硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途
【專利摘要】本發明涉及一種硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途，本發明首次發現硫酸軟骨素可以調控特異miRNA的表達、增加細胞因子伽馬干擾素和白細胞介素-2的合成和提高淋巴細胞的產生，從而增強機體的免疫能力以抑制腫瘤細胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作為免疫增強劑用于癌癥的治療。
【專利說明】硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途，屬于硫酸軟骨素的醫藥新用途。
【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素是由D-葡萄糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成雙糖基本單位構成的粘多糖類物質，是生物體內結締組織基質的成分之一，可從動物的鼻骨、喉骨及其它軟骨中提取。臨床上，硫酸軟骨素片用于治療風濕、類風濕性關節炎、肩周炎、類軟骨炎以及高脂血癥；硫酸軟骨素注射液用于神經性頭痛、神經痛、關節痛、動脈硬化等疾病的輔助治療；硫酸軟骨素滴眼液用于眼疲勞、眼干燥癥及角膜炎、角膜潰瘍和角膜損傷的治療。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途，本發明首次發現硫酸軟骨素可以調控特異miRNA的表達、增加細胞因子伽馬干擾素和白細胞介素-2的合成和提高淋巴細胞的產生，從而增強機體的免疫能力以抑制腫瘤細胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作為免疫增強劑用于癌癥的治療。
[0004]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途。
[0005]本發明的有益效果是:
[0006]本發明首次發現硫酸軟骨素可以調控特異miRNA的表達、增加細胞因子伽馬干擾素和白細胞介素-2的合成和提高淋巴細胞的產生，從而增強機體的免疫能力以抑制腫瘤細胞的生長。所以，硫酸軟骨素可以作`為免疫增強劑用于癌癥的治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1為硫酸軟骨素對小鼠體內B16F10黑色素瘤細胞生長的抑制作用圖；
[0008]圖2為硫酸軟骨素對轉移于小鼠肺部的B16F10黑色素瘤細胞生長的抑制作用圖；
[0009]圖3為硫酸軟骨素對小鼠肺部B16F10黑色素瘤細胞生長抑制作用的統計結果圖；
[0010]圖4為硫酸軟骨素對miR-223表達的抑制作用圖；
[0011]圖5為硫酸軟骨素對伽馬干擾素產生的促進作用圖；
[0012]圖6為硫酸軟骨素對白細胞介素-2產生的促進作用圖；
[0013]圖7硫酸軟骨素對淋巴細胞生長的促進作用圖；
[0014]圖8為硫酸軟骨素對小鼠脾臟淋巴細胞的促進作用圖。【具體實施方式】
[0015]以下對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。
[0016]本發明所用硫酸軟骨素的制備方法參考Fialkova，M.A.et al.，1989.The effectof chondroitin sulfate preparations on wound healing and the strength of thesurgical scar,Biull Eksp Biol Med， 108(9):350-351。
[0017]實驗例:采用小鼠動物模型評價硫酸軟骨素對抗腫瘤免疫的增強作用和對B16F10黑色素瘤的治療效果
[0018]1、材料:
[0019]1.1處于生長對數期的B16F10黑色素瘤細胞購買自美國ATCC公司。
[0020]1.2小鼠購自美國Jackson實驗室。
[0021]2、方法:
[0022]第一組小鼠共20只，每只小鼠皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細胞；第一組小鼠又分為第一藥物對照組和第一藥物處理組。
[0023]第二組小鼠共20只，每只小鼠靜脈注射五十萬B16F10黑色素瘤細胞；第二組小鼠又分為第二藥物對照組和第二藥物處理組。
[0024]空白對照組小鼠共10只，每只小鼠未注射B16F10黑色素瘤細胞。
[0025]第一藥物對照組和第二藥物對照組的小鼠腹腔注射生理鹽水，每只注射100微升生理鹽水，第一藥物處理組和第二藥物處理組的小鼠隔一天靜脈注射I毫克硫酸軟骨素；然后，每天觀察小鼠的體形變化和記錄小鼠的體重。在第三天、第七天、第九天和第十一天，每組分別殺死三只小鼠，分析小鼠體內黑色素瘤細胞的生長和免疫系統的變化。
