一種隱形熱敏脂質體的制備及其藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用的制作方法

一種隱形熱敏脂質體的制備及其藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種隱形熱敏脂質體藥物轉運系統的制備及其在腫瘤治療藥物中的應用，可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大、治療效果不佳等問題。本發明技術方案是由熱敏脂質體負載靶向熱敏劑和化療藥物構成，其中，靶向熱敏劑和化療藥物的質量比為1:3，其中隱形熱敏脂質體是經羧基化碳納米管的合成、葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸的合成、隱形熱敏脂質體的制備或經羧基化碳納米管的合成、負載化療藥物的碳納米管-賴氨酸的合成、隱形熱敏脂質體的制備而得。本發明物理化學穩定性良好，制備條件簡單可行，原料來源豐富，成本低，副作用小，能有效抑制腫瘤細胞的增殖，從而達到腫瘤靶向治療的作用，是腫瘤靶向治療中藥物載體上的創新。
【專利說明】一種隱形熱敏脂質體的制備及其藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物領域，特別是一種隱形熱敏脂質體的制備及其藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用。【背景技術】
[0002]隱形熱敏脂質體是一種物理化學和主動靶向的藥物轉運載體。在正常體溫下，親水性藥物很難透過脂質體膜而擴散出來，而當脂質體隨血液循環經過被加熱的靶器官時，局部的高溫可促使藥物在靶部位釋放并形成較高的藥物濃度；隱形熱敏脂質體具有良好的載藥性、靶向性以及生物相容性而成為生物醫藥領域中的研究熱點，目前已報道熱敏脂質體局部加熱方法有水浴法、微波法、射頻法等。
[0003]單壁或多壁碳納米管，石墨烯，納米金具有巨大的比表面積(~2600m2/g)、較高的近紅外產熱能力、獨特的跨膜能力以及大離域n鍵等特性，已廣泛應用于生物醫藥領域。碳納米管可以有效攜帶蛋白質、抗體、多肽、藥物和核酸等生物活性物質進入細胞，從而成為人們關注的載體。碳納米管對700~IlOOnm范圍的近紅外光具有高吸收特性，同時生物系統對此范圍的近紅外光具有高度透過性，因此可利用碳納米管的光熱轉換特性對腫瘤進行激光熱療。碳納米管是藥物轉運載體，同時也是發揮熱療效應的主體，可作為化療藥物增敏劑和靶向熱敏劑。但碳納米管不溶于水和有機溶劑，且在溶液中易聚集成束，難以分散，嚴重影響其應用。
[0004]DPPC ( 二棕櫚酰磷脂酰膽堿)，C40H80NO8P,分子量734.04,相變溫度41_42°C，可作為熱敏脂質體制備的主要材料，當溫度達到其相變溫度時就可引起熱敏脂質體迅速釋放內含藥物，實現靶向治療；DSPE-PEG2000 (二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)具有良好的親水性和柔韌性，可延長藥物載體在體內的循環時間。
[0005]目前，通過隱形熱敏脂質體負載靶向熱敏劑(如碳納米管)和化療藥物形成藥物轉運系統，特別是在腫瘤治療藥物中的應用尚未見有報道。

【發明內容】

[0006]針對上述情況，克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種隱形熱敏脂質體藥物轉運系統的制備方法及其在腫瘤治療藥物中的應用，可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大、治療效果不佳等問題。
[0007]本發明解決的技術方案是，由隱形熱敏脂質體負載靶向熱敏劑和化療藥物構成，其中，靶向熱敏劑和化療藥物的質量比為1: 3，所述的靶向熱敏劑為單壁碳納米管及其衍生物、多壁碳納米管及其衍生物、石墨烯及其衍生物、納米金及其衍生物、納米銀及其衍生物、有機聚合物的一種；所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、鹽酸表阿霉素、柔紅霉素、鹽酸米托蒽醌、多西紫杉醇、紫杉醇、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、5-氟尿嘧啶、長春瑞濱、洛莫司汀、卡莫司汀、地西他賓、甲氨蝶呤、羥基喜樹堿、小核酸類寡義反核苷酸和小干擾RNA的一種或兩種以上的組合物。
[0008]所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，由以下步驟實現:
[0009](I)羧基化碳納米管的合成:取95~IlOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL的混酸，11~13mL質量濃度30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管(CNTs-COOH);所述混酸為濃硫酸與濃硝酸以體積比3:I所組成的混合酸；
[0010](2)葉酸祀向的碳納米管-賴氨酸的合成:取羧基化的碳納米管45~55mg,加入25mL0.1~0.3M的賴氨酸溶液,再加入葉酸9~IImg, 45~55mgl_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCDd~Ilmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDC ?此1、順3、葉酸和賴氨酸，在601:下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸(FA-Lys/CNTs)；
[0011](3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取45~55mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，1~3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)及18~22mg的膽固醇，置于IOOmL爺形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解,再加入5mL PBS溶液,超聲乳化40min,形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min),于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體；所述的PBS溶液為IOmg葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS (pH7.4)形成的溶液。
[0012]也可由以下步驟實現:
[0013](I)羧基化碳納米管的合成:取95~IlOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL混酸，11~13mL質量濃度30%過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 y m微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管(CNTs-COOH);所述混酸為濃硫酸與濃硝酸以體積比3:
I所組成的混合酸；
