一種pH敏感性修飾脂質體及其制備方法

一種pH敏感性修飾脂質體及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種pH敏感性修飾脂質體。該pH敏感性修飾脂質體由聚天冬氨酸或脂肪胺接枝聚天冬氨酸為脂質體修飾劑制成，其粒徑分布均勻、性質穩定，具有顯著的pH敏感特性及很好的靶向性。本發明還涉及一種用于制備上述pH敏感性修飾脂質體的制備方法。該方法充分利用修飾劑與脂質體表面的靜電吸附作用，可以在脂質體制備的同時完成修飾劑對脂質體的修飾，即以“一步法”制備脂質體，節省了大量的制備時間。該方法操作簡單、快速、成本低廉，制備效率高。
【專利說明】一種pH敏感性修飾脂質體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物制劑領域，具體涉及PH敏感性修飾脂質體的制備方法。
【背景技術】
[0002]腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，而目前治療腫瘤的有效且常見的手段之一是藥物治療。然而，多數抗代謝類抗腫瘤藥物缺乏對細胞的選擇性，在抑制腫瘤細胞的DNA復制的同時亦會抑制正常細胞的DNA復制，毒性較大。目前臨床使用的多數傳統劑型的抗腫瘤藥物生物利用度低，有些具有致敏性和嚴重的毒副作用，難以發揮治療效果的同時給患者造成痛苦。
[0003]脂質體是一種與生物膜結構類似的雙層磷脂分子，可以使藥物的體內分布發生改變，降低抗腫瘤藥物的毒性。
[0004]腫瘤組織間質液會出現異常酸化現象，pH低于正常組織，其pH值約為5.0。利用此特性，制備有特定PH響應修飾劑修飾的脂質體，可以實現脂質體的pH敏感性，從而實現抗腫瘤藥的祀向給藥。
[0005]中國專利CN101049504A提供了一種簡便的脂質體制備方法，以聚乙二醇甘油雙酯為主要成分,可自動形成脂質體并且性質穩定,增加了脂質體的包封率。但這種脂質體缺乏良好的祀向性，無法實現在特定祀向部位定向給藥，限制了它的應用范圍。
[0006]中國專利CN101264057A記述了一種pH敏感長循環脂質體組合物的制備方法，以羧甲基殼聚糖為修飾劑，利用羧甲基殼聚糖響應PH產生構象變化的性質實現pH敏感性，所得PH敏感長循環脂質體組合物粒徑均一并可實現長效釋放。然而，這種pH敏感長循環脂質體組合物的制備過程仍然遵循先制備再修飾的策略，工藝耗時較長，不利于實際應用。
[0007]修飾脂質體的制備方法一般遵循“脂質體制備一修飾劑水合修飾”兩步完成，目前尚無一步法制備修飾脂質體的報道。

【發明內容】

[0008]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種pH敏感性修飾脂質體。該PH敏感性修飾脂質體由聚天冬氨酸和/或脂肪胺接枝聚天冬氨酸為脂質體修飾劑制成，其粒徑分布均勻、性質穩定，具有顯著的PH敏感特性及很好的靶向性。
[0009]本發明還提供了一種上述pH敏感性修飾脂質體的“一步法制備方法”，該方法充分利用修飾劑與脂質體表面的靜電吸附作用，可以在脂質體制備的同時完成修飾劑對脂質體的修飾，即以“一步法”制備脂質體，節省了大量的制備時間。該方法操作簡單、快速、成本低廉，制備效率高。
[0010]為此，本發明一方面提供了一種PH敏感性修飾脂質體，其包括治療藥物、磷脂、表面活性劑、脂質體修飾劑，其中所述脂質體修飾劑為聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸。
[0011]據本發明人研究發現，聚天冬氨酸(PASP)是一種生物親和性極佳的大分子，可以響應外界PH的變化發生構象改變，將PASP及其衍生物修飾于脂質體可以獲得pH敏感性的修飾脂質體。
