及天然產物的分離富集領域尚未見報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于尋求一種相比以往富集方法更加快速高效的富集方法，用于提取富集天然產物中的活性成分。發明要點在于將磁性富集和離子液提取兩者巧妙結合，充分發揮了這兩種提取富集方式的優點，用這一組合技術提取富集天然產物中的有效成分，可以取得顯著的效果。
[0007]本發明具體提供了一種以離子液包裹磁性納米材料作為吸附劑的磁性富集技術，用于富集大黃中有效成分。
[0008]本發明采用的技術方案是:
[0009]一種大黃中有效成分的磁性提取富集方法，其特征在于所述方法為:大黃藥材或大黃固體制劑按照藥典進行提取，制得大黃提取液，大黃提取液與介孔四氧化三鐵納米顆粒、離子液體加水配成富集混合液，每1230 y L富集混合液中包括以下組分:大黃提取液20 V- L、納米介孔四氧化三鐵8·~20mg、離子液體0.2~0.6mg,余量為水,pH值9~13 ;所述富集混合液裝入離心管，置于渦旋儀上渦旋10~30s,靜置(通常靜置5~IOmin)后用磁鐵靠近離心管底部，將介孔四氧化三鐵納米顆粒聚集于離心管底部，棄去上層水溶液，得富集后的介孔四氧化三鐵納米顆粒，用含有質量分數I~4%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，制得富集的大黃浸膏；所述離子液體為溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽，優選為氣化1_十二烷基_3_甲基咪唑。
[0010]進一步，優選每1230i! L富集混合液中包括以下組分:大黃提取液20iiL、納米介孔四氧化三鐵8mg、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.4mg，余量為水，pH值11。
[0011]所述洗脫優選用含有質量分數2%乙酸的甲醇溶液洗脫。更優選用含有質量分數2%乙酸的甲醇溶液洗脫三次,每次200 u L0
[0012]本發明所述大黃藥材或大黃固體制劑按照藥典2010版進行提取，所述提取方法為:將大黃藥材或大黃固體制劑粉碎，取粉末(過四號篩)0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25mL，稱定重量，加熱回流I小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10mL，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10mL，加熱回流I小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得大黃提取液。
[0013]所述離子液體優選先加水配成10~60mg/mL的離子液體水溶液，用于配制富集混合液。配制時按照離子液體水溶液的濃度和富集混合液中離子液體的質量，計算并量取所需離子液體水溶液的體積即可。
[0014]所述介孔四氧化三鐵納米顆粒可以先加水、分散均勻配成50~100mg/mL的介孔四氧化三鐵納米分散液，用于配制富集混合液。配制時按照介孔四氧化三鐵納米分散液的濃度和富集混合液中介孔四氧化三鐵納米顆粒的質量，計算并量取介孔四氧化三鐵納米分散液的體積即可。
[0015]本發明富集混合液的pH值為9~13，優選pH值為11。pH值可利用氫氧化鈉、鹽酸來進行調 節。
[0016]本發明所述介孔四氧化三鐵納米顆粒可按以下方法制得:
[0017]將氯化亞鐵四水合物和氯化鐵按照三價鐵離子與二價鐵離子的物質的量之比為3:2，加入IOOmL水中溶解，氮氣保護下攪拌，制得鐵的物質的量濃度為0.015mol/L的鐵酸鹽水溶液，并加入Ig的聚乙二醇4000乳化劑，所得混合溶液中緩慢加入濃度為0.3mol/L的氨水直至PH=Il.0，再經氮氣保護，水浴50°C下超聲30分鐘，再加熱至80°C，反應I小時后，過濾，濾餅依次用乙醇、二次蒸餾水洗滌，直至洗滌液pH=7.0，最后在60°C真空干燥4小時即得介孔四氧化三鐵納米顆粒。
[0018]這是本領域技術人員公知的方法。
[0019]所述洗脫液優選于80°C水浴鍋中揮發除去溶劑，制得富集的大黃浸膏。
[0020]制得的富集的大黃浸膏可用純甲醇50 L溶解，超聲2min，置于13000rpm離心儀中離心5min，取上層清液裝樣，超高效液相色譜(UPLC)進樣分析。
[0021]所述的富集效果,通過Waters Acquity Uplc H-Class測定大黃中有效成分的含量來表征該富集方法的有效性。
[0022]本發明的優點在于:
[0023]1.首次采用了離子液包裹磁性介孔材料這一項新技術，用離子液對介孔四氧化三鐵納米粒子進行修飾，使其具備優越的分離富集性能，并且應用在天然產物提取富集領域。所采用的新型綠色提取體系——離子液表面活性劑體系，尤其是采用長鏈離子液——氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑作為提取劑用于分離富集大黃有效成分時，與單一采用介孔四氧化三鐵納米材料相比，富集效果提高10~60多倍。與未采用離子液包裹的介孔材料相比，靈敏度提高20~60倍左右。