[0014](2)負載化療藥物的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化碳納米管45~55mg,加入25mL0.1~0.3M賴氨酸溶液，45~55mgl_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和9~Ilmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDC-HC1.NHS和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸(Lys/CNTs);再稱取9~Ilmg碳納米管-賴氨酸,加入IOmL超純水,超聲至全溶,再加入18~22mg化療藥物，超聲4h，于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載藥物的碳納米管-賴氨酸；
[0015](3)隱形熱敏脂質體的制備:取45~55mg的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC), I~3mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)及18~22mg的膽固醇，置于IOOmL爺形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解,再加入5mL PBS溶液,超聲乳化40min,形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min),于透析袋中透析48h，得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載化療藥物的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS (pH7.4)形成的溶液。
[0016]所述隱形熱敏脂質體藥物轉運系統，可以用于靜脈注射、肌肉注射、瘤內注射和皮下注射、透皮給藥、體內植入。
[0017]本發明的隱形熱敏脂質體負載靶向熱敏劑(如碳納米管)和化療藥物，靶向熱敏劑能夠負載難溶性化療藥物，具有強光熱轉換特性和產生活性氧能力，還具有腫瘤靶向性的特點，在腫瘤部位進行激光照射，利用熱敏劑在激光照射下產熱導致熱敏材料的熱敏感性使藥物轉運系統定位釋放藥物，從而達到腫瘤靶向治療的作用；本發明體物理化學穩定性良好，制備條件簡單可行，原料來源豐富，成本低，副作用小，能有效抑制腫瘤細胞的增殖，是腫瘤靶向治療中藥物載體上的創新。
【具體實施方式】
[0018]以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0019]實施例1[0020]本發明制備方法在具體實施中，可由以下步驟實現:
[0021](I)羧基化碳納米管的合成:稱取IOOmg碳納米管，放入250mL圓底燒瓶中，加入120mL的混酸，12mL質量濃度30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管(CNTs-COOH);所述混酸為濃硫酸與濃硝酸以體積比3: I所組成的混合酸；
[0022](2)葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化的碳納米管50mg，加入25mL0.2M的賴氨酸溶液，再加入葉酸10mg，50mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC ? HCl)，IOmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDC ? HCl、NHS、葉酸和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸(FA-Lys/CNTs)；
[0023](3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取50mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，2mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)及20mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min)，于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體；所述的PBS溶液為IOmg葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mLPBS (pH7.4)形成的溶液。
[0024]實施例2
[0025]本發明制備方法在具體實施中，也可由以下步驟實現:
[0026](I)羧基化碳納米管的合成:稱取105mg碳納米管，放入250mL圓底燒瓶中，加入120mL的混酸，13mL質量濃度30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管(CNTs-COOH)；
[0027](2)葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化的碳納米管53mg，加入25mL0.2M的賴氨酸溶液，再加入葉酸llmg，53mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC ? HCl)，llmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDC ? HCl、NHS、葉酸和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸(FA-Lys/CNTs)；
[0028](3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取53mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，3mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)及22mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min),于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體；所述的PBS溶液為IOmg葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mLPBS (pH7.4)形成的溶液。
[0029]實施例3
[0030]本發明制備方法在具體實施中，可由以下步驟實現: [0031](I)羧基化碳納米管的合成:稱取IOOmg碳納米管，放入250mL圓底燒瓶中，加入120mL混酸，12mL質量濃度30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管(CNTs-COOH)；
