Sdf-1結合性核酸的制作方法

Sdf-1結合性核酸的制作方法
【專利摘要】本發明涉及核酸分子，優選SDF-1結合性核酸分子，其選自A型核酸分子、B型核酸分子、C型核酸分子和具有SEQ.ID.No.142、SEQ.ID.No.143和SEQ.ID.No.144所示任一核酸序列的核酸分子。
【專利說明】SDF-1結合性核酸
【技術領域】
[0001]本發明涉及結合CXC趨化因子基質細胞衍生因子I (SDF-1)的核酸，及其在藥物制備中的用途及其在診斷劑制備中的用途。
【背景技術】
[0002]趨化因子是一個8_14kDa的結構相關、結合肝素的堿性小蛋白質的家族。可將其功能分為促炎功能、內環境穩定功能或雙重功能(Moser，Wolf et al.2004)。炎性趨化因子受病原體、細胞因子或生長因子誘導，并將效應白細胞募集到感染、炎癥、組織損傷和腫瘤部位。所述趨化因子調控白血球細胞(白細胞)的募集、活化和增生(Schall and Bacon1994; Springer 1995;Baggiolini 1998)。趨化因子選擇性誘導嗜中性粒細胞、嗜酸細胞、嗜堿細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、T細胞和B細胞的趨化性。除趨化效應之外，其還可在應答細胞中選擇性發揮其他作用，如改變細胞形狀，瞬時升高胞內游離鈣離子濃度，去粒，上調整聯蛋白，形成生物活性脂質(白三烯、前列腺素、血栓烷)，或呼吸爆發(通過釋放活性氧而破壞致病微生物或腫瘤細胞)。因此，趨化因子通過激發其他促炎介質的釋放及白細胞向感染或炎癥灶的趨化和外滲來引發炎性應答的逐步升級。而另一方面，內環境穩定趨化因子(homeostatic chemokine)主要在骨髓和淋巴樣組織組織中表達,且參與血細胞生成、免疫監督和適應性免疫應答(Godessart 2005)。
[0003]根據四個保守半胱氨酸殘基中前兩個的排列方式將趨化因子分成四類:CC或β-趨化因子(例如其中所述半胱氨酸串聯)，CXC或α-趨化因子(其中所述半胱氨酸被一個額外的氨基酸殘基隔開)，XC或Y趨化因子(只具有一個二硫橋)(是迄今為止淋巴細胞趨化因子/XCLl的唯一代表)及CX3C-趨化因子(以在所述半胱氨酸間有3個氨基酸殘基為特征)(僅一個成員，膜結合的 CXXXC 趨化因子(fractalkin)) (Bazan, Bacon et al.1997)。
[0004]CXC趨化因子(尤其是在其氨基末端帶有氨基酸序列ELR的CXC趨化因子)主要作用于嗜中性粒細胞。對嗜中性粒`細胞具有活性的CXC趨化因子的實例是IL-8/CXCL8、GROa /CXCLU GRO β /CXCL2 和 GRO Y/CXCL3、NAP-2/CXCL7、ENA-78/CXCL5、SDF-1/CXCL12和GCP-2/CXCL6。CC趨化因子作用于更多種類的白細胞，如單核細胞、巨噬細胞、嗜酸細胞、嗜喊細胞及 T 和 B 淋巴細胞(Oppenheim, Zachariae et al.1991 ;Miller and Krangel1992;Baggiolini, Dewald et al.1994;Jose, Griffiths-Johnson et al.1994;Ponath, Qinet al.1996)。所述趨化因子的實例是 1-309/CCLl、MCP-l/CCL2、MCP-2/CCL8、MCP_3/CCL7、MCP-4/CCL13、MIP-1 a /CCL3 和 ΜΙΡ-1 β /CCL4、RANTES/CCL5 和嗜酸細胞活化趨化因子 /CCLl I。
[0005]趨化因子通過屬于七跨膜G蛋白偶聯受體(GPCRs ; (Murphy, Baggiolini etal.2000)超家族的受體起作用。一般而言，趨化因子和趨化因子受體的相互作用是趨于混雜的，因為一個趨化因子可結合許多趨化因子受體，而反過來，單個趨化因子受體也可與幾種趨化因子相互作用。一些已知的CXC趨化因子的受體包括CXCRl (結合GRO a、GCP-2和IL-8)、CXCR2 (結合包括 GROa、GR0P ,GROy ,ENA-78 和 IL-8 在內的趨化因子)、CXCR3 (結合包括PF4、MIG、IP-1O和1-TAC在內的趨化因子)、CXCR4 (迄今為止發現的唯一響應SDF-1而產生信號的CC趨化因子受體)和CXCR5 (已發現響應BCA-1而產生信號)(Godessart2005)。
[0006]SDF-1 (基質細胞衍生因子-1 ;別名為CXCL12 ；PBSF [前B細胞生長刺激因子]；TPAR-1 [TPA抑制基因I] ；SCYB12 ；TLSF[胸腺淋巴細胞刺激因子]；hIRH[肝細胞瘤中減少的人內泌素(intercrine)])是不包含IL-8樣趨化因子特有的ELR基序(Salcedo, Wasserman 等人 1999 ;Salcedo 和 Oppenheim 2003)的、結合并激活 G 蛋白偶聯受體CXCR4的血管生長CXC趨化因子。三個研究小組，通過基于當所述趨化因子被基質細胞系PA6表達時刺激早期祖B細胞的能力(Nagasawa, Kikutani等人1994)克隆帶有N末端信號序列的cDNA (Tashiro, Tada等人1993),或通過從cDNA文庫(從用蛋白質激酶C激活物四十二烷酰巴豆醇乙酸酯(TPA)處理的小鼠胚胎成纖維細胞構建的cDNA文庫)分離所述趨化因子(Jiang，Zhou等人1994)，各自獨立地發現了所述趨化因子。
[0007]作為可變剪接的結果，存在兩種形式的在C末端帶有4個額外殘基的SDF-1, SDF-1 α (68 個氨基酸)和 SDF-1 β (Shirozu, Nakano 等人 1995)。尚不完全清楚這兩種剪接變體的生物學意義。
[0008]來自不同物種的SDF-1之間的序列保守性是顯著的--人SDF-1 a (SEQ.1D.1)和鼠SDF-1 a (SEQ.1D.2)實際上相同。僅存在第18位氨基酸由V到I的單個保守改變(Shirozu, Nakano et al.1995)。區分SDF-1與大多數其他趨化因子的另一個罕見特征是其選擇性。事實上，SDF-1與其受體CXCR4似乎包含單配受體-配體對。
[0009]存在SDF-1 [8-68]的 NMR 結構模型(PDB access, 1SDF)。發現 SDF-1 是具有無序N末端區域的單體。與其他趨化因子的差異主要見于疏水核心的包裹和表面電荷分布(Crump, Gong et al.1997)。
[0010]SDF-1的生理活性:因 為SDF-1受體CXCR4在白細胞、成熟內皮細胞、內皮細胞、腦細胞和巨核細胞中廣泛表達，所以SDF-1的活性是多效的。所述趨化因子相比迄今已鑒定的任何其他趨化因子，尤其在免疫系統外，表現出最廣泛的生物學功能。SDF-1的最重要的功能效應是:
[0011]將上皮細胞復位(homing)并附著于視網膜的脈絡膜部分的新生血管位點已顯示SDF-1在眼組織的新生血管形成過程中參與將上皮細胞復位到脈絡膜。對所述細胞的確切作用尚處于研究階段，但有假說認為上皮細胞參與迷行血管形成(Sengupta，Caballero etal.2005)。
[0012]造血作用
[0013]成人骨髓中需要有SDF-1來維持造血祖細胞(⑶34+)。可將AMD3100(—種選擇性CXCR4拮抗劑)用于造血干細胞移植中的CD34+細胞動員。CD34+細胞在體外和體內沿著由基質細胞產生的SDF-1梯度遷移(Aiuti，Webb et al.1997)。
[0014]B細胞發育和趨化
[0015]SDF-1支持前B細胞增生，且促進骨髓祖B細胞生長(Nagasawa, Kikutani etal.1994);其在不作為成熟B細胞的有效趨化劑的情況下誘導前B細胞和祖B細胞(pro_Bcell)的特定遷移，(D' Apuzzo, Rolink et al.1997;Bleul, Schultze et al.1998)。推測SDF-1在將B細胞定位于次生淋巴組織的過程中發揮重要作用。[0016]T細胞趨化
[0017]SDF-1是最有效的T細胞趨化劑之一 ；CXCR4存在于多種T細胞亞群上(Bleul,Farzan et al.1996)。
[0018]胚胎發育
[0019]SDF-1及其受體CXCR4在胚胎發育過程中必不可少。敲除SDF-1和CXCR4基因的小鼠將死于圍產期；除發生B細胞和骨髓組細胞數減少外，還表現出心臟室間隔缺損或異常小腦發育(Nagasawa，Hirota et al.1996;Ma, Jones et al.1998;Zouj Kottmann etal.1998)。胚胎發生期間的血液發育的正常個體發生過程中也需要SDF-1 (Juarez andBendall 2004)。
[0020]HIV 感染
[0021]SDF-1能抑制T細胞嗜性HIV-1進入具有CXCR4的細胞系，且SDF-1的表達可在輔助AIDS發病中發揮重要作用，因為人SDF-1基因的多態性影響AIDS的發病(Bleul，Farzanet al.1996)0
[0022]SDF-1或其受體CXCR4的表達水平變化或對所述分子的應答變化與許多人類疾病相關，所述人類疾病例如視網膜病(Brooks，Caballero et al.2004; Butler, Guthrie etal.2005;Melethj Agron et al.2005);乳腺癌(Muller，Homey et al.2001; Cabiogluj Sahinet al.2005)、卵巢癌(Scotton，Wilson et al.2002)、膜腺癌(Koshiba，Hosotani etal.2000)、甲狀腺癌(Hwang，Chung et al.2003)、鼻咽癌(Wang，Wu et al.2005);神經膠質瘤(Zhou, Larsen et a l.2002);成神經細胞瘤(Geminderj Sag1-Assif et al.2001) ；B 細胞慢性淋巴細胞白血病(Burger，Tsukada et al.2000) ;WHIM綜合征(撫、低丙種球蛋白血癥、感染、先天性骨髓粒細胞缺乏癥XGulino，Moratto et al.2004;Balabanianj Lagane etal.2005;Kawaij Choi et al.2005);免疫缺陷綜合征(Arya，Ginsberg et al.1999;Marechal, Arenzana-Seisdedos et al.1999; Soriano, Martinez et al.2002);病理性新生血管形成(Salvucci，Yao et al.2002; Yamaguchij Kusano et al.2003;Grunewaldj Avraham etal.2006);炎癥(Murdoch 2000;Fedykj Jones et al.2001; Wang, Guan et al.2001);多發性硬化癥(KrumbhoIz，Theil et al.2006);類風濕性關節炎/骨關節炎(Buckley，Amft etal.2000;Kanbe，Takagishi et al.2002;Grassij Cristino et al.2004)。