[0024]2.本方法富集速度快。本方法的富集環節用到磁鐵，在靠近磁鐵附近時，強大的磁場作用能使磁性納米顆粒迅速聚集，這樣就使得本發明所述的富集環節幾乎是瞬間即可完成，具有其他分離富集技術所無法比擬的高效和迅捷，遠遠勝過常規方法的富集效率。
[0025]3.本方法應用范圍廣泛，無論是大黃的原料藥材還是大黃的藥物制劑，均能用本發明方法進行分離富集。且本發明所述的測定大黃藥材和大黃制劑這兩個應用亦屬首例。
[0026]4.無論是采用的離子液，還是四氧化三鐵介孔材料，它們的理化性質均具備一系列優異突出的特性:對人體無毒、不污染環境，熱穩定性和化學穩定性良好，不易燃。
[0027]5.本發明提供的實驗操作步驟簡潔明了，操作簡單，操作環境安全，且富集效果高效顯著。
[0028]即本發明提供了一種新方法，該方法將離子液技術與磁性納米材料技術巧妙結合起來，能快速有效地富集天然產物中的有效成分。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1本發明磁性提取富集方法的工藝流程圖。
[0030]圖2為考察不同pH下的富集效果柱狀圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0031]圖3為考察不同離子液種類的富集效果柱狀圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。字母A、B、C、D分別代表不同的離子液，分別為:A:溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑；B:氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑；C:1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽；D:1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽。
[0032]圖4為考察不同離子液加入量的富集效果折線圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0033]圖5為考察洗脫液中乙酸含量的富集效果折線圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0034]圖6為考察介孔四氧化三鐵加入量的富集效果折線圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0035]圖7為大黃中五種有效成分的對照品混合液的液相色譜圖。圖中1、2、3、4、5代表著大黃中的5種有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5 --大黃素甲醚。
[0036]圖8為大黃藥材提取液的稀釋液的液相色譜圖。圖中1、2、3、4、5代表著大黃中的5種有效成分,分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0037]圖9為大黃藥材提取液富集后的液相色譜圖。圖中1、2、3、4、5代表著大黃中的5種有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚;5:大黃素甲醚。[0038]圖10為大黃通便顆粒提取液的稀釋液的液相色譜圖。圖中1、2、3、4、5代表著大黃中的5種有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。
[0039]圖11為大黃通便顆粒富集后的液相色譜圖。圖中1、2、3、4、5代表著大黃中的5種有效成分，分別為:1:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚;5:大黃素甲醚。
【具體實施方式】
[0040]通過以下實例來對本發明所提供的離子液(購于上海成捷化學有限公司)包裹磁性納米材料富集技術進行更為詳細的描述。由于其應用范圍廣，故具體實施方案也多，下面將結合幾個實例的討論對本發明的內容作進一步的闡述。
[0041]實施例中介孔四氧化三鐵納米顆粒可按以下方法制得:
[0042]按比例將氯化亞鐵四水合物和氯化鐵溶解于IOOmL去離子水中，三價鐵離子與二價鐵離子的物質的量之比為3:2，氮氣保護下攪拌，從而制得濃度為0.015mol/L的鐵酸鹽水溶液，并加入Ig的聚乙二醇4000乳化劑。混合溶液中緩慢加入濃度為0.3mol/L的氨水直至pH=ll.0。再經氮氣保護，水浴50°C，持續超聲30分鐘。混合物再加熱至80°C，反應I小時后，過濾，濾餅加入乙醇洗滌。再用二次蒸餾水洗滌，直至pH=7.0。最后在60°C真空干燥4小時即得介孔四氧化三鐵納米顆粒。加水配成80mg/mL的介孔四氧化三鐵納米分散液
[0043]實施例1.考察離子液種類對富集效果的影響