[0012]根據本發明，所述的聚天冬氨酸或改性聚天冬氨酸的分子量為1.0X104~IO-OXlO40據本發明人研究發現，在聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸作為脂質體修飾劑制備pH敏感性修飾脂質體時，當聚天冬氨酸和改性聚天冬氨酸的分子量低于1.0X IO4時，所制得的PH敏感性修飾脂質體無法發生顯著的pH響應性；而當聚天冬氨酸和改性聚天冬氨酸的分子量高于10.0X IO4時，所制得的pH敏感性修飾脂質體粒徑過大，極易發生聚沉。
[0013]根據本發明，所述改性聚天冬氨酸為脂肪胺接枝聚天冬氨酸。
[0014]在本發明的一個實施例中，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸所接枝的脂肪胺碳鏈長度為2~18。
[0015]在本發明的另一個實施例中，為保證改性后的聚天冬氨酸保持其pH敏感性，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸的接枝率不超過40%。
[0016]聚天冬氨酸(PASP)及其衍生物脂肪胺接枝聚天冬氨酸是一種可降解的陰離子型聚合物，富含-C00-具有響應pH發生構象變化的性質。
[0017]帶負電的PASP以及脂肪胺接枝聚天冬氨酸可以通過靜電吸附作用連接到帶正電的脂質體表面。當脂質體處于偏酸性介質的時候，修飾劑會發生構象變化而使脂質體雙分子層結構被破壞，藥物釋出。而脂肪胺接枝聚天冬氨酸由于分子中含有脂肪鏈段，可以嵌入磷脂雙分子層中，增加脂質體穩定性。
[0018]根據本發明， 在所述pH敏感性修飾脂質體內，各組分按質量份計含量為:
[0019]
治療藥物1份
磷脂I~16份，
表面活性劑I~8份，
[0020]
脂質體修飾劑10~120份。
[0021]在本發明的一個實施例中，所述的治療藥物為治療各種腫瘤性疾病的治療藥物，包括，例如阿糖胞苷、阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、長春堿、紫杉類、抗葉酸制劑、環磷酰胺、
5-氟尿嘧啶、順鉬、單克隆抗體藥物和基因治療藥物中的一種或幾種。優選所述的治療藥物選自鹽酸阿糖胞苷、鹽酸柔紅霉素、鹽酸表阿霉素和紫杉醇中的一種或幾種。
[0022]在本發明的另一個實施例中，所述磷脂選自甘油磷脂，包括蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、二磷脂酰甘油中的一種或幾種。
[0023]在本發明的又一實施例中，所述表面活性劑包括但不限于膽固醇。
[0024]根據本發明，所述pH敏感性修飾脂質體粒徑為0.1~ΙΟμπι。其可制成注射液、凍干粉針劑等。
[0025]本發明另一方面提供了一種如上所述的pH敏感性修飾脂質體的制備方法，包括:
[0026]步驟A，脂類的分散:將磷脂、表面活性劑溶于有機溶劑中混合均勻，制成脂類混合溶液；
[0027]步驟B，藥物加載:將藥物配制成水溶液加入脂類混合溶液中，超聲乳化制得藥物乳液；
[0028]步驟C，脂質體形成與修飾:將脂質體修飾劑溶于水中，調節pH之后加入藥物乳液中，減壓蒸餾制得PH敏感性修飾脂質體乳液。
[0029]根據本發明方法，在步驟C中調節pH至7.4~10.0。
[0030]本發明中，保證修飾劑溶液的弱堿性可以使聚天冬氨酸和脂肪胺接枝聚天冬氨酸中大量存在的-COOH充分電離，保證修飾劑與磷脂帶正電頭部有效結合，完成對脂質體的修飾。而若PH大于10，則過高的堿性反而會破壞脂質體的結構。
[0031]根據本發明方法，在步驟B中，所述藥物乳液為W/0型乳液。
[0032]在本發明的一個實施方式中，所述的有機溶劑包括乙醚、二氯甲烷、氯仿或其混合物。所述超聲乳化的時間為I~10分鐘。優選所述超聲乳化的時間為I~6分鐘。