[0023]已在實驗動物中證明，SDF-1或其受體的拮抗劑可有效阻斷不同來源的人癌細胞的生長和/或轉移擴散，所述不同來源的人癌細胞例如來源于胰腺(Guleng，Tateishiet al.2005;Saurj Seidler et al.2005)、結腸(Zeelenberg，Ruuls-Van Stalle etal.2003;Guleng, Tateishi et al.2005)、乳腺(Muller，Homey et al.2001; Lapteva, Yanget al.2005)、肺(Phillips，Burdick et al.2003)、成膠質細胞瘤 / 成髓細胞瘤(Rubin，Kung et al.2003)、前列腺(Sun，Schneider et al.2005)、骨肉瘤(Perissinotto, Cavalloni et al.2005)、黑素瘤(Takenaga，Tamamura et al.2004)、胃(Yasumoto, Koizumi et al.2006)、多發性骨髓瘤(Menu, Asosingh et al.2006)的人癌細胞。
[0024]此外，抗SDF-1療法在動物模型中的視網膜新生血管形成(Bu11 er，Guthr i eet al.2005)、腎炎(Balabanian，Couderc et al.2003)和關節炎(Matthys，Hatse etal.2001; Tamamuraj Fujisawa et al.2004;De Klerckj Geboes et al.2005)的預防中發揮有益作用。
[0025]SDF-1參與眼后部疾病(back-of-the-eye disease)(例如糖尿病性視網膜病(DR)(Fong, Aiello et al.2004)和老年黃斑變性(AMD) (Ambati, Anand et al.2003))的病理過程。這兩種疾病均損傷眼睛，并導致視力逐漸衰退至失明。所述損傷由眼后部的不當血管生長(此過程被稱為脈絡膜新生血管形成(CNV))所致。在CNV過程中，源于脈絡膜的新血管通過布魯赫膜(Bruch membrane )中的斷裂處遷移進入視網膜下色素上皮(sub-RPE )或視網膜下間隙。所述異常血管可在視網膜下出血(視網膜內出血)或滲漏液體。這可留下傷疤，并可使斑增多，從而扭曲視覺。
[0026]SDF-1被認為在CNV中通過將內皮前體細胞(EPC)募集至眼而發揮作用。然后這些前體細胞會在迷行血管中成為關鍵的結構組分。
[0027]糖尿病性視網膜病是糖尿病的主要后遺癥，經常在患有I型和2型糖尿病的患者中發病。美國有約I千6百萬糖尿病患者，其中的近8百萬患有一些形式的糖尿病性視網膜病。如果不治療增生型糖尿病性視網膜病(PDR)，則約60%的患者會在5年內單眼或雙眼失明。隨著糖尿病在北美、歐洲和許多新興國家令人擔憂地日益普遍，患者群體也快速增長。例如，糖尿病患者中失明的發生率比普通人群高25倍。此外，糖尿病性視網膜病(DR)是中年受試者中最常見的失明病因，每年占美國所有新病例的至少12%。可通過配制篩選程序來監測糖尿病患者的視力，從而可及時提供如可獲得的治療。
[0028]對糖尿病性視網膜病的直接原因尚知之甚少，但該病被人由下列多個成因的組合所致:視網膜血流自調節受損；視網膜細胞內山梨醇蓄積和細胞外液中高級糖基化終產物蓄積。所有這些因素直接或間接與高血糖癥、血流中的糖豐度相關。
[0029]DR癥狀與AMD癥狀相似。患者損失視網膜細胞，在視網膜基底膜中發生微動脈瘤(血流)。此外，VEGF, IGF-1及其他血液因子(可能包括SDF-1)吸引新血管細胞，并促進損壞血管的形成。
`[0030]老年黃斑變性(AMD)破壞人的中央視覺。疾病的早期癥狀不明顯，因為癥狀隨患者而異。有時患者僅單眼受到影響。或雙眼視力均減退，但不顯著。疾病導致色覺失真或出錯。在視野中央常有黑斑。
[0031]對所述疾病的發病機理(發病過程)尚知之甚少。通常認為AMD是視網膜最外層的老化。在視網膜中央發生生理變化(也被稱為斑)其為最敏銳視覺所依賴的視網膜部分。
[0032]濕性AMD始于所述疾病的干性形式的后遺癥。約90%的患者患干性AMD，其導致斑組織變薄和色素沉積紊亂。其余患有所述濕性形式，包括上述出血。
[0033]所述濕性AMD代表著新型治療劑的理想市場:已為55歲以上的人失明的最常見原因，AMD使據估計4%-5%的65-74歲的美國人群和近10%的75歲或更老人群遭受痛苦。僅在美國就已有5百萬患有所述疾病的80歲以上的人，且還有另外5百萬人預期在2020年前受其影響。
[0034]腫瘤不僅僅是癌細胞聚集塊:腫瘤被免疫細胞浸潤是癌癥的特征。許多人類癌癥具有影響所述浸潤的程度和表型及腫瘤生長、存活和遷移及血管發生的復雜的趨化因子網絡。大多數實體瘤包含許多非惡性基質細胞。事實上，有時基質細胞比癌細胞多。癌癥中發現的占優勢的基質細胞是巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和成纖維細胞。
[0035]來自不同癌癥類型的惡性細胞具有不同的趨化因子受體表達譜，但所述SDF-1受體CXCR4最常見于小鼠和人:來自至少23個不同類型的人上皮、間充質細胞和造血來源的癌癥的腫瘤細胞表達CXCR4 (Balkwill 2004)。SDF-1是CXCR4的唯一已知配體。SDF-1除在骨髓和次生淋巴組織中組成型表達外，其還可見于淋巴瘤的原發性腫瘤(Corcione, Ottonello et al.2000)及神經元和星形細胞系的腦腫瘤中。此外，其以高水平存在于卵巢(Scotton, Wilson et al.2002)和膜腺癌(Koshiba, Hosotani et al.2000)中及存在于乳腺癌(Muller, Homey et al.2001)和甲狀腺癌(Hwang, Chung et al.2003)、成神經細胞瘤和血液學惡性腫瘤(Geminder, Sag1-Assif et al.2001)的轉移灶中。相反，CXCR4 在正常乳腺(Muller, Homey et al.2001)、卵巢(Scotton, Wilson et al.2002)和前列腺上皮(Sun, Schneider et al.2005)中的表達水平很低或無。因此，CXCR4的表達似乎是惡性上皮細胞而非其正常相應細胞的一般特征。
[0036]抑制腫瘤細胞上的趨化因子-受體信號轉導具有在體內誘導生長停滯或凋亡及預防侵入和轉移的潛能:
[0037]通過siRNA產生的CXCR4減弱(knockdown)中止了乳腺腫瘤的生長(Lapteva, Yanget al.2005);給小鼠靜脈注射用阻止CXCR4表面表達的構建體轉染的T雜交瘤細胞，可使其不再遷移至遠處的器官(Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al.2001);在使用結腸直腸癌細胞的相似實驗中，大大減少了肺和肝轉移(Zeelenberg, Ruuls-Van Stalleet al.2003)；抗CXCR4抗體抑制乳腺癌異種移植物擴散到淋巴節(Muller，Homey etal.2001);使用抗CXCR4或抗SDF-1抗體處理淋巴樣干細胞延遲了(N0D)/SCID小鼠中的腫瘤生長(Bertolini, Dell' Agnola et al.2002);抗 SDF-1 抗體抑制非小細胞肺癌(NSCLC)細胞器官轉移的發生(Phillips, Burdick et al.2003);CXCR4拮抗劑AMD3100(AnorMED)的全身施用在24小時內抑制了顱內成膠質細胞瘤和成髓細胞瘤異種移植物的生長，并增加了腫瘤細胞凋亡(Rubin, Kung et al.2003);抗SDF-1抗體抑制了與癌相關成纖維細胞混合的MCF-7乳腺癌細胞的生長(Orimo，Gupta et al.2005);使用抗體中和CXCR4阻斷了前列腺癌轉移和骨灶生長(growth in osseous sites)(Sun, Schneider et al.2005);通過施用肽CXCR4拮抗劑T134阻止了在注射骨肉瘤細胞后肺轉移的發生(Perissinotto，Cavalloniet al.2005)。
[0038]不同文獻作者均提出，靶向SDF-1/CXCR4軸可給癌癥患者提供新的治療選擇:
[0039]人卵巢腫瘤強烈表達SDF-1，并以較低水平表達VEGF。兩種蛋白受腫瘤中的低氧觸發。病理濃度的其中任一蛋白質均不足以單獨誘導體內血管發生，但如果組合在一起，病理濃度的SDF-1和VEGF可有效且協同誘導新生血管形成。因此，阻斷所述協同軸，而非僅針對VEGF，可為治療癌癥的有效的抗血管生成新策略(Kryczek，Lange et al.2005)；
[0040]當具有自分泌SDF-1/CXCR4信號轉導通路時，乳腺癌細胞系便表現出攻擊行為。這包括伴隨加快生長的侵襲和遷移。因此，可從所述SDF-1/CXCR4軸獲取預測所述攻擊性的重要信息，也可將其用作治療人乳腺癌的重要靶標(Kang, Watkins et al.2005);
[0041]表達高水平的CXCR4的小細胞肺癌(SCLC)細胞的遷移和轉移受SDF-1調控。CXCR4的激活促進對腫瘤微環境中的輔助細胞(例如基質細胞)和胞外基質分子的附著。這些粘著相互作用導致SCLC細胞對化學療法的抗性增加。這樣，所述SDF-1/CXCR4軸的抑制劑可增加SCLC細胞的化學敏感性，并給患SCLC的患者提供新治療途徑(Hartmann, Burger etal.2004)；[0042]所述SDF-1/CXCR4軸已被認為是在體內運輸不同類型干細胞的關鍵調節通路。因為大多數(若非所有)惡性腫瘤源于干細胞/祖細胞區域，癌干細胞也在其表面表達CXCR4，從而所述SDF-1/CXCR4軸參與將它們指導運輸/轉移至表達SDF-1的器官(例如淋巴結、肺、肝、骨)。因此，針對調控SDF-1/CXCR4軸的策略可在將正常干細胞遞送至組織的再生藥物中和抑制癌干細胞的轉移的臨床腫瘤學中具有重要的臨床應用(Kucia，Reca etal.2005)。

【發明內容】

[0043]本發明旨在提供針對SDF-1的特異性結抗劑。本發明另一方面旨在提供用于治療分別牽涉SDF-1和CXCR4受體的疾病和病癥的化合物。
[0044]本發明另一方面旨在提供用于特異性檢測SDF-1的方法。
[0045]通過獨立權利要求的主題解決了本發明所涉及問題。優選實施方案可取自從屬權利要求。
[0046]第一方面，本發明通過核酸分子解決了本發明所涉及問題，所述核酸分子優選結合SDF-1，選自A型核酸分子、B型核酸分子、C型核酸分子，且核酸分子具有SEQ.1D.N0.142、SEQ.1D.N0.143 和 SEQ.1D.N0.144 所示任一核酸序列。
[0047]在一個實施方案中，所述A型核酸分子包含下列核心核苷酸序列:
[0048]5，AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3，(SEQ.1D.19)
[0049]其中Xa缺失或為A。
[0050]在一個優選實施方案中，所述A型核酸分子包含選自下列的核心核苷酸序列:
[0051]5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ.1D.N0.20)、
[0052]5，AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ.1D.N0.21)和
[0053]5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ.1D.N0.22)，所述核心核苷酸序列優選包含 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ.1D.N0.22)。
