三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法
【專利摘要】三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法，屬于生物醫藥【技術領域】，采用一種可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發法制得載三氧化二砷納米粒。通過化學鍵共價偶聯的方法在載三氧化二砷納米粒表面修飾兩親性聚乙二醇，賦予其“隱形”功能，通過表面同步修飾LA，賦予其免疫靶向性。最終獲得的三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑微粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包封率可達90%以上。在體外可穩定釋放45天，具備緩釋功能，是一種新穎、高效的隱形免疫靶向As2O3制劑。
【專利說明】三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，尤其涉及一種包封抗癌藥物As2O3的制備方法。
【背景技術】
[0002]三氧化二砷(As2O3)是傳統中藥砒霜中的主要活性成分，研究發現As2O3對急性早幼粒細胞白血病(APL)具有顯著的療效，可誘導APL細胞凋亡。最近的研究表明As2O3對惡性實體瘤也具有強大的抗腫瘤作用，尤其是As2O3抗肝癌的作用受到國內外腫瘤界的廣泛關注。但是使用As2O3作為抗肝癌藥物，仍然存在著一定的問題:(I)血漿中砷的半衰期很短，給藥后短時間內就會被迅速清除；(2)藥物本身具有毒性，這也就限定了其直接使用時劑量必須要低，相應的抗癌效果也隨之降低。
[0003]針對上述問題，國內外的研究者提出了將砷化物制成緩釋制劑，以延長其在體內的半衰期，其中以脂質體的研究最為廣泛。然而脂質體不穩定，包封藥物后容易泄露，帶來一定的毒副作用。另外傳統的緩釋制劑無靶向性，給藥后分布于全身各個器官，很大程度上削弱了藥物的抗癌效果；同時藥劑在進入人體后，難以逃避人體免疫系統中巨噬細胞對其的吞噬作用，使得最終達到病變部位發揮藥效的藥劑大打折扣。因此，提出一種可以高效、穩定地包封As2O3的隱形免疫靶向抗腫瘤制劑，提高其抗癌效果，具有十分重大的意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服抗癌藥物As2O3在使用過程中存在的不足，從而提出一種新穎、高效、隱形、靶向的As2O3抗腫瘤制劑的制備方法。
[0005]本發明的步驟如下:
1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，配成含As2O3濃度為l(Tl00mg/mL的砷溶液，作為水相；
2)將乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，作為油相；
3)將水相在磁力攪拌下加入到油相中，然后冰浴乳化超聲，形成W/0初乳；
4)將W/0初乳與第一份泊洛沙姆的水溶液混合，冰浴乳化超聲形成W/0/W復乳；
5)將W/0/W復乳與第二份泊洛沙姆水溶液均勻混合后，蒸發除去有機溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得載三氧化二砷納米粒。
[0006]6)將上述載三氧化二砷納米粒分散于水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化后，與雙端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2X乳糖酸(LA)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)在室溫下磁力攪拌反應，離心收集沉淀，即得三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑。
[0007]本發明采用一種可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為包封材料，采用雙乳化-溶劑揮發法制得載三氧化二砷納米粒。通過化學鍵共價偶聯的方法在載三氧化二砷納米粒表面修飾兩親性聚乙二醇(PEG)，賦予其“隱形”功能，通過表面同步修飾LA，賦予其免疫靶向性。最終獲得的三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑微粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包封率可達90%以上。在體外可穩定釋放45天，具備緩釋功能，是一種新穎、高效的隱形免疫靶向As2O3制劑，可望應用于肝癌的治療。
[0008]另，步驟I)中，所述氫氧化鈉水溶液的質量百分比為4%，以增大As2O3的溶解度。
[0009]步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)的濃度為30~50mg/mL，以提高As2O3包封率。
[0010]步驟3)中，所述水相和油相的混合體積比為1:10，超聲功率為180W，超聲時間為60s,以形成均勻的W/0初乳液。[0011]步驟4)中，第一份泊洛沙姆水溶液的質量百分比濃度為3%，超聲功率為360W，超聲時間為90s，以形成分散均勻的W/0/W復乳液。
[0012]步驟5)中，第二份泊洛沙姆水溶液的質量百分比濃度為0.3%，將W/0/W復乳與第二份泊洛沙姆水溶液混合時以機械攪拌，速度為1200rpm，以進一步分散穩定W/0/W復乳。