[0032](2)負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化碳納米管50mg，加入25mL0.2M賴氨酸溶液，50mgl-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC ? HCl)和IOmg N-羥基琥拍酰亞胺(NHS),置于燒瓶中，超聲分散2h后,在冰浴下，以100r/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDC -HC1.NHS和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸(Lys/CNTs);再稱取IOmg碳納米管-賴氨酸，加入IOmL超純水，超聲至全溶，再加入20mg鹽酸阿霉素，超聲4h，于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸(Lys/CNTs-DOX)；
[0033](3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取50mg的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，2mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)及20mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液,超聲乳化40min,形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min)，于透析袋中透析48h，得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mLPBS (pH7.4)形成的溶液。
[0034]實施例4
[0035]本發明制備方法在具體實施中，也可由以下步驟實現:
[0036](I)羧基化碳納米管的合成:稱取105mg碳納米管，放入250mL圓底燒瓶中，加入120mL混酸，13mL質量濃度30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管(CNTs-COOH)；
[0037](2)負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化碳納米管53mg，加入25mL0.15M賴氨酸溶液，53mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)和llmg N-羥基琥拍酰亞胺(NHS),置于燒瓶中，超聲分散2h后,在冰浴下，以100r/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的EDOHCl、NHS和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸(Lys/CNTs);再稱取IOmg碳納米管-賴氨酸，加入IOmL超純水，超聲至全溶，再加入22mg多西紫杉醇，超聲4h，于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸(Lys/CNTs-DOC)；
[0038](3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取53mg的DPPC，2mg的DSPE-PEG2000及22mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，探超(200W，2min)，于透析袋中透析48h，得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS (pH7.4)形成的溶液。
[0039]本發明的隱形熱敏脂質體的制備方法及其藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用分為體外和體內兩部分:
[0040](I)體內:將本發明的隱形熱敏脂質體藥物轉運系統加入到癌細胞中進行培養，給藥3h后用780~IlOOnm波長的寬波長光源或者808nm激光光照，光照時間I~5min，繼續培養24h，測定癌細胞的存活率。
[0041]上述癌細胞為:器官表面或者內部出現的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。
[0042](2)體外:將本發明的隱形熱敏脂質體藥物轉運系統靜脈注射到荷瘤小鼠體內，給藥3h后用780~IlOOnm波長的寬波長光源或者808nm激光光照，光照時間為I~5min，測量荷瘤小鼠的腫瘤體積大小。
[0043]上述荷瘤小鼠為:器官表面或者內部出現的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。
[0044]本發明新型靶向熱敏增敏劑介導的隱形熱敏脂質體作為熱敏劑可制成多種藥物劑型，如注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發明的制劑可加入各種制劑添加劑，如生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等。給藥方式可為靜脈注射、肌肉注射、瘤內注射和皮下注射、透皮給藥、體內植入方式等。
[0045]相關試驗資料如下:
[0046]—、使用光照射本發明隱形熱敏脂質體藥物轉運系統對腫瘤細胞生長活性的測定。
[0047]通過光照射藥物轉運系統在體外抗腫瘤活性實驗:將MCF-7乳腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將MCF-7細胞培養在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養基中，培養箱條件為37°C、5%C02，每2~3天傳代一次。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 iil，鋪板使待測細胞調密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5%C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12.5、25、50、100ii g/ml)的實施例1中的隱形熱敏脂質體，設置復孔為4~6個。光照組放置在808nm近紅外光2W中2min，保持光照過程中溫度在37°C，光照結束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養箱中孵育24h，對于無光照組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養箱中孵育24h，終止培養，吸出含藥培養基，每孔用150 u I PBS洗2遍，加入預冷的10%TCA200iil，4°C放置lh。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 ill的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結合的SRB用150 u 110mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在808nm處測定每孔的OD值。存活率的計算公式:存活率=實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值。
[0048]實驗證明，當用光照射2min，本發明藥物轉運系統的加入直接影響MCF-7細胞的增殖。二、光照射時，本發明隱形熱敏脂質體藥物轉運系統體內抗腫瘤活性測定。