[0054]在一個實施方案中，所述核酸分子以5’ ->3’方向包含第一片核苷酸段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0055]在一個實施方案中，所述核酸分子以5’ ->3’方向包含第二核苷酸片段、所述核酸核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0056]在一個優選實施方案中，所述核酸分子包含所述第一和第二核苷酸片段，且所述第一和第二核苷酸片段任選相互雜交，其中在雜交后形成雙鏈結構。
[0057]在一個再優選的實施方案中，所述雙鏈結構由4-6個堿基對,優選5個堿基對構成。
[0058]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ X1X2NNBV 3’ (SEQ.1D.N0.44)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ BNBNX3X43’ (SEQ.1D.N0.45)，
[0059]其中X1缺失或為R，X2為S，X3為S及X4缺失或為Y ；
[0060]或
[0061]X1缺失，X2缺失或為S，X3缺失或為S及X4缺失。
[0062]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ RSHRYR 3’ (SEQ.1D.N0.23)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ YRYDSY 3’ (SEQ.1D.N0.24)，[0063]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ GCUGUG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ CGCAGC 3’。
[0064]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’X2BBBS 3’ (SEQ.1D.N0.42)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5，SBBVX3 3，(SEQ.1D.N0.43)，
[0065]其中X2缺失或為S，且X3缺失或為S ；
[0066]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’CUGUG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ CGCAG 3’ ；
[0067]或所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ CGCGC 3’。
[0068]在一個實施方案中，所述核酸分子具有SEQ.1D.N0.5_18、25_41、133、137、139-141
所示任一核酸序列。
[0069]在一個實施方案中，所述B型核酸分子包含下列核心核苷酸序列:
[0070]5，GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG3，(SEQ.1D.N0.57)。
[0071 ] 在一個優選實施方案中，所述B型核酸分子包含核心核苷酸序列GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ.1D.N0.58):
[0072]在一個實施方案中，所述核酸分子以5’ ->3’方向包含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0073]在一個實施方案中，所 述核酸分子以5’ _>3’方向包含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0074]在一個優選實施方案中，所述核酸分子包含所述第一和第二核苷酸片段，所述第一和第二核苷酸片段任選相互雜交，其中在雜交后形成雙鏈結構。
[0075]在一個實施方案中，所述雙鏈結構由4-6個堿基對,優選5個堿基對構成。
[0076]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ X1X2SVNS 3’ (SEQ.1D.N0.77)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ BVBSX3X4 3’ (SEQ.1D.N0.78)，其中
[0077]X1缺失或為A，X2是G，X3是C及X4缺失或為U ；
[0078]或
[0079]X1缺失，X2缺失或為G，X3缺失或為C及X4缺失。
[0080]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ X1GCRWG 3’ (SEQ.1D.N0.59)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ KRYSCX4 3’ (SEQ.1D.N0.60)，
[0081]其中Xjji失或為A，且X4缺失或為U。
[0082]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ X1GCGUG 3’ (SEQ.1D.N0.75)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ UACGCX4 3’ (SEQ.1D.N0.76)，
[0083]其中X1缺失或為A，且X4缺失或為U，
[0084]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ AGCGUG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ UACG⑶3’。
[0085]在一個優選實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’X2SSBS 3’(SEQ.1D.N0.73)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5，BVSSX3 3，(SEQ.1D.N0.74)，
[0086]其中X2缺失或為G，且X3缺失或為C，
[0087]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’GCGUG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ UACGC 3’。
[0088]在一個實施方案中，所述核酸分子具有SEQ.1D.N0.46_56、61_72和132所示任一核酸序列。 [0089]在一個實施方案中，所述C型核酸分子包含核心核苷酸序列GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (SEQ.1D.N0.90)，
[0090]其中Xa缺失或為A。
[0091]在一個優選實施方案中，所述C型核酸分子包含選自下列序列的核心核苷酸序列:
[0092]5，GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3，(SEQ.1D.N0.91)、
[0093]5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (SEQ.1D.N0.92)和
[0094]5，GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3，(SEQ.1D.N0.93 )，所述核心核苷酸序列優選包含5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ.1D.N0.93)。
[0095]在一個實施方案中，所述核酸分子以5’ ->3’方向包含第一核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第二核苷酸片段。
[0096]在一個實施方案中，所述核酸分子以5’ _>3’方向包含第二核苷酸片段、所述核心核苷酸序列和第一核苷酸片段。
[0097]在一個優選實施方案中，所述核酸分子包含所述第一和第二核苷酸片段，其中所述第一核苷酸片段的至少一部分與所述第二核苷酸片段的至少一部分任選相互雜交，其中在雜交后形成雙鏈結構。
[0098]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段的長度和所述第二片段的長度各自分別為0-17個核苷酸，優選4-10個核苷酸，及更優選4-6個核苷酸。
[0099]在一個實施方案中,所述雙鏈結構包含4-10個堿基對,優選4-6個堿基對,更優選5個堿基對。
[0100]在一個優選實施方案中,所述雙鏈結構包含4-10個連續堿基對,優選4-6個連續堿基對，更優選5個連續堿基對。
[0101]在一個優選實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ RKSBUSNVGR3’(SEQ.1D.N0.120)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’YYNRCASSMY 3，(SEQ.1D.N0.121),
[0102]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ RKSBUGSVGR 3’(SEQ.1D.N0.122)，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’YCNRCASSMY 3’( SEQ.1D.N0.123)。
[0103]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’XsSSSV 3’ (SEQ.1D.N0.124)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5，BSSSXs 3，(SEQ.1D.N0.125)，其中Xs缺失或為S。
[0104]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ SSSSR 3’ (SEQ.1D.N0.130)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5，YSBSS 3，(SEQ.1D.N0.131)，
[0105]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’SGGSR 3’ (SEQ.1D.N0.126)，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ YSCCS 3’ (SEQ.1D.N0.127)。
[0106]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’GCSGG 3’ (SEQ.1D.N0.128)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5，CCKGC 3，(SEQ.1D.N0.129)，[0107]所述第一核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’GCCGG 3’，且所述第二核苷酸片段優選包含核苷酸序列5’ CCGGC 3’。