[0013]步驟6)中，載三氧化二砷納米粒、NH2-PEG-NH2和LA的投料摩爾比為1:1.3:1，以保證NH2-PEG-NH2有足夠的氨基共價偶聯載三氧化二砷納米粒和LA。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為As2O3隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法示意圖。
[0015]圖2為As203/PLGA-PEG-LA納米微球的3萬倍SEM圖。
[0016]圖3為As203/PLGA-PEG-LA納米微球的10萬倍SEM圖。
[0017]圖4為載As2O3納米微球的FT-1R圖。
[0018]圖5為As203/PLA納米微球的DLS圖。
[0019]圖6 為 As203/PLGA-PEG 納米微球的 DLS 圖。
[0020]圖7 為 As203/PLGA-PEG-LA 納米微球的 DLS 圖。
[0021 ]圖8為藥物As2O3的AFS標準曲線圖。
[0022]圖9為載As2O3納米粒的體外控制釋放曲線圖。
[0023]圖10為釋放45天的載As2O3納米粒的體外懸浮穩定性的照片。
【具體實施方式】
[0024]以下通過實施案例對本發明做進一步的闡述，但本發明不限于此。實驗者可根據實際需要選擇性地在微球表面單獨地修飾上PEG、LA或是同時修飾上PEG和LA，從而可以得到緩釋、隱形、免疫靶向、隱形免疫靶向等多種不同功能的微球。
[0025]本發明使用的高分子材料為PLGA，也可以為PLA、PLA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物等。
[0026]實施例1:
1、制備負載三氧化二砷的聚乳酸納米微球(As203/PLA NPs)，如圖1所示:
(1)稱取10mg As2O3溶于ImL質量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成10mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將100mg聚乳酸(PLA)溶于2mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取200PL上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到2mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成m初乳；(4)將此初乳加入到4mL質量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復乳；
(5)將W/0/W復乳加入到50mL質量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫攪拌4h,然后旋轉蒸發30min除去有機溶劑，12000r/min下離心20min,去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLA納米微球。
[0027]2、得到的As203/PLA納米微球球形規整，分布均勻(見圖2和圖3);平均粒徑為300.1xm, PDI為0.235 (如圖5所示)；包封率為88.72%，在體外可穩定釋放45天，釋放率達55.06% (如圖9所示)。
[0028]實施例2:
1、制備負載三氧化二砷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物隱形納米微球(As203/PLGA_PEGNPs)，如圖1所示:
(1)稱取10mg As2O3溶于ImL質量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成10mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將60mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于2mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取200PL上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到2mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成W/0初乳；
(4)將此初乳加入到4mL質量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復乳； (5)將此復乳加入到50mL質量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫攪拌4h，然后旋轉蒸發30min除去有機溶劑，12000r/min下離心20min，用去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLGA納米微球。
[0029](6)將50mg (0.0025mM)冷凍干燥過的As203/PLGA納米微球分散于50mL蒸餾水中，加入 0.0125mM 的 NHS 活化 lh，然后加入 0.0033mM 的 NH2-PEG-NH2 和 0.0125mM 的 EDC，室溫下，磁力攪拌72h,離心收集沉淀即可得到As203/PLGA_PEG納米微球。