[0033]如前文所述，由于生物大分子的性質多樣，人們常選擇不同理化性質的分子作為脂質體修飾劑，從而制備出不同功能的脂質體。目前已有的技術仍在沿用薄膜分散法、乙醇蒸發法、復乳法等傳統的脂質體制備方法。即以去離子水或緩沖液作為脂質體乳液的水相，減壓蒸餾得到普通脂質體后再加入所需修飾劑對脂質體進行孵育，最后得到修飾脂質體。
[0034]而本發明提供了一種可以省略“修飾劑孵育脂質體”步驟，從而“一步”得到修飾脂質的方法。本發明方法是即將修飾劑溶液直接作為水相加入到載藥后的磷脂體系中，在整個體系減壓蒸餾的過程中直接得到修飾脂質體，不需再經過孵育過程，大大提高了生產效率。
[0035]本發明中修飾劑辛胺接枝聚天冬氨酸實際接枝率的測定方法如下:
[0036]稱取約40mg辛胺接枝聚天冬氨酸,充分溶解于氣代水中，于Bruker AV600核磁共振波譜儀中檢測，根據核磁共振譜圖中的側鏈與主鏈峰面積的比值計算接枝率。
[0037]本發明所提供的pH敏感性修飾脂質體由聚天冬氨酸和/或脂肪胺接枝聚天冬氨酸為脂質體修飾劑制成，其粒徑分布均勻、性質穩定，具有顯著的PH敏感特性及很好的靶向性。
[0038]用于制備上述pH敏感性修飾脂質體的本發明的制備方法充分利用修飾劑與脂質體表面的靜電吸附作用，可以在脂質體制備的同時完成修飾劑對脂質體的修飾，即以“一步法”制備脂質體，節省了大量的制備時間。該方法操作簡單、快速、成本低廉，制備效率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]下面結合附圖來對本發明作進一步詳細說明:
[0040]圖1是實施例1中的PASP修飾pH敏感性脂質體的透射電子顯微鏡照片。
[0041]圖2是實施例1中辛胺接枝聚天冬氨酸修飾pH敏感性脂質體的粒徑分布圖。
[0042]圖3是實施例3中辛胺接枝聚天冬氨酸阿糖胞苷修飾pH敏感性阿糖胞苷脂質體在不同PH介質中的藥物釋放曲線。
[0043]圖4是實施例4中辛胺接枝聚天冬氨酸修飾pH敏感性紫杉醇脂質體在不同pH介質中的藥物釋放曲線。
【具體實施方式】
[0044]為使本發明更加容易理解，下面將結合附圖和實施例來詳細說明本發明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。[0045]實施例
[0046]實施例1:
[0047] 精密稱取卵磷脂48mg,膽固醇12mg,加入2.5ml乙醚充分溶解。注入12mg/ml的阿糖胞苷水溶液lml。超聲2min形成W/0型乳液。加入修飾劑一質量分數2.5%的pH8.8的聚天冬氨酸水溶液充分搖勻，置于旋轉蒸發儀(RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠)0.02MPa、25°C旋蒸30min即得。用透射電子顯微鏡(JEM-3010高分辨型透射電子顯微鏡，日本電子公司)分析PH敏感性修飾脂質體粒子的表面結構，結果見圖1。利用激光粒度分析儀(Mastersizer2000型,英國馬爾文公司)測得聚天冬氨酸修飾阿糖胞苷脂質體平均粒徑為183nm，見圖 2。
[0048]實施例2:
[0049]精密稱取卵磷脂48mg,膽固醇12mg,加入2.5ml乙醚充分溶解。注入12mg/ml的阿糖胞苷水溶液lml。超聲2min形成W/0型乳液。加入外水相一質量分數2.5%、接枝率8%的pH8.8的辛胺接枝聚天冬氨酸水溶液充分搖勻，置于旋轉蒸發儀0.02MPa、25°C減壓旋轉蒸發30min即得。采用與實施例1相同的方法測得辛胺接枝聚天冬氨酸修飾阿糖胞苷脂質體平均粒徑為332nm。
[0050]對比實施例1和實施例2的結果可以發現，選用帶有疏水脂肪鏈段的修飾劑一辛胺接枝聚天冬氨酸可以得到粒徑更大的脂質體，這是因為疏水段的存在增加了修飾劑與磷脂的疏水段的親和性，使得更多的修飾劑分子結合與脂質體表面。實施例3:
[0051]按實施例1的方法制備以接枝率8%的辛胺接枝聚天冬氨酸修飾的阿糖胞苷脂質體，并測定PH敏感修飾脂質體在pH5.0和pH7.4的介質中的藥物釋放曲線。藥物釋放以反透析法測定，具體過程為配制PH5.0和pH7.4的磷酸緩沖液，量取200ml緩沖液作為外液，同種溶液IOml置于截留分子量3500的透析袋(D6066-25EA，Sigma)內作為內液，取2ml剛制備好的脂質體乳液于外液，每隔一定時間從內液中取樣2ml，置于全波長酶標儀中測定吸光度，并依據標準曲線換算為濃度計算滲漏量。即得PH敏感脂質體藥物釋放曲線，如圖3所示。
[0052]實施例4:
[0053]精密稱取卵磷脂48mg,膽固醇16mg,紫杉醇12mg加入2.5ml乙醚充分溶解。注入lml pH7.4的磷酸緩沖液，超聲2min形成W/0型乳液。加入修飾劑一質量分數2.5%、接枝率12%的pH8.8的辛胺接枝聚天冬氨酸水溶液充分搖勻，置于旋轉蒸發儀0.02MPa、25°C減壓旋轉蒸發30min即得。按實施例3的方法進行藥物釋放測定，結果見圖4。
[0054]實施例3、4表明，脂肪胺接枝聚天冬氨酸可用于制備pH敏感性的修飾脂質體，且無論包埋藥物的親疏水性，都可以實現在偏酸環境下的快速、靶向釋放。
[0055]從上述實施例可以看出:利用本發明敘述的“一步法制備方法”和修飾劑，可以得到粒徑均一、在偏酸環境下靶向釋放、用途廣范、工藝簡便的修飾脂質體。
[0056]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種pH敏感性修飾脂質體，其包括治療藥物、磷脂、表面活性劑、脂質體修飾劑，其中所述脂質體修飾劑為聚天冬氨酸和/或改性聚天冬氨酸。
2.根據權利要求1所述的pH敏感性修飾脂質體，其特征在于，所述的聚天冬氨酸或改性聚天冬氨酸的分子量為1.0XlO4~10.0X104。
3.根據權利要求1或2所述的pH敏感性修飾脂質體，其特征在于，所述改性聚天冬氨酸為脂肪胺接枝聚天冬氨酸。
4.根據權利要求3所述的pH敏感性修飾脂質體，其特征在于，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸所接枝的脂肪胺碳鏈長度為2~18。
5.根據權利要求4所述的pH敏感性修飾脂質體，其特征在于，所述脂肪胺接枝聚天冬氨酸的接枝率不超過40%。
6.根據權利要求1到5中任意一項所述的pH敏感修飾脂質體，其特征在于:在所述pH敏感性修飾脂質體內，各組分按質量份計含量為:
7.根據權利要求1到6中任意一項所述的pH敏感性修飾脂質體，其特征在于:所述pH敏感性修飾脂質體粒徑為0.1~10 μ m。
8.一種根據權利要求1到7中任意一項所述的pH敏感性修飾脂質體的制備方法，包括:步驟A，脂類的分散:將磷脂、表面活性劑溶于有機溶劑中混合均勻，制成脂類混合溶液；步驟B，藥物加載:將藥物配制成水溶液加入脂類混合溶液中，超聲乳化制得藥物乳液； 步驟C，脂質體形成與修飾:將脂質體修飾劑溶于水中，調節pH之后加入藥物乳液中，減壓蒸餾制得PH敏感性修飾脂質體乳液。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，在步驟C中調節pH至7.4~10.0。
10.根據權利要求8或9所述的制備方法，其特征在于，所述的有機溶劑包括乙醚、二氯甲烷、氯仿或其混合物；所述超聲乳化的時間為I~10分鐘；優選所述超聲乳化的時間為I~6分鐘。
【文檔編號】A61P35/00GK103585106SQ201310520265
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】蘇海佳, 王麗琳, 譚天偉 申請人:北京化工大學