[0108]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CGUGCGCUUGAGAUAGG3’，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CUGAUU⑶CACG 3’。 [0109]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’ UGAGAUAGG 3’，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CUGAUU⑶CA 3’。
[0110]在一個實施方案中，所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’GAGAUAGG 3’，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CUGAUUCUC 3’。
[0111]在一個實施方案中，所述核酸分子具有SEQ.1D.N0.79-89、94-119和134-136所示
任一核酸序列。
[0112]在一個實施方案中，所述核酸分子具有SEQ.1D.N0.142-144所不任一核酸序列。
[0113]在一個實施方案中，所述核酸分子是針對SDF-1的拮抗劑。
[0114]在一個實施方案中，所述核酸分子是SDF-1受體系統的拮抗劑,所述SDF-1受體系統的所述SDF-1受體優選是CXCR4受體。
[0115]在一個實施方案中，所述SDF-1是人SDF-1和/或所述SDF-1受體是人SDF-1受體。
[0116]在一個實施方案中，所述SDF-1包含SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
[0117]在一個實施方案中，所述核酸包含修飾物。
[0118]在一個優選實施方案中，所述修飾物選自HES部分和PEG部分。
[0119]在一個再優選的實施方案中，所述修飾物是由直鏈或支鏈PEG構成的PEG部分，其中所述PEG部分的分子量優選約2-180kD，更優選約60-140kD及最優選約40kD。
[0120]在一個實施方案中，所述修飾物是HES部分，其中所述HES部分的分子量優選約10-130kD，更優選約30-130kD及最優選約100kD。
[0121]在一個實施方案中，所述核酸的核苷酸是L-核苷酸，優選SEQ.1D.N0.19、20、21、
22、57、58、90、91、92和93所示任一序列的核苷酸。
[0122]第二方面，本發明通過包含第一方面的核酸和任選其他組分的藥物組合物解決了本發明所涉及問題，其中所述其他組分選自藥學可接受的賦形劑和藥物活性劑。
[0123]第三方面，本發明通過第一方面的核酸在藥物制備中的用途解決了本發明所涉及問題。
[0124]在第三方面的一個實施方案中，所述藥物被用于治療和/或預防疾病或病癥，其中所述疾病或病癥受SDF-1介導，所述疾病或病癥優選選自眼后部疾病,如糖尿病性視網膜病和老年黃斑變性；乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、結腸癌、肺癌和胃癌；骨肉瘤；黑素瘤；神經膠質瘤；成髓細胞瘤和成神經細胞瘤；白血病；WHIM綜合征；免疫缺陷綜合征；病理性新生血管形成；炎癥；多發性硬化癥；類風濕性關節炎/骨關節炎和腎炎。
[0125]在第三方面的一個實施方案中，所述藥物被用于抑制血管發生、新生血管形成、炎癥和轉移。
[0126]第四方面，本發明通過第一方面的核酸在診斷工具制備中的用途解決了本發明所涉及問題。[0127]在第四方面的一個實施方案中，所述診斷工具被用于診斷疾病，其中所述疾病選自眼后部疾病，如糖尿病性視網膜病和老年黃斑變性；乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、結腸癌、肺癌和胃癌；骨肉瘤；黑素瘤；神經膠質瘤；成髓細胞瘤和成神經細胞瘤；白血病；WHIM綜合征；免疫缺陷綜合征；病理性新生血管形成；炎癥；多發性硬化癥；類風濕性關節炎/骨關節炎和腎炎。
[0128]在第四方面的一個實施方案中，所述診斷工具被用于診斷血管發生、新生血管形成、炎癥和/或轉移。
[0129]第五方面，本發明通過包含SDF-1和第一方面的核酸的復合物解決了本發明所涉及問題，其中所述復合物優選是晶體復合物。
[0130]第六方面，本發明通過第一方面的核酸在SDF-1檢測中的用途解決了本發明所涉及問題。
[0131]第七方面，本發有通過用于篩選SDF-1拮抗劑或SDF-1激動劑的方法解決了本發明所涉及問題，所述方法包括下列步驟:
[0132]-提供候選SDF-1拮抗劑和/或候選SDF-1激動劑，
[0133]-提供第一方面的核酸，
[0134]-提供在SDF-1拮抗劑和/或SDF-1激動劑存在的情況下提供信號的檢測系統，及
[0135]-確定所述候選SDF-1拮抗劑是否是SDF-1拮抗劑和/或所述候選SDF-1激動劑是否是SDF-1激動劑。
[0136]第八方面，本發明通過篩選SDF-1激動劑和/或SDF-1拮抗劑的方法解決了本發明所涉及問題，所述方法包括下列步驟:`[0137]-提供固定于相的SDF-1，所述相優選固相，
[0138]-提供第一方面的核酸，優選被標記的第一方面的核酸，
[0139]-加入候選SDF-1激動劑和/或候選SDF-1拮抗劑，及
[0140]-確定所述候選SDF-1激動劑是否是SDF-1激動劑和/或所述候選SDF-1拮抗劑是否是SDF-1拮抗劑。
[0141]在第八方面的一個實施方案中，進行所述確定以便估計所述核酸是否被所述候選SDF-1激動劑或被候選SDF-1拮抗劑替代。
[0142]第九方面，本發明通過用于檢測SDF-1的包含第一方面的核酸的試劑盒解決了本發明所涉及問題。
[0143]第十方面，本發明通過可通過第七方面或第八方面的方法獲得的SDF-1拮抗劑解決了本發明所涉及問題。
[0144]本發明基于驚人的發現，即有可能制備出特異性結合SDF-1且與其具有高親和力的核酸。
[0145]SDF-1是具有SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列的堿性肽。經計算得到的SDF-1的pi為
9.70。本文所用術語SDF-1指任何SDF-1，包括但不限于哺乳動物SDF-1。所述哺乳動物SDF-1優選選自小鼠、大鼠、兔、倉鼠、猴和人SDF-1。所述SDF-1最優選是人SDF-1 (SEQ.1D.1)。
[0146]發現可鑒定可以高親和力SDF-1結合性核酸是令人驚訝的，因為Eaton等人(Eaton, Gold et al.1997)觀察到通常極難制備針對堿性蛋白質的適體(aptamer)(即結合靶分子的D-核酸)，因為此類靶標會產生高但非特異性的信噪比。所述高信噪比由核酸表現出的對堿性靶標(如SDF-1)的高非特異性親和力所致。
[0147]可在使用本發明的核酸的本發明的任何方面實現所述核酸的特征，其中可單獨或任意組合使用所述核酸。
[0148]無意受任何理論束縛，發明人假定所觀察到的本發明的核酸結合SDF-1的特異性共有一些結構特征，且具體指被稱為核心序列(將在下文中更詳細地討論)的核苷酸序列之一，請參照圖1-8及實施例1。但需知，這些圖和實施例1包括幾個不必在每個和任一本發明的核酸中實現的所述結構特征。
[0149]如在權利要求書和實施例1中的進一步詳述，可分別基于所述框和一些結構特征和元件對各種人SDF-1結合性核酸分子進行分類。本文將如述定義的各種類別稱為“~型”，且更具體稱為A型、B型和C型。
[0150]在一個優選實施方案中，本發明的核酸是單個核酸分子。再一個實施方案中，所不單個核酸分子以許多單個核酸分子的形式存在。除非另有說明，本文中的術語“核酸”和“核酸分子”可互換使用。
[0151]本領域技術人員將公認:本發明的核酸分子優選由相互共價連接(優選通過磷酸二酯連接或鍵連接)的核苷酸構成。
[0152]本發明的核酸還應包括與本發明的特定序列基本同源的核酸。應將術語“基本同源”理解為，同源性至少75%，優選85%，更優選90%，及最優選大于95%、96%、97%、98%或99%。
[0153]存在于本發明的核酸中的同源核苷酸的實際百分比將取決于存在于所述核酸中的核苷酸總數。修飾百分比 可基于存在于所述核酸中的核苷酸總數。
[0154]可根據本領域技術人員已知的方式測定所述同源性。所述方法更具體為序列比較算法，然后基于指定程序參數計算待測序列相對于參比序列的序列同一性百分比。所述待測序列優選為所述應與另一核酸分子同源或待測是否與另一核酸分子同源(且如果是，以何種程度同源)的序列或核酸分子，其中也將所述另一核酸分子稱為參比序列。在一個實施方案中，所述參比序列是本文所述核酸分子，更優選為具有SEQ.1D.N0.5-144所示任一序列的核酸分子。可根據下列方法進行用于比較的最佳序列比對，所述方法例如:Smith&Waterman 的局部同源性算法(Smith&Waterman, 1981), Needl eman&ff un s ch的同源性比對算法(Needleman&Wunsch, 1970), Pearson&Lipman的相似性搜索方法(Pearson&Lipman, 1988),這些算法的計算機化實施(Wisconsin Genetics SoftwarePackage 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 ScienceDr., Madison, Wis.)或目測檢查。
[0155]適合于測定序列同一性百分比的算法的一個實例是在基本局部比對搜索工具(basic local alignment search tool,以下稱為“BLAST”)中使用的算法，參見例如Altschul 等人(Altschul et al.1990 and Altschul et al，1997)。用于進行 BLAST 分析的軟件可在美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(以下稱為“NCBI”)中公開獲得。McGinnis等人描述了在使用可從NCBI獲得的軟件(例如BLASTN (用于核苷酸序列)和BLASTP (用于氨基酸序列))進行序列同一性測定中采用的默認參數(McGinnis et al, 2004)。
[0156]術語“本發明的核酸”還應包括包含本文公開的核酸序列或其部分的那些核酸，至所述核酸或所述部分優選參與結合SDF-1。可例如通過裁減本文公開的核酸而產生所述核酸。可裁減本文公開的核酸的任一末端或兩個末端。也可裁減內部核苷酸序列，即裁減5’和3’末端核苷酸之間的核苷酸。此外，裁減還應包括刪除本文公開的核酸序列中的短至一個核苷酸。也可裁減不只一個本發明的核酸片段，其中所述片段可短至僅為一個核苷酸長。本領域技術人員可通過常規實驗或通過使用或采用本文所述的方法(優選在本文實施例部分描述的方法)測定本發明的核酸的結合。
[0157]本發明的核酸可為D-核酸或L-核酸。本發明的核酸優選是L-核酸。另外，也可能是所述核酸的一個或幾個部分為D-核酸或所述核酸的至少一個或幾個部分為L-核酸。術語所述核酸的“部分”應指短至一個核苷酸。本文通常將所述核酸分別稱為D-核酸和L-核酸。因此，在一個特別優選的實施方案中，本發明的核酸由L-核苷酸構成，并包含至少一個D-核苷酸。所述D-核苷酸優選附著于不同于定義本發明的核酸片段的部分,優選與所述核酸的其他部分相互作用的所述核酸的那些部分。所述D-核苷酸優選分別附著于本發明的任意片段末端和任意核酸末端。在再優選的實施方案中，所述D-核苷酸可被用作間隔物或連接物，優選將修飾物(如PEG和HES)附著于本發明的核酸。