[0049]取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂養7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中36只腫瘤體積≥IOOmm3昆明小鼠，隨機分為6組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(生理鹽水組);(2)生理鹽水激光組；(3)藥物溶液組；(4)藥物溶液激光組；(5)制劑組；(6)制劑激光組。6組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為808nm近紅外光源，功率為2W，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時間為2min。每2d給藥一次，每次注射生理鹽水或者藥物溶液或者lmg/ml的制劑溶液200 U 1，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態，每2d稱其體重并使用游標卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑
(B)，按公式腫瘤體積計算腫瘤體積。

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[0050]實驗證明，在光照射下給藥本發明的隱形熱敏脂質體，可以明顯抑制小鼠腫瘤體積的增加。
[0051]三、本發明的隱形熱敏脂質體藥物轉運系統載藥量的測定。
[0052]取本發明的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統，通過加入40倍甲醇提取給藥系統中包封的鹽酸阿霉素，紫外分光光度計測定載藥量為1.85mg/mL，表明本發明的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體可以作為抗腫瘤藥物的載體。
[0053]四、本發明的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的粒子大小和表面帶電量的確定。
[0054]本發明中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的粒子大小和表面帶電量的確定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設置為1.590，吸收系數設置為
0.010，溫度設置為25°C，測量模式設置為自動，以Z平均統計值作為測定結果。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結果。介電常數設置為79，黏度系數設置為0.8872，溫度設置為25°C，測量模式設置為自動。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結果。測得的結果是粒徑為100~200nm,電位是 _40mV。
[0055]五、本發明中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的體外抗腫瘤活性。
[0056]本發明中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的體外抗腫瘤活性，將MCF-7乳腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將MCF-7細胞培養在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養基中培養箱條件為37°C、5%C02，每2~3天傳代一次。收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 u 1，鋪板使待測細胞調密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5%C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、l、2、4、6、8iig/ml)的實施例1中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體，不加入實施例1中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體為對照組，設置復孔為4~6個。光照組放置在808nm近紅外光2W中2min，保持光照過程中溫度在37°C，光照結束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養箱中孵育24h，對于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于C02培養箱中孵育24h，終止培養，吸出含藥培養基，每孔用150 u I PBS洗2遍，加入預冷的10%TCA200 u 1，4°C放置lh。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 ill的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結合的SRB用150 ill 10mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測定每孔的OD值。抑制率的計算公式:抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值 。
[0057]實驗證明，本發明的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體作為藥物載體時能裝載藥物進入腫瘤細胞內部，更好地發揮抗腫瘤藥物的療效，而且結合光照后，能夠更明顯抑制腫瘤細胞的增殖。六、本發明中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的體內抗腫瘤活性。
[0058]本發明中的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體給藥系統的體內抗腫瘤活性，取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂養7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2 X IO6個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中24只腫瘤體積≥IOOmm3昆明小鼠，隨機分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(生理鹽水組)；
(2)鹽酸阿霉素注射液組；(3)隱形熱敏脂質體組；(4)隱形熱敏脂質體激光組。鹽酸阿霉素注射液組、鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體組和鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體光照組的鹽酸阿霉素給藥劑量相等，均為10.125mg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為808nm近紅外光源，功率為2W，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時間為2min。每2d給藥一次，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態，每2d稱其體重并使用