[0026]數據統計
[0027]數據均采用了數據統計分析，圖中的p < 0.0001、p < 0.01、p < 0.005和p< 0.05，表明對照組與處理組有顯著的差別。
[0028]3、結果:
[0029]第一藥物對照組的小鼠皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細胞后，黑色素瘤細胞在體內不斷長大，而第一藥物處理組的小鼠在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細胞后，靜脈注射了硫酸軟骨素，硫酸軟骨素明顯抑制了 B16F10黑色素瘤細胞在小鼠體內的生長，結果如圖1所示，從圖1可以看到，第一藥物對照組的小鼠，在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細胞后的第16天，側背可見腫瘤小塊，隨后迅速增大，到第30天腫瘤塊已達350立方毫米以上。而注射硫酸軟骨素的第一藥物處理組小鼠，在皮下注射一百萬B16F10黑色素瘤細胞后的第20天以后，才見腫瘤小塊的出現，并且腫瘤塊沒有繼續明顯增大，到第30天腫瘤塊也僅有25立方毫米。
[0030]第二組小鼠每只小鼠靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細胞，正常小鼠的肺顏色均一，第二藥物對照組的小鼠由于B16F10黑色素瘤細胞轉移至肺部生長，因此，在肺部表面形成密密麻麻的B16F10黑色素瘤，而第二藥物處理組的小鼠由于注射了硫酸軟骨素，顯著減少了轉移的B16F10黑色素瘤細胞在肺部的生長，因此，第二藥物處理組小鼠的肺部B16F10黑色素瘤明顯少于第二藥物對照組，如圖2所示。硫酸軟骨素對小鼠肺部B16F10黑色素瘤細胞生長抑制作用的統計結果如圖3所示，從圖3可以看出，第二藥物對照組的小鼠在靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細胞后的第11天，在小鼠的肺部平均可發現170個腫瘤小塊。而注射硫酸軟骨素的第二藥物處理組小鼠，在靜脈注射了五十萬B16F10黑色素瘤細胞后的第11天，在小鼠的肺部平均只發現40個腫瘤小塊，顯著少于第二藥物對照組的小鼠。當然，未靜脈注射B16F10黑色素瘤細胞的空白對照組小鼠，在其肺部沒有發現任何腫瘤塊。
[0031]經測定和分析表明，硫酸軟骨素能降低miRNA-223分子的表達，如圖4所示，從而增加細胞因子伽馬干擾素的合成增加，如圖5所示，因此，增強抗腫瘤的免疫系統，如圖6~8所示。從小鼠脾臟中分離淋巴細胞，在24孔培養板每孔加入2毫升RPM1-1640培養基，然后每孔加入一百萬小鼠淋巴細胞。實驗共分三組，每組8孔淋巴細胞。第一組為對照組，無額外添加物；第二組為腫瘤抗原gplOO處理組，每孔添加10_5摩爾gplOO腫瘤抗原；第三組為硫酸軟骨素處理組，每孔添加1(T5摩爾gplOO腫瘤抗原和50微克/毫升硫酸軟骨素。在37°C、5%C02培養箱培養三天后，收集淋巴細胞。然后從淋巴細胞中分離RNA樣品，逆轉錄合成cDNA，進行熒光實時定量PCR測定miR-223的表達水平并進行比較。結果如圖4顯示，與第一對照組相比，在第二組中gplOO腫瘤抗原處理明顯降低miR-223的表達水平；在第三組中，硫酸軟骨素處理進一步降低miR-223的生成。結果表明，硫酸軟骨素能降低miRNA-223分子的表達。研究已經證實，miR-223能夠抑制伽馬干擾素的產生。通過不同濃度硫酸軟骨素培養淋巴細胞顯示，硫酸軟骨素能夠增加細胞因子伽馬干擾素的合成增加，如圖5所示。因此，硫酸軟骨素可能降低miRNA-223合成從而增加伽馬干擾素的產生。同樣地，通過不同濃度硫酸軟骨素培養淋巴細胞顯示硫酸軟骨素能促進白細胞介素-2的產生，如圖6所示；氚標記的胸腺嘧啶核苷同位素示蹤試驗表明，硫酸軟骨素也促進淋巴細胞的分裂，如圖7所示。脾臟淋巴細胞計數顯示，硫酸軟骨素處理明顯增加淋巴細胞的數目，如圖8所示。因此，硫酸軟骨素能增強抗腫瘤的免疫系統。
[0032]上述實驗中，每次試驗至少重復3次。每次試驗結果一致。圖中的數據是每次試驗結果的平均值，并表明了實驗誤差。
[0033]由上述實施例表明，硫酸軟骨素對B16F10黑色素瘤具有良好的抑制作用，主要是通過增強抗腫瘤的免疫反應從而抑制B16F10黑色素瘤細胞的生長。由此證明，硫酸軟骨素具有間接的抗黑色素瘤活性，能用于制`備增強抗腫瘤免疫反應的藥物，治療癌癥病人。
[0034]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.硫酸軟骨素在制備抗腫瘤免疫增強劑中的用途，所述硫酸軟骨素的結構式如下所示:
【文檔編號】A61K31/737GK103610689SQ201310539374
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】周菊華 申請人:魯東大學