[0158]即述特征亦在本發明的范圍內，即每個和任一本文所述核酸分子(以其整體(以其核酸序列表示))均限于特定核苷酸序列。換言之，應將所述實施方案中的術語“包含”解釋為“含有”或“由…構成”。
[0159]即述特征亦在本發明的范圍內，即本發明的核酸是較長核酸的部分，其中所述較長核酸包含幾個部分，其中至少一個所述部分是本發明的核酸或其部分。所述較長核酸的其他部分可為一個或幾個D-核酸或L-核酸。本發明可使用任意組合。較長核酸的所述其他部分，可表現出不同于結合(優選結合SDF-1)的功能。一種可能的功能是允許與其他分子(其中所述其他分子優選與SDF-1不同)相互作用，例如，用于固定、交聯、檢測或擴增。在本發明的另一個實施方案中，本發明的核酸單獨或組合包含幾個本發明的核酸。術語“較長核酸”也涵蓋包含幾個本發明的核酸的所述核酸。
[0160]本文所用L-核酸是由L-核苷酸構成的核酸，優選完全由L-核苷酸構成的核酸。
[0161]本文所用D-核酸是由D-核苷酸構成的核酸，優選完全由D-核苷酸構成的核酸。
[0162]除非另有說明，術語“核酸”和“核酸分子”在本文中可互換使用。
[0163]除非另有說明，本文中的所有核苷酸序列也均以5’ 一 3’的方向表示。
[0164]無論本發明的核酸由D-核苷酸構成、由L-核苷酸構成還是由兩者的組合(所述組合是例如隨機組合，或是由至少一個L-核苷酸和至少一個D-核酸構成的片段的特定序列)構成，所述核酸可由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其組合構成。
[0165]將本發明的核酸設計成L-核酸具有諸多優點。L-核酸是天然核酸的對映體。但由于核酸酶的廣泛存在，D-核酸在水溶液中(且尤其在生物系統或生物樣品中)不很穩定。天然核酸酶(尤其是來自動物細胞的核酸酶)不能降解L-核酸。由此，L-核酸在所述系統(包括動物和人體)中的生物學半衰期顯著增長。由于L-核酸不易降解，故無核酸酶降解產物產生，從而觀察不到由其所致 的副作用。所述方面事實上界定了所有其他化合物(其用于治療涉及SDF-1的疾病和/或病癥)的L-核酸。也將通過不同于Watson-Crick堿基配對機理特異性結合靶分子的L-核酸或或部分或完全由L-核酸構成的適體(尤其含有參與所述適體與祀分子的結合的所述適體部分)稱為鏡像異構體(spiegelmer)。[0166]即述特征亦在本發明的范圍內，即連接到所述核心核苷酸序列兩側的所述第一和第二核苷酸片段原則上可相互雜交。在所述雜交后形成雙鏈結構。本領域技術人員將公認:所述雜交可(尤其在體外和/或體內條件下)發生或不發生。如果發生雜交，則可至少基于堿基配對法則雜交形成雙鏈結構，無需發生兩個片段的全序列雜交。本文所用雙鏈結構優選是由兩個或多個獨立鏈形成的部分分子或結構，其中存在至少一個(優選兩個或多個)優選按照Watson-Crick堿基配對法則進行堿基配對的堿基對。本領域技術人員還將公認:其他堿基配對(例如Hoogsten堿基配對)可存在于所述雙鏈結構中或形成所述雙鏈結構。
[0167]即述特征亦在本發明的范圍內，即無論是以D-核酸、L-核酸或D，L-核酸存在的核酸，或無論它們是DNA或RNA，本發明的核酸可作為單鏈或雙鏈核酸存在。通常，本發明的核酸是表現出由一級序列限定的二級結構，并由此也可形成三級結構的單鏈核酸。但本發明的核酸也可為雙鏈核酸，即彼此互補或部分互補的兩條鏈相互雜交。這賦予核酸以穩定性，尤其在所述核酸是以天然D-形式而非L-形式存在時有利。
[0168]可修飾本發明的核酸。可對所述核酸的單個核苷酸進行所述修飾，且所述修飾為本領域所熟知。有關所述修飾的實例尤其見Venkatesan等人(Venkatesan, Kim etal.2003)和Kusser (Kusser2000)。所述修飾物可為在構成所述核酸的個別核苷酸的2’位置處的H原子、F原子或O-CH3基團或NH2-基團。此外，本發明的核酸也可包含至少一個LNA核苷酸。在一個實施方案中,本發明的核酸由LNA核苷酸構成。
[0169]在一個實施方案中，本發明的核酸可為多分體(multipartite)核酸。本文所用多分體核酸是由至少兩個核酸鏈構成的核酸。所述至少兩個核酸鏈形成功能單元，其中所述功能單元是靶分子的配體。可通過將所述核酸切成兩條鏈，或通過合成與本發明的(即整體)核酸的第一部分相對應的一條核酸和與整體核酸的第二部分相對應的另一條核酸而從本發明的核酸得到所述至少兩個核酸鏈。應公認切割和合成兩者均可被用于制備如上所述具有2個以上鏈的多分體核酸。換言之，盡管各個核酸部分間可一定程度互補，但所述至少兩個核酸鏈通常不同于互補且相互雜交的兩條鏈。
[0170]即述特征亦在本發明的范圍內，即最后實現了本發明的核酸的完全閉合(即環狀)結構，即本發明的核酸是閉合的，優`選通過共價連接閉合，其中所述共價連接更優選發生在本文公開的核酸序列的5’末端和3’末端之間。
[0171]發明人已發現，本發明的核酸表現出非常有利的Kd值范圍。
[0172]通過使用所謂的biacore儀(Biacore AB, Uppsala, Sweden)進行的表面等離子共振測量是測定結合常數的一種可能方法，這也是本領域技術人員已知的。可優選通過使用實施例中描述的“pull-down測定法(pull-down binding assay)”測量本文所用親和力。表示所述核酸與所述靶標(在當前情況下為SDF-1)之間的結合強度的合適量度即為所謂Kd值，本領域技術人員知曉該值及其測定方法。
[0173]本發明的核酸通過某個Kd值來表征。本發明的核酸表現出的Kd值優選低于I μ M0約I μ M的Kd值被認為是核酸與靶標非特異性結合的特征。如本領域技術人員將公認的一樣，一組化合物(如本發明的核酸)的Kd值在某個范圍內。上述約I μ M的Kd是優選的Kd值上限。結合靶標的核酸的Kd的優選下限可為約IOpM或更高。即述特征亦在本發明的范圍內，即個別核酸與SDF-1結合的Kd值優選在所述范圍內。優選的范圍可通過選擇所述范圍內的任意第一個數字和所述范圍內的任意第二個數字來限定。優選的上限值是250ηΜ和IOOnM,優選的下限值是 50nM、IOnM, InM、IOOpM 和 ΙΟρΜ。
[0174]只要仍能結合靶分子，本發明的核酸分子可具有任意長度。本領域將公認，存在本發明的核酸的優選長度。所述長度一般為15-120個核苷酸。本領域技術人員將公認，15-120的任何整數是本發明的核酸的可能長度。本發明的核酸的長度的更優選范圍是約20-100個核苷酸、約20-80個核苷酸、約20-60個核苷酸、約20-50個核苷酸及約20-40個核苷酸的長度。[0175]即述特征亦在本發明的范圍內，即本文公開的核酸包含優選為聞分子量部分和/或優選使所述核酸尤其在動物體內(優選在人體內)的停留時間的特征發生改變的部分。所述修飾物的特別優選的實施方案是本發明的核酸的PEG化和HES化。本文所用PEG表示聚(乙二醇)，而HES表示羥乙基淀粉。本文所用PEG化優選為對本發明的核酸的修飾，其中所述修飾物由附著于本發明的核酸的PEG部分構成。本文所用HES化優選為對本發明的核酸的修飾，其中所述修飾物由附著于本發明的核酸的HES部分構成。歐洲專利申請EP I 306382中描述了所述修飾物及用所述修飾物修飾核酸的方法，將所述專利公開通過引用整體并入本文。
[0176]優選情況下，由聞分子量部分構成或包含聞分子量部分的修飾物的分子量，尤其在PEG作為所述高分子量部分的情況下為約2，000-200, OOODa，優選40，000-120, OOODa,且尤其在HES作為所述高分子量部分的情況下優選為約3，000-180, OOODa,更優選60, 000-140, OOODa0例如德國專利申請DE I 2004 006 249.8中描述了 HES修飾方法，將所述專利公開通過引用整體并入本文。
[0177]即述特征亦在本發明的范圍內，即如在專利申請W02005074993和PCT/EP02/11950中進一步描述的那樣，可以直鏈或支鏈形式使用PEG和HES中的任一者。原則上可在本發明的核酸分子的任何位置進行所述修飾。可優選在所述核酸分子的5’-末端核苷酸、3’ -末端核苷酸和/或5’核苷酸和3’核苷酸之間的任意核苷酸上進行所述修飾。
[0178]可將所述修飾物(且優選為PEG和/或HES部分)直接或通過連接子附著于本發明的核酸分子。即述特征亦在本發明的范圍內，即本發明的核酸分子包含一種或多種修飾物，優選一種或多種PEG和/或HES部分。在一個實施方案中，個別連接分子將一種以上的PEG部分或HES部分附著于本發明的核酸分子上。本發明中使用的連接子本身可為直鏈的或支鏈的。本領域技術人員知曉此類連接子，且專利申請W02005074993和PCT/EP02/11950中也進一步描述了所述連接子。
[0179]無意受任何理論束縛，通過用高分子量部分(如聚合物(且更尤其是本文公開的聚合物(其優選為生理學上可接受的)))修飾本發明的核酸，似乎改變了分泌動力學。更具體而言，似乎由于所述經修飾的本發明核酸的分子量增加，且由于所述核酸不經歷代謝(尤其是在L形式時)，從而降低其從動物體內，優選從哺乳動物體內，及更優選從人體內分泌。由于一般通過腎臟進行分泌，因此發明人推測:經如述修飾的核酸的腎小球濾過率較不帶此類高分子量修飾物的核酸顯著減小，這導致其在體內的停留時間增長。與之相關，特別值得注意的是，盡管具有這種高分子量修飾，但本發明的核酸的特異性并未受到有害影響。如此這般，本發明的核酸具有令人驚訝的特征(所述特征通常不能從藥學活性化合物中預期)，從而無需通過使用賦予持續釋放特性的藥物制劑來使其持續釋放。而以其包含高分子量部分的修飾形式，本發明的核酸本身就可用作持續釋放制劑。如此這般，如本文公開的核酸分子的修飾物和經如述修飾的核酸分子及任何包含其的組合物可提供不同的，優選受控的藥物動力學及其生物分布。這還包括在循環中的停留時間和向組織的分配。專利申請PCT/EP02/11950中進一步描述了所述修飾。
[0180]但即述特征亦在本發明的范圍內，即本文公開的核酸不包含任何修飾，且尤其不包含高分子量修飾(例如PEG化或HES化)。當希望將核酸于施用后快速清出身體時，尤其優選所述實施方案。當需要使用本發明的核酸或包含所述核酸的藥物進行體內成像或特定給藥時可能希望所述快速清除。
[0181]可將本發明的核酸和/或本發明的拮抗劑用于制藥。所述藥物包含任選與其他藥學活性化合物組合在一起的至少一種本發明的核酸，其中本發明的核酸本身優選發揮藥學活性化合物的作用。在一個優選實施方案中，所述藥物至少包含藥學可接受的載體。所述載體可為例如水、緩沖液、PBS、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、甘露糖溶液、優選5%的蔗糖平衡液、淀粉、糖、明膠或任何其他可接受的載體物質。所述載體通常是本領域技術人員已知的。本領域技術人員將公認，也可將本發明藥物的任何實施方案、用途和方面或與之相關的實施方案、用途和方面應用于本發明的藥物組合物，反之亦然。
[0182]用本發明的或根據本發明制備的核酸、藥物組合物和藥物治療和/或預防的適應癥、疾病和病癥是由SDF-1直接或間接參與各自致病機理所致。
[0183]當然，由于本發明的SDF-1結合性核酸與人或鼠的SDF-1相互作用或結合，本領域技術人員通常將理解:可容易將本發明的SDF-1結合性核酸用于治療、預防和/或診斷本文描述的任何人和動物疾病。