[0044]1.1取4個干凈的1.5mL規格離心管，編號為1、2、3、4。1_4均加入介孔四氧化三鐵納米分散液(80mg/mL) IOOy L、pH=ll的水1100 y L、大黃藥材提取液20 y L。
[0045]1.2在I號離心管中加入溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液(40mg/mL)10ii L，2號離心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液(40mg/mL) IOy L，3號離心管中加入1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽水溶液(40mg/mL) 10 y L，4號離心管中加入1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽水溶液(40mg/mL) 10 u L。
[0046]1.3將4個離心管一同置于渦旋儀上渦旋IOs,靜置5min。
[0047]1.4用磁鐵靠近離心管底部，將介孔四氧化三鐵納米顆粒聚集于離心管底部，棄去上層水溶液。
[0048]1.5用含有2%乙酸的甲醇溶液對4個離心管中的介孔四氧化三鐵納米顆粒均洗脫三次，每次200 ii L。另取干凈的4個離心管編號a，b，c，d，對應1、2、3、4離心管，合并裝入洗脫液。將a，b，c，d離心管置于80°C水浴鍋中揮干。
[0049]1.6揮干后的殘留固體用純甲醇50ii L溶解,超聲2min,置于13000rpm離心儀中離心5min，取上層清液裝樣，用超高效液相色譜(UPLC)進樣分析。
[0050]UPLC色譜條件為:[0051]色譜柱:ACQUITYUPLC ? BEH C18,l.7um,2.1 X 50mm(Waters)。流動相:0.1% 甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，0 ~lmin，B 為 25% ~30% ; I ~3min，B 為 30% ~45% ；3 ~5min，B 為 45% ~60% ；5 ~7min，B 為 60% ~80% ；7 ~8min，B 為 80% ~100% ；8 ~8.5min, B 為100% ~100% ；8.5 ~IOmin, B 為 100% ~25%。流速 0.5mL/min,進樣量 l.0uL,檢測波長254nm，柱溫 30°C。
[0052]實驗結果如下表1，表1中的數據為峰面積。
[0053]表1
離子液種類蘆薈大黃素大黃酸大黃素大黃酚大黃素甲醚
A1813 4415 7703 4900900~ [0054]B21151 40300 27061 5442810190
C 178 582 400 1224 606
D 691 556 1479 3954 937
[0055]A:溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0056]B:氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0057]C:1_ 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽
[0058]D:1_ 丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽
[0059]圖3也顯示了不同離子液種類的富集效果柱狀圖。圖中，1、2、3、4、5分別代表大黃中不同的有效成分，分別為:蘆薈大黃素；2:大黃酸；3:大黃素；4:大黃酚；5:大黃素甲醚。字母A、B、C、D分別代表不同的離子液，分別為:A:溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑；B:氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑；C:1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽；D:1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽。
[0060]通過比較峰面積可以發現，比較長鏈離子液A、B和短鏈離子液C、D，可以發現長鏈離子液的富集效果更好，而在長鏈離子液中，使用氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液是最佳條件，而且4種離子液的色譜峰形最優者為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液富集，而且富集后的溶液呈黃色，用氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液富集之后的顏色最深。
[0061]實施例2.考察不同離子液加入體積對富集效果的影響
[0062]2.1取4個干凈的1.5mL規格離心管，編號為1、2、3、4。1_4均加入介孔四氧化三鐵納米分散液(80mg/mL) 100 u L、大黃藥材提取液20 u L。