游標卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體積-計算腫瘤體積。
[0059]當給藥予本發明的鹽酸阿霉素隱形熱敏脂質體后，小鼠腫瘤體積的增加比鹽酸阿霉素注射液得到明顯的抑制，結合激光照射時，小鼠腫瘤體積的增加得到更加明顯的抑制。
[0060]同時，還采用了其他光源以及抗腫瘤藥物做了類似的實驗，均取得了相同和相類似的結果，本發明分組科學，方法穩定可靠。
[0061]有益技術效果:
[0062](I)本發明隱形熱敏脂質體不會對碳納米管本身的特性進行破壞，其水分散性強，對生物體的毒性很低，物理以及化學穩定性良好，質量好，制備條件簡單可行，原料來源豐富，成本低。
[0063](2)本發明隱形熱敏脂質體可以作為腫瘤熱敏治療的一種良好的熱敏劑，實驗表明無論是體外還是體內，結合光照的情況下均可以明顯抑制腫瘤細胞以及組織的發生和發展；而在無光照的情況下，本發明對正常細胞以及組織毒副作用很小，可以根據光的聚焦等手段來選擇性的殺傷腫瘤組織和細胞。
[0064](3)本發明隱形熱敏脂質體可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，具有毒性極小，水溶性較強，生物相容性好，比表面積大，化學惰性，具有緩釋性和靶向性，且結合激光照射可發揮更好的抗腫瘤效果 。
【權利要求】
1.一種隱形熱敏脂質體的藥物轉運系統，其特征在于，由隱形熱敏脂質體負載靶向熱敏劑和化療藥物構成，其中，靶向熱敏劑和化療藥物的質量比為1:3，所述的靶向熱敏劑為單壁碳納米管及其衍生物、多壁碳納米管及其衍生物、石墨烯及其衍生物、納米金及其衍生物、納米銀及其衍生物、有機聚合物的一種；所述的化療藥物為鹽酸阿霉素、鹽酸表阿霉素、柔紅霉素、鹽酸米托蒽醌、多西紫杉醇、紫杉醇、順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、5-氟尿嘧啶、長春瑞濱、洛莫司汀、卡莫司汀、地西他賓、甲氨蝶呤、羥基喜樹堿、小核酸類寡義反核苷酸和小干擾RNA的一種或兩種以上的組合物。
2.根據權利要求1所述的隱形熱敏脂質體的藥物轉運系統，其特征在于，該系統的粒徑為100~200醒。
3.權利要求1所述的一種隱形熱敏脂質體的藥物轉運系統在腫瘤治療藥物中的應用。
4.權利要求1所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)羧基化碳納米管的合成:取95~IIOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL的混酸，11~13mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 y m微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管；所述混酸為濃硫酸與濃硝酸以體積比3: I所組成的混合酸； (2)葉酸祀向的碳納米管-賴氨酸的合成:取羧基化的碳納米管45~55mg,加入25mL0.1~0.3M的賴氨酸溶液,再加入9~Ilmg葉酸,45~55mg 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，9~Ilmg N-羥基琥珀酰亞胺，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、葉酸和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸； (3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取45~55mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，f 3mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及18~22mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體；所述的PBS溶液為IOmg葉酸祀向的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
5.根據權利要求4所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)羧基化碳納米管的合成:取IOOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL的混酸，12mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管； (2)葉酸祀向的碳納米管-賴氨酸的合成:取羧基化的碳納米管50mg,加入25mL0.2M的賴氨酸溶液，再加入IOmg葉酸,50mg 1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，IOmg N-羥基琥拍酰亞胺,置于燒瓶中，超聲分散2h后,在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、葉酸和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸；(3)隱形熱敏脂質體的制備:取50mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿，2mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及20mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體。
6.根據權利要求4所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)羧基化碳納米管的合成:取105mg碳納米管,放入250mL燒瓶中，加入12OmL的混酸，13mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化的碳納米管； (2)葉酸祀向的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化的碳納米管53mg,加入25mL0.2M的賴氨酸溶液，再加入Ilmg葉酸，53mg 1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，Ilmg N-羥基琥拍酰亞胺,置于燒瓶中，超聲分散2h后,在冰浴下，以100r/min攪拌24h使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、葉酸和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得葉酸靶向的碳納米管-賴氨酸； (3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取53mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，3mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及22mg的膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h后，得隱形熱敏脂質體。