[0184]可使用所述藥物治療和/或預防的疾病和/或病癥和/或病狀包括但不限于:眼后部疾病，如視網膜病、糖尿病性視網膜病和老年黃斑變性(干性和濕性兩種形式)；癌癥；乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、結腸癌、肺癌和胃癌；骨肉瘤；黑素瘤；神經膠質瘤；成髓細胞瘤和成神經細胞瘤；白血病；B細胞慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤；淋巴瘤；WHIM綜合征；免疫 缺陷綜合征；病理性新生血管形成；炎癥；多發性硬化癥；關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎和腎炎。
[0185]在進一步實施方案中，所述藥物包含其他藥學活性劑。所述其他藥學活性化合物可為本領域技術人員已知的藥物，且優選選自趨化因子或細胞因子拮抗劑、皮質類固醇等。本領域技術人員理解:假設可根據本發明通過使用本發明的核酸處理所述各種適應癥時，所述其他藥學活性劑可為原則上適用于治療和/或預防所述疾病的任何藥學活性劑。優選將本發明的核酸分子(尤其是以藥物形式存在或使用時)與VEGF抑制劑(如來自Pfizer Ophthalmics 的哌加他尼鈉(Pegatanib)、來自 Novartis Ophthalmics 的 Lucentis(Ranitizumab)、來自Roche (藥品核準標示外使用)的阿瓦斯丁(貝伐單抗))組合；或與光動力療法(如來自Novartis Ophthalmics的Visudyne (維替泊芬))和可注射到玻璃體內的可的松衍生物(如來自Alcon Inc.的Retaane (醋酸阿奈可他)組合。
[0186]此外，所述其他藥學活性劑也可為本發明的其他核酸。所述藥物也可再包含至少一種與不同于SDF-1的靶分子結合或表現出不同于本發明的核酸之一的功能的核酸。
[0187]本領域技術人員將公認:確實可在任何可通過將針對SDF-1的拮抗劑施用給需要所述結抗劑的患者，且所述拮抗劑適合于消除疾病或病癥的病因或至少可減少來自疾病或病癥的效應的疾病中使用本發明的核酸。所述效應包括但不限于:病理性新生血管形成、炎癥和轉移。本發明的核酸適用于所述及其他說明書導言部分所述尤其由SDF-1參與所致的疾病或病癥(將其通過引用并入本文，以避免任何不必要的重復)。
[0188]即述特征亦在本發明的范圍內，即此外原則上還可將藥物用于預防公開的與所述藥物在所述疾病治療中的用途相關的任何疾病。因此本領域技術人員已知對于相應疾病的相應標記物。所述相應標記物優選是SDF-1。此外,所述相應標記物選自氧化應激標記物(包括鐵氰化物(TMR)的跨膜還原酶、山梨醇途徑活性增加包括之后的山梨醇蓄積、細胞溶質NADH/NAD比率增力卩、NADPH耗盡和果糖蓄積及隨之而來的晚期糖基化終產物(AGES)的非酶促產生和蛋白激酶C的隨后激活、由亞硝化和氧化應激介導的下游事件(例如MAP激酶活化))、炎性標記物(包括ICAM-1、VCAM-U RANTES、結合珠蛋白或C反應性蛋白)及促血管生成標記物(如促血紅細胞生長素或VEGF)。由此看來，可將所述標記用于確定是否可用本發明的任意核酸分子治療受試者或患者。因此，再一方面，本發明涉及所述方法，其中測定相應標記物的存在與否及更具體的濃度。本領域技術人員已知用于檢測所述標記物和任選定量所述標記物，及相應標記物應當存在或不存在于其中的范圍，以判定受試者或患者是否患所述疾病中的任一種或處于患所述疾病的危險中的方法，及從而可按照本發明相應進行治療的方法。
[0189]在本發明的藥物的一個實施方案中，將所述藥物與其他療法聯合應用于本文公開的任一種疾病，尤其是待用本發明的藥物進行治療的疾病。
[0190]“聯合療法”(或“綜合療法”)包括施用本發明的藥物和至少第二試劑(作為具體治療方案的一部分)，以期望通過這些治療劑(即本發明的藥物和所述第二試劑)的共同作用提供有益效應。這種聯合的有益效應包括但不限于由治療劑的聯合所致的藥物動力學或藥效動力學共同作用。通常在限定的時間內完成所述治療劑的聯合施用(通常為數分鐘、數小時、數天或數周，取決于所選聯合)。
[0191]“聯合療法”可旨在包括(但通常不包括)分別獨立施用兩種或多種所述治療劑，所述分別獨立施用偶爾也可導致本發明的聯合。“聯合療法”旨在包括連續施用這些治療劑，即在不同時間施用其中各治療劑，和基本上同時施用這些治療劑或所述治療劑中的至少兩種。可例如通過給受試者施用以固定比例含有各治療劑的單膠囊或多個各治療劑的單膠囊實現基本上同時給藥。
[0192]可通過任何合適途徑實現各治療劑的依次給藥或基本上同時給藥，所述途徑包括但不限于:局部途徑、口服途徑、靜脈內途徑、肌內途徑和經過粘膜組織直接吸收。可通過相同途徑或不同途徑施用所述治療劑。例如，可注射施用所選聯合劑的第一種治療劑，并可局部施用所述聯合劑中的其他治療劑。
[0193]此外，也例如可局部施用所有治療劑，或可注射施用所有治療劑。除非另有說明，所述治療劑的施用順序不嚴格重要。“聯合療法”還可包括將上述治療劑再與其他生物活性成分聯合施用。如果聯合療法還包括非藥物治療，則可在能從治療劑和非藥物治療的聯合的共同作用中獲得有益效應的任何合適時間實施所述非藥物治療。例如，在適當的情況下，在非藥物治療時隔治療劑的施用或許有幾天或甚至幾周時，仍能達到有益效應。
[0194]如在上述通用術語中所論述，原則上可以本領域技術人員已知的任何形式施用本發明的藥物。優選的施用途徑是全身施用，更優選通過腸胃外施用(優選通過注射)。此外，也可局部施用所述藥物。其他施用途徑包括肌內、腹膜內和皮下、經口、鼻內、氣管內或肺部施用，優選侵入性最低并同時確保效力的施用途徑。
[0195]腸胃外施用通常被用于皮下、肌內或靜脈內注射和輸注。另外，一種用于腸胃外施用的方法采用了本領域技術人員熟知的緩釋或持續釋放系統的植入，其確保維持恒定的劑量水平。
[0196]此外，可通過局部使用合適的鼻內媒介物(vehicle)、吸入劑以鼻內形式施用本發明的優選藥物，或可采用那些本領域技術人員所熟知的透皮貼劑的形式通過經皮途徑施用本發明的優選藥物。欲以透皮遞送系統形式給藥，(當然)要在整個給藥過程中連續而非間歇給藥。其他優選的局部制劑包括乳膏劑、軟膏劑、洗劑、氣霧噴霧劑和凝膠劑，其中活性成分的濃度范圍通常將是0.01%-15% (w/w或w/v)。
[0197]本發明的藥物將通常包含溶解或分散于藥學可接受的介質中的有效量的治療活性成分，包括但不限于本發明的核酸分子。藥學可接受的介質或載體包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。本領域熟知用于藥學活性物質的所述介質和制劑的應用。也可將補充的活性成分摻入本發明的藥物中。
[0198]本發明再一方面涉及藥物組合物。所述藥物組合物包含至少一種本發明的核酸，且優選包含藥學可接受的粘合劑。所述粘合劑可為本領域使用和/或已知的任何粘合劑。所述粘合劑更特別是任何有關本文公開的藥物的制備過程中論述的粘合劑。再一個實施方案中，所述藥物組合物包含其他藥學活性劑。
[0199]根據本公開，本領域技術人員將知道藥物和藥物組合物的制備。通常可將所述組合物制成注射劑(作為液體溶液或懸浮液)；制成適合于在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式；制成用于口服施用的片劑或其他固體劑；制成定時釋放膠囊；或制成當前使用的任何其他形式，包括滴眼劑、乳膏齊?、洗劑、油膏齊?、吸入劑等。由外科醫生、內科醫生或衛生保健工作者使用無菌制劑(例如基于鹽水的洗液)來處理手術區中的特定區域也特別有用。也可通過微型裝置、微顆粒或海綿遞送組合物。
[0200]配制后，將藥物以與劑量制劑相容的方式施用，并施用藥理學有效量。可易于以各種劑型(例如上述可注射溶液的類型)施用所述制劑，但也可采用藥物釋放膠囊等。
[0201]在所述情形中，待施用的活性成分的量和組合物體積取決于待治療的個體或受試者。給藥所需的活性化合物的具體量取決于從業者的判斷，且特異于每個個體。
[0202]通常利用分散活性化合物所需的最小體積的藥物。合適的施用方案也是可變的，但可以開始施用所述化合物并監測結果，然后再以進一步的時間間隔提供進一步的受控劑量表示。
[0203]例如，當以片劑或膠囊(例如明膠膠囊)形式口服施用時，可將活性藥物成分(即本發明的核酸分子)和/或任何其他藥學活性劑(在本文中也被稱為治療劑或活性化合物)與口服的、無毒的、藥學可接受的惰性載體(例如乙醇、甘油、水等)相組合。而且，當期望或需要時，也可將合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入所述混合物。合適的粘合劑包括淀粉，硅酸鎂鋁，淀粉衆，明膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖類(例如葡萄糖或β -乳糖)，玉米增甜劑，天然和合成的樹膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠或藻酸鈉)，聚乙二醇，蠟等。在這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇等。崩解劑包括但不限于，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物等。稀釋劑包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素和/或甘氨酸。
[0204]還可以諸如定時釋放和緩釋片劑或膠囊、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、混懸劑、糖漿劑和乳劑的口服劑型施用本發明的藥物。有利地由脂肪乳濁液或懸浮液制備栓劑。
[0205]藥物組合物或藥物可為經滅菌的和/或含有佐劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、促溶劑(solution promoter)、用于調節滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外，它們還可包含其他在治療上有價值的物質。根據常規混合、粒化或包被方法制備組合物，且所述組合物通常含有約0.1%-75%，優選約1%-50%的活性成分。
[0206]可通過例如溶解、分散等制備液體(尤其是可注射的)組合物。將活性化合物溶解于藥學純溶劑(例如水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等)中或與之混合，從而形成可注射的溶液或懸浮液。另外，可配制適合于在注射前溶解于液體中的固體形式。
[0207]對于固體組合物，賦形劑包括藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。還可用例如聚亞烷基二醇(如丙二醇)作為載體將上文限定的活性化合物配制成栓劑。在一些實施方案中，有利地由脂肪乳濁液或懸浮液制備栓劑。
[0208]也可以脂質體遞送系統(例如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡)的形式分別施用本發明的藥物和核酸分子。脂質體可由各種磷脂(包含膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿)構成。在一些實施方案中，將脂質成分的薄膜與藥物水溶液水合而形成包裹所述藥物的脂質層，這是本領域技術人員熟知的。例如，可以用本領域已知方法與親脂化合物或非免疫原性高分子量化合物構建的復合物形式提供本文所述的核酸分子。另外，脂質體可在其表面攜帶所述核酸分子，以便用于靶向和在內部攜帶細胞毒性劑而介導細胞殺傷。美國專利6，011，020中提供了核酸相關復合物的實例。