[0030]2、得到的As203/PLGA-PEG納米微球球形規整，分布均勻(如圖2和圖3所示)。在圖4的PLGA-PEG紅外光譜圖上，1610cm_l處出現了酰胺鍵的特征峰，表明PEG上的氨基與PLGA表面的羧基實現了共價偶聯，表面修飾成功。所得的As203/PLGA-PEG NPs平均粒徑為162.6nm, PDI為0.194 (如圖6所示)，分散性良好。包封率為92.03%，在體外可穩定釋放45天，釋放率達65.42% (如圖9所示)。體外懸浮穩定性較好，4°C冰箱中保存45天無明顯變化(如圖10所示)。
[0031]實施例3:
1、制備負載三氧化二砷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物隱形免疫靶向微球(As2O3/PLGA-PEG-LA NPs)，如圖1 所示:
(1)稱取30mg As2O3溶于ImL質量百分比為4%的氫氧化鈉水溶液中，配成30mg/mL的As2O3溶液，作為水相；
(2)將120mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于4mL三氯甲烷中，作為油相；
(3)取400μ?上述水相在磁力攪拌下緩慢加入到4mL油相中，然后在冰浴下，于180W乳化超聲60s，形成W/0初乳；
(4)將此初乳加入到SmL質量百分比為3%的泊洛沙姆水溶液中，冰浴下，360W乳化超聲90s，形成W/0/W復乳；
(5)將此復乳全部加入到IOOmL質量百分比為0.3%的泊洛沙姆水溶液中，1200rpm下室溫攪拌4h,然后旋轉蒸發30min除去有機溶劑，12000r/min下離心20min,用去離子水洗3次，收集沉淀，冷凍干燥，即可得到As203/PLGA納米微球。
[0032](6 )將IOOmg冷凍干燥過的As203/PLGA納米微球重新分散于50mL蒸餾水中，加入 0.0250mM 的 NHS 活化 lh，然后分別加入 NH2-PEG-NH2 0.0065mM、LA 0.0050mM、EDC
0.0250mM,室溫下，磁力攪拌72h，離心收集沉淀即可得到As203/PLGA-PEG_LA納米微球。
[0033]2、所得的As203/PLGA-PEG-LA納米微球球形規整，分布均勻(如圖2和圖3所示)。
[0034]在圖4的PLGA-PEG-LA紅外光譜圖上，1610cm_l處出現了酰胺鍵的特征峰，表明PEG和LA已通過共價偶聯接枝到了 PLGA的表面，表面修飾成功。所得的As203/PLGA-PEG_LA納米微球的平均粒徑為229.3nm, PDI為0.175 (如圖7所示)，分散性良好。藥物包封率達91.68%，在體外可穩定釋放45天，釋放率達60.59% (如圖9所示)。體外懸浮穩定性較好，4°C冰箱中保存45天無明顯變化(如圖10所示)。
【權利要求】
1.一種三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將As2O3溶于氫氧化鈉水溶液中，配成含As2O3濃度為l(Tl00mg/mL的砷溶液，作為水相； 2)將乳酸-羥基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，作為油相； 3)將水相在磁力攪拌下加入到油相中，然后冰浴乳化超聲，形成W/0初乳； 4)將W/0初乳與第一份泊洛沙姆的水溶液混合，冰浴乳化超聲形成W/0/W復乳； 5)將W/0/W復乳與第二份泊洛沙姆水溶液均勻混合后，蒸發除去有機溶劑，離心收集沉淀、去離子水洗滌，冷凍干燥得載三氧化二砷納米粒； 6)將上述載三氧化二砷納米粒分散于水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺活化后，與雙端氨基聚乙二醇、乳糖酸和1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽在室溫下磁力攪拌反應，離心收集沉淀，即得三氧化二砷隱形免疫靶向抗腫瘤制劑。
2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于步驟I)中，所述氫氧化鈉水溶液的質量百分比為4%。
3.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于步驟2)中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物的濃度為30~50mg/mL。
4.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于步驟3)中，所述水相和油相的混合體積比為1: 10，超聲功率為180W，超聲時間為60s。
5.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于步驟4)中，泊洛沙姆水溶液的質量百分比濃度為3%，超聲功率為360W，超聲時間為90s。``
6.根據權利要求1所述制`備方法，其特征在于步驟5)中，泊洛沙姆水溶液的質量百分比濃度為0.3%，機械攪拌混合，速度為1200rpm。
7.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于步驟6)中，所述載三氧化二砷納米粒、雙端氨基聚乙二醇和乳糖酸的投料摩爾比為1:1.3:1。
【文檔編號】A61K47/34GK103520728SQ201310507359
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月25日 優先權日:2013年10月25日
【發明者】宋曉麗, 尤娟, 王娟, 朱愛萍, 郭榮 申請人:揚州大學