7.權利要求1所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)羧基化碳納米管的合成:取95~IlOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL混酸，11~13mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 y m微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管；所述混酸為濃硫酸與濃硝酸以體積比3: I所組成的混合酸； (2)負載化療藥物的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化碳納米管45~55mg,加入25mL 0.1~0.3M賴氨酸溶液，45~55mg 1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和9~Ilmg N-羥基琥拍酰亞胺,置于燒瓶中，超聲分散2h后,在冰浴下，以100r/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸；再稱取9~I Img碳納米管-賴氨酸，加入IOmL超純水，超聲至全溶，再加入18~22mg化療藥物，超聲4h，于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載藥物的碳納米管-賴氨酸； (3)隱形熱敏脂質體的制備:取45~55mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，f 3mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及18~22mg膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min,于透析袋中透析48h,得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載化療藥物的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
8.根據權利要求7所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現:(1)羧基化碳納米管的合成:取IOOmg碳納米管，放入250mL燒瓶中，加入120mL混酸，12mL質量濃度為30%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用·0.22 微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管； (2)負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸的合成:取羧基化碳納米管50mg,加入25mL·0.2M賴氨酸溶液，50mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和IOmg N-羥基琥珀酰亞胺，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以100r/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸；再取IOmg碳納米管-賴氨酸，加入IOmL超純水,超聲至全溶,再加入20mg鹽酸阿霉素,超聲4h,于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸； (3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取50mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，2mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及20mg膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h，得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載鹽酸阿霉素的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
9.根據權利要求7所述的隱形熱敏脂質體的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現: (1)羧基化碳納米管的合成:取105mg碳納米管,放入250mL圓底燒瓶中，加入120mL混酸，13mL質量濃度為3 0%的過氧化氫溶液，于超聲波清洗器超聲Ih后，加入IL超純水稀釋，用0.22 y m微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，用超純水沖洗至pH為中性，放入烘箱中80°C恒溫干燥，得羧基化碳納米管； (2)負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸的合成:稱取羧基化碳納米管53mg，加入25mL·0.15M賴氨酸溶液，53mg 1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和Ilmg N-羥基琥珀酰亞胺，置于燒瓶中，超聲分散2h后，在冰浴下，以lOOr/min攪拌24h，使其充分反應，反應結束后于透析袋中透析48h，除去未反應的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和賴氨酸，在60°C下真空干燥24h，得碳納米管-賴氨酸；再稱取IOmg碳納米管-賴氨酸,加入IOmL超純水,超聲至全溶,再加入22mg多西紫杉醇，超聲4h，于透析袋中透析24h，除去游離的藥物，得負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸； (3)隱形熱敏脂質體的制備:稱取53mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，3mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000及22mg膽固醇，置于IOOmL茄形燒瓶中，加入乙醚使完全溶解，再加入5mL PBS溶液，超聲乳化40min，形成穩定的0/W型乳劑，在45°C減壓旋轉下除去乙醚，200W探超2min，于透析袋中透析48h，得隱形熱敏脂質體；所述PBS溶液為IOmg負載多西紫杉醇的碳納米管-賴氨酸和6mg鹽酸阿霉素溶于5mL PBS、pH7.4形成的溶液。
【文檔編號】A61K31/337GK103520726SQ201310494933
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】祝俠麗, 張振中, 謝瑩霞, 黃勝楠, 侯琳, 張慧娟, 王蕾, 史進進, 張英杰, 黃河清 申請人:鄭州大學