[0209]也可分別將本發明的藥物和核酸分子與作為可定靶藥物的載體的可溶聚合物相偶聯。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羥乙基天冬酰胺苯酚或經棕櫚酰殘基取代的聚環氧乙烷聚賴氨酸。此外，可分別將本發明的藥物和核酸分子偶聯至一類可用于實現藥物的受控釋放的可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε -己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛類、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯類及水凝膠的交聯或兩親性嵌段共聚物。
[0210]如需要，待施用的藥物組合物和藥物還可含有較少量的非毒性輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑及其他物質，例如乙酸鈉和三乙醇胺油酸酯。
[0211]可根據多種因素選擇分別使用本發明的核酸分子和藥物的給藥方案，包括:患者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫學狀況；待治療的病狀的嚴重度；給藥途徑；患者的腎和肝功能；及所采用的具體適體或其鹽。普通醫師或獸醫可容易確定和開出預防、對抗或阻止病狀進展所需的藥物有效量。
[0212]在治療本文公開的任何疾病中，本發明的核酸的有效血漿水平范圍優選為500fM-500μ Mo
[0213]可優選以單次日劑量、每兩天或每三天、每周、每兩周、以單次月劑量或每三個月劑量分別施用本發明的核酸分子和藥物。
[0214]即述特征亦在本`發明的范圍內，即本文所述藥物構成了本文公開的藥物組合物。
[0215]本發明再一方面涉及用于治療需要這種治療的受試者的方法，其中所述方法包括施用藥學活性量的至少一種本發明的核酸。在一個實施方案中，受試者患有疾病或處于患所述疾病的風險中，其中所述疾病是任何本文公開的所述疾病，尤其是有關任何本發明的核酸在藥物制備中的用途中公開的那些疾病中的任何一種。
[0216]如本文優選使用的診斷或診斷劑或診斷工具適合于直接或間接檢測有關本文中描述的各種病癥和疾病時描述的SDF-1。所述診斷適合于檢測和/或隨訪任何本文分別描述的病癥和疾病。所述檢測通過本發明的核酸與SDF-1的結合而成為可能。可直接或間接檢測這種結合。相應的方法和工具是本領域技術人員已知的。尤其是，本發明的核酸可包含標記，所述標記使得能檢測本發明的核酸，優選結合到SDF-1的核酸。所述標記優選選自放射性標記、酶標記和熒光標記。原則上，所有已知的針對抗體開發的測定法都可用于本發明的核酸，但將靶結合性抗體替換成了靶結合性核酸。在使用未標記的靶結合性抗體的抗體-測定法中，優選通過二抗來進行檢測，用放射性標記、酶標記和熒光標記修飾所述二抗，并在其Fe-片段處結合所述靶結合性抗體。在核酸，優選本發明的核酸的情形中，用優選選自生物素、Cy-3和Cy-5的標記修飾所述核酸，且用針對所述標記的抗體(例如抗生物素抗體、抗Cy3抗體或抗Cy5抗體)檢測這種標記，或當所述標記為生物素時，用天然結合生物素的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白檢測所述標記。繼而，優選用相應標記(例如放射性標記、酶標記或熒光標記)修飾所述抗體、鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白(如同二抗一樣)。
[0217]再一個實施方案中，通過第二種檢測工具檢測或分析本發明的核酸分子，其中所述檢測工具是分子信標。本領域技術人員已知分子信標方法。簡言之，核酸探針(其也被稱為分子信標)是待測核酸樣品的反向互補序列，并因而可與待測核酸樣品部分雜交。在結合核酸樣品后，分子信標的熒光基團分離，導致熒光信號發生變化，優選為強度變化。這種變化與存在的核酸樣品量相關。
[0218]本領域技術人員理解，由于本文概述的SDF-1與其相應的受體之間的關系，可使用本發明的核酸分子診斷的疾病和病癥原則上正是關于所述核酸分子用于治療和/或預防所述疾病的用途時所描述的疾病和病癥。
[0219]除此以外，本發明的核酸分子的用途存在于造血減少、侵入或轉移減少、B細胞發生和趨化現象減少、T細胞化學趨化減少和誘導生長抑制和凋亡。
[0220]有關SDF-1的檢測，優選方法包括下列步驟:
[0221](a)提供待測SDF-1是否存在的樣品
[0222](b)提供本發明的核酸，
[0223](c)讓所述樣品與所述核酸反應，優選在反應容器中進行反應，
[0224]其中步驟(a)可在步驟(b)之前進行，或步驟(b)可在步驟(a)之前進行。
[0225]在一個優選實施方案中，還提供步驟d)，檢測樣品與核酸的反應。優選將步驟b)的核酸固定至表面。所述表面可為反應容器(例如反應管、平板的孔)表面，或可為包含于所述反應容器中的裝置(例如珠)表面。可通過任何本領域技術人員已知的手段將核酸固定至所述表面，包括但不限于非共價或共價連接。優選通過所述表面和所述核酸之間的共價化學鍵建立連接。但即述特征亦在本發明的范圍內，即將所述核酸間接固定至所述表面，其中這種間接固定涉及使用其他組分或一對相互作用偶體(interaction partner)。所述其他組分優選為與待固定的核酸特異性相互作用的化合物(其也被稱為相互作用偶體)，并從而介導所述核酸附著于所述表面。所述相互作用偶體優選選自核酸、多肽、蛋白質和抗體。所述相互作用偶體優選為抗體，更優選為單克隆抗體。所述相互作用偶體也可為核酸，優選功能性核酸。所述功能性核酸更優選選自適體、鏡像異構體和至少與所述核酸部分互補的核酸。再一個備選實施方案中，所述核酸與所述表面的結合由多分體相互作用偶體(mult1-partite interaction partner)介導。所述多分體相互作用偶體優選為由第一成員和第二成員構成的一對相互作用偶體或一個相互作用偶體，其中所述第一成員包含于或附著于所述核酸，而所述第二成員包含于或附著于所述表面。所述多分體相互作用偶體優選選自包括生物素和抗生物素蛋白、生物素和鏈霉抗生物素蛋白、及生物素和中性鏈霉抗生物素蛋白(neutravidin)的相互作用偶體對。所述相互作用偶體對的第一成員優選是生物素。
[0226]所述方法的優選結果是形成了 SDF-1和所述核酸的經固定的復合物，其中更優選可檢測到所述復合物。技術特征亦在實施方案的范圍內，即可從所述復合物中檢測出SDF-1。
[0227]用于檢測SDF-1的方法還包括:從優選已用于進行步驟c)的反應容器中除去樣
品O
[0228]再一個實施方案中，所述方法還包括將SDF-1的相互作用偶體固定于表面(優選如上定義的表面)的步驟，其中所述相互作用偶體如本文中定義，和優選如上面在關于相應的方法時所定義的，及更優選在它們的各種實施方案中包括核酸、多肽、蛋白質和抗體。在此實施方案中，特別優選的檢測工具是本發明的核酸，其中所述核酸可優選為經標記的或未標記的。在所述核酸為經標記的情況下，它可直接或間接被檢測。這種檢測也可涉及第二種檢測工具的使用，所述第二種檢測工具也優選選自核酸、多肽、蛋白質和在本文所述的各種實施方案中的具體形式。所述檢測工具優選特異于本發明的核酸。在更優選的實施方案中，所述第二種檢測工具是分子信標。在一個優選實施方案中，所述核酸或所述第二種檢測工具或兩者可包含檢測標記。所述檢測標記優選選自生物素、溴脫氧尿苷標記、洋地黃毒苷標記、熒光標記、UV-標記、放射性標記和螯合劑分子。此外，所述第二種檢測工具也可與優選由所述核酸所含有、由所述核酸所`包含或附著于所述核酸的檢測標記相互作用。特別優選的組合如下:
[0229]檢測標記是生物素而第二種檢測工具是針對生物素的抗體，或其中
[0230]檢測標記是生物素而第二種檢測工具是抗生物素蛋白或攜帶抗生物素蛋白的分子，或其中
[0231]檢測標記是生物素而第二種檢測工具是鏈霉抗生物素蛋白或攜帶鏈霉抗生物素蛋白的分子，或其中
[0232]檢測標記是生物素而第二種檢測工具是中性鏈霉抗生物素蛋白或攜帶中性鏈霉抗生物素蛋白的分子，或其中
[0233]檢測標記是溴脫氧尿苷而第二種檢測工具是針對溴脫氧尿苷的抗體，或其中
[0234]檢測標記是洋地黃毒苷而第二種檢測工具是針對洋地黃毒苷的抗體，或其中
[0235]檢測標記是螯合劑而第二種檢測工具是放射性核素，其中所述檢測標記優選附著于所述核酸。將公認的是，此類組合也可被應用于其中核酸附著于表面的實施方案。在這種實施方案中，檢測標記優選附著于相互作用偶體。[0236]最后，即述特征亦在本發明的范圍內，即用第三種檢測工具檢測第二種檢測工具，所述第三種檢測工具優選是酶，更優選為在檢測所述第二種檢測工具時顯示出酶促反應的酶，或所述第三種檢測工具是用于檢測輻射(更優選由放射性核素發射的輻射)的工具。所述第三種檢測工具優選特異性檢測所述第二種檢測工具和/或與所述第二種檢測工具相互作用。
[0237]此外，在將SDF-1的相互作用偶體固定在表面上并將本發明的核酸優選加入到在相互作用偶體和SDF-1之間形成的復合物中的實施方案之中，可將樣品從反應體系中移除，更優選從在進行步驟c)和/或d)的反應容器中移除。
[0238]在一個實施方案中，本發明的核酸包含突光部分，且其中在所述核酸與SDF-1之間形成復合物時和在所述核酸與游離的SDF-1之間形成復合物時的所述熒光部分的熒光不同。
[0239]再一個實施方案中，所述核酸是本發明的核酸的衍生物，其中所述核酸的衍生物包含至少一種腺苷的熒光衍生物以替換腺苷。在一個優選實施方案中，所述腺苷的熒光衍生物是亞乙烯基腺苷。
[0240]再一個實施方案中，利用熒光檢測由本發明的核酸的衍生物和SDF-1構成的復合物。
[0241 ] 在所述方法的一個實施方案中，信號產生于步驟(c)或步驟(d)，且所述信號優選與樣品中SDF-1的濃度相關。
[0242]在一個優選的方面，可在96孔平板中進行所述測定，其中將成分固定在如上描述的反應容器中，并將孔用作反應容器。
[0243]還可將本發明的核酸用作藥物設計的起始材料。主要存在兩種可能方法。一種方法是篩選化合物文庫，而所述化合物文庫優選為低分子量化合物文庫。在一個實施方案中，所述篩選是高通量篩選。高通量篩選優選是在基于靶標的測定中對化合物進行的快速且有效的試錯法(trial-and-eiror)評估。最好是通過比色測量法來進行所述分析。與之相關使用的文庫是本領域技術人員已知的。
[0244]此外，也可將本發明的核酸用于藥物的合理設計。合理藥物設計優選是設計藥學先導結構。從靶標的三維結構開始，用計算機程序把包含許多不同化合物的結構的數據庫搜索一遍，所述三維結構通常通過諸如X射線晶體學或核磁共振光譜學之類的方法來確定。所述選擇通過計算機來完成，隨后可在實驗室中檢測所確定的化合物。
[0245]可從任何本發明的核酸開始進行合理藥物設計，并涉及與本發明核酸的結構相似或與本發明核酸的結構中介導結合的部分相同的結構，優選三維結構。在任何情況下，所述結構仍顯示出與本發明的核酸相同或相似的結合特征。在合理藥物設計中的進一步的步驟中或作為備選步驟，優選用不同于核苷酸和核酸的化學基團來模擬結合到神經遞質的所述核酸的那些部分的三維結構。通過這種模擬，可設計出不同于所述核酸的化合物。所述化合物優選為小分子或肽。
[0246]在例如通過使用本領域技術人員已知的競爭性測定法來篩選化合物文庫的情況下，可發現合適的SDF-1類似物、SDF-1激動劑或SDF-1拮抗劑。這種競爭性測定法可如下建立。將本發明的核酸，優選作為結合靶標的L-核酸的鏡像異構體偶聯至固相。為了鑒定SDF-1類似物，可將經標記的SDF-1加入至所述測定法。潛在的類似物將與SDF-1分子競爭性結合所述鏡像異構體，這將伴隨通過相應標記獲得的信號降低。篩選激動劑或拮抗劑可涉及使用本領域技術人員已知的細胞培養測定法。