[0063]2.2在I號離心管中加入純水IOii L和pH=ll的水IlOOii L，2號離心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液(40mg/mL) 5 y L和pH= 11的水1105 uL,3號離心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液(40mg/mL)10iiL和pH=ll的水IlOOy L，4號離心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液(40mg/mL)15iiL和pH=ll的水1095 yL。
[0064]2.3將4個離心管一同置于渦旋儀上渦旋IOs,靜置5min。
[0065]2.4用磁鐵靠近離心管底部，將介孔四氧化三鐵納米顆粒聚集于離心管底部，棄去上層水溶液。
[0066]2.5用含有2%乙酸的甲醇溶液對4個離心管中的介孔四氧化三鐵納米顆粒均洗脫三次，每次200 u L0另取干凈的4個離心管編號a，b，c，d，對應1、2、3、4離心管，合并裝入洗脫液。將a，b，c，d離心管置于80°C水浴鍋中揮干。
[0067]2.6揮干后的殘留固體用純甲醇50iiL溶解，超聲2min，置于13000rpm離心儀中離心5min，取上層清液裝樣，用UPLC進樣分析。
[0068]實驗結果如下表2，表2中的數據為峰面積。
[0069]表 2
[0070]
【權利要求】
1.一種大黃中有效成分的磁性提取富集方法，其特征在于所述方法為:大黃藥材或大黃固體制劑按照藥典進行提取，制得大黃提取液，大黃提取液與介孔四氧化三鐵納米顆粒、離子液體加水配成富集混合液，每1230 UL富集混合液中包括以下組分:大黃提取液20 u L、納米介孔四氧化三鐵8~20mg、離子液體0.2~0.6mg,余量為水，pH值9~13 ;所述富集混合液裝入離心管，置于渦旋儀上渦旋10~30s，靜置后用磁鐵靠近離心管底部，將介孔四氧化三鐵納米顆粒聚集于離心管底部，棄去上層水溶液，得富集后的介孔四氧化三鐵納米顆粒，用含有質量分數I~4%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，制得富集的大黃浸膏；所述離子液體為溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸鹽。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述離子液體為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于每1230y L富集混合液中包括以下組分:大黃提取液20 u L、納米介孔四氧化三鐵8mg、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.4mg，余量為水，pH值11。
4.如權利要求1~3之一所述的方法，其特征在于所述洗脫用含有質量分數2%乙酸的甲醇溶液洗脫。
5.如權利要求1~3之一所述的方法,其特征在于所述大黃藥材或大黃固體制劑按照藥典2010版進行提取，所述提取方法為:將大黃藥材或大黃固體制劑粉碎，取粉末(過四號篩)0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25mL，稱定重量，加熱回流I小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10mL，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10mL，加熱回流I小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷`洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得大黃提取液。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述離子液體先加水配成10~60mg/mL的離子液體水溶液，用于配制富集混合液。
7.如權利要求1~3之一所述的方法，其特征在于所述介孔四氧化三鐵納米顆粒先加水、分散均勻配成50~100mg/mL的介孔四氧化三鐵納米分散液,用于配制富集混合液。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述洗脫用含有質量分數2%乙酸的甲醇溶液洗脫三次，每次200 ii L。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脫液于80°C水浴鍋中揮發除去溶劑，制得富集的大黃浸膏。
【文檔編號】A61K36/708GK103655749SQ201310539843
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】曹君, 胡帥帥, 代菡鑌, 劉曉娟, 達建華, 曹婉 申請人:杭州師范大學