[0247]本發明的試劑盒可包含至少一種或幾種本發明的核酸。另外，試劑盒可包含至少一種或幾種陽性或陰性對照。陽性對照可例如是SDF-1，尤其是針對其來選擇本發明核酸或本發明核酸與其結合的SDF-1，優選以液體形式。陰性對照可例如是根據類似于SDF-1的生物物理學性質而限定的肽，但其不會被本發明的核酸所識別。此外，所述試劑盒可包含一種或幾種緩沖液。各種成分可以干燥或凍干的形式，或以溶解于液體中的形式包含在試劑盒中。所述試劑盒可包括一個或幾個容器，所述容器繼而可包含一種或幾種所述試劑盒的成分。再一個實施方案中，所述試劑盒包括說明書或操作手冊，其將有關如何使用試劑盒及其各種成分的信息提供給使用者。
[0248]如本文中所優選使用的，術語治療在一個優選實施方案中也包括預防和/或隨 訪。
[0249]本發明的核酸的藥學和生物分析測定主要用于評估它在幾種人體和非人體的體液、組織和器官中的藥物動力學和生物動力學特性。為此，可使用任何本文公開和本領域技術人員已知的檢測方法。本發明再一方面提供了用于檢測本發明的核酸的夾心雜交測定法。在所述檢測測定法中，使用了捕獲探針和檢測探針。所述捕獲探針與本發明的核酸的第一個部分互補，而檢測探針與本發明的核酸的第二個部分互補。捕獲探針和檢測探針均可由DNA核苷酸、經修飾的DNA核苷酸、經修飾的RNA核苷酸、RNA核苷酸、LNA核苷酸和/或PNA核苷酸形成。
[0250]因此，所述捕獲探針包含與本發明的核酸的5’ -末端互補的片段，而檢測探針包含與本發明的核酸的3’ -末端互補的片段。在所述情況下，將捕獲探針通過其5’ -末端固定至表面或基質，其中所述捕獲探針可在其5’ -末端處直接固定，或通過在其5’ -末端和表面或基質之間的連接子進行固定。但原則上，可將連接子連接至捕獲探針的每個核苷酸。所述連接子可由本領域技術人員已知的親水性連接子形成，或由D-DNA核苷酸、經修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經修飾的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經修飾的L-RNA核苷酸、經修飾的L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
[0251]此外，所述捕獲探針也可包含與本發明的核酸的3’ -末端互補的片段，而所述檢測探針也可包含與本發明的核酸的5’ -末端互補的片段。在該情況下，所述捕獲探針通過其3’ -末端固定至表面或基質，其中所述捕獲探針可在其3’ -末端處直接固定，或通過在其3’ -末端和表面或基質之間的連接子進行固定。但原則上，可將連接子連接至與本發明的核酸互補的片段的每個核苷酸。連接子可由本領域技術人員已知的親水性連接子形成，或由D-DNA核苷酸、經修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經修飾的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經修飾的L-RNA核苷酸、經修飾的L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
[0252]可與本發明的核酸雜交的捕獲探針和檢測探針的核苷酸數是可變的，且可依賴于捕獲和/或檢測探針和/或本發明的核酸自身的核苷酸數。可與本發明的核酸雜交的捕獲探針和檢測探針的核苷酸總數的最大值應是本發明的核酸所包含的核苷酸數。檢測探針和捕獲探針的最小核苷酸數(2-10個核苷酸)應可使它們分別與本發明的核酸的5’ -末端或3’-末端雜交。為了實現在本發明的核酸和存在于所分析的樣品中的其他核酸之間的高的特異性和選擇性，捕獲探針和檢測探針的核苷酸總數應是或最多為本發明的核酸所包含的核苷酸數。
[0253]此外，所述檢測探針優選攜帶如本文先前所描述的可檢測的標記物分子或標記。原則上，可將所述標記或標記物分子連接至所述檢測探針的每個核苷酸。所述標記或標記物優選位于檢測探針的5’ -末端或3’ -末端，其中可在檢測探針內的與本發明的核酸互補的核苷酸與所述標記之間插入連接子。所述連接子可由本領域技術人員已知的親水性連接子形成，或由D-DNA核苷酸、經修飾的D-DNA核苷酸、D-RNA核苷酸、經修飾的D-RNA核苷酸、D-LNA核苷酸、PNA核苷酸、L-RNA核苷酸、L-DNA核苷酸、經修飾的L-RNA核苷酸、經修飾的L-DNA核苷酸和/或L-LNA核苷酸形成。
[0254]可如下檢測本發明的核酸:
[0255]使本發明的核酸以其一端與捕獲探針雜交，且以其另一端與檢測探針雜交。然后，通過例如一個或多個洗滌步驟移除未結合的檢測探針。隨后可測量結合的檢測探針量，所述檢測探針優選攜帶標記或標記物分子。
[0256]如本文優選使用的，除非另有說明，術語“疾病”和“病癥”應可互換使用。
[0257]如本文使用的，術語“包含”優選無意限制所述術語之前的主題或由所述術語所描述的主題。但在備選實施方案中，應將術語“包含”理解為“含有”，從而理解為限制所述術語之前的主題或由所述術語所描述的主題。
[0258]下表中概括了本文所使用的本發明的核酸分子和靶分子SDF-1的各序列標識號、化學性質，其實際序列及內部參考號。
[0259]需知，已用生物素 化的人D-SDF-1 (SEQ.1D.4)在適體(即d_核酸水平(D-RNA))水平表征了所述核酸，或用天然構型的SDF-UL-SDF-1 (人SDF-1 α，SEQ-1D.1)在鏡像異構體(即L-核酸(L-RNA))水平表征了所述核酸。不同的核酸共有一個內部參考名稱(但分別以一個SEQ.1D針對D-RNA (適體)分子，且一個SEQ.1D.針對L-RNA (鏡像異構體)分子)。
[0260]
【權利要求】
1.結合SDF-1的核酸分子，從而該核酸分子以5’一3’方向包含第一核苷酸片段、核心核苷酸序列和第二核苷酸片段，或者按5’ 一3’方向包含第二核苷酸片段、核心核苷酸序列和第一核苷酸片段，其中所述核心核苷酸序列包含下述核心核苷酸序列:GGUYAGGGCUHRXaAGUCGG (SEQ.1D.N0.90)， 其中Xa缺失或為A ； 其中所述第一核苷酸片段的長度和所述第二片段的長度各自分別為4-10個核苷酸。
2.權利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含選自下列序列的核心核苷酸序列: 5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (SEQ.1D.N0.91)，
5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (SEQ.1D.N0.92)，和
5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ.1D.N0.93)。
3.權利要求1的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段的至少一部分和所述第二核苷酸片段的至少一部分任選相互雜交，從而在雜交后形成雙鏈結構。
4.權利要求1的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段的長度和所述第二片段的長度各自分別為4-6個核苷酸。
5.權利要求3的核酸分子，其中所述雙鏈結構包含4-10個堿基對。
6.權利要求5的核酸分子,其中所述雙鏈結構包含4-6個堿基對。
7.權利要求1的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’RKSBUSNVGR3，(SEQ.1D.N0.120)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’YYNRCASSMY 3，(SEQ.1D.N0.121)。
8.權利要求1-4中任一項的核酸分子,其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’XsSSSV 3’ (SEQ.1D.N0.124)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’BSSSXs 3’ (SEQ.1D.N0.125)，其中Xs缺失或為S。
9.權利要求1-4中任一項的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’SSSSR 3，(SEQ.1D.N0.130)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’YSBSS 3，(SEQ.1D.N0.131)。
10.權利要求1-4中任一項的核酸分子,其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’GCSGG 3，(SEQ.1D.N0.128)，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’CCKGC 3，(SEQ.1D.N0.129)。
11.權利要求1的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’UGAGAUAGG3’，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CUGAUU⑶CA 3’。
12.權利要求1的核酸分子，其中所述第一核苷酸片段包含核苷酸序列5’GAGAUAGG3’，且所述第二核苷酸片段包含核苷酸序列5’ CUGAUU⑶C 3’。
13.權利要求1-4中任一項的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ.1D.N0.79-81、83-89,94-119和134-136所示任一核酸序列。
14.權利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子是針對SDF-1的拮抗劑。
15.權利要求14的核酸分子，其中所述核酸分子是所述SDF-1受體系統的拮抗劑。
16.權利要求15的核酸分子，其中所述SDF-1受體系統的所述SDF-1受體是CXCR4受體。
17.權利要求1的核酸分子，其中所述SDF-1是人SDF-1。
18.權利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含修飾物。
19.權利要求18的核酸分子，其中所述修飾物選自HES部分和PEG部分。
20.權利要求19的核酸分子，其中所述修飾物是由直鏈或支鏈PEG構成的PEG部分。
21.權利要求20的核酸分子，其中所述PEG部分的分子量為2-180kD。
22.權利要求20的核酸分子，其中所述PEG部分的分子量為60-140kD。
23.權利要求20的核酸分子,其中所述PEG部分的分子量為約40kD。
24.權利要求20的核酸分子，其中所述修飾物是HES部分，其中所述HES部分的分子量為 10-130kD。
25.權利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子的核苷酸是L-核苷酸。
26.藥物組合物，其包含權利要求1-25中任一項的核酸分子，且任選包含其他組分，其中所述其他組分選自藥學可接受的賦形劑和藥學活性劑。
27.權利要求1-25中任一項的核酸分子在藥物制備中的用途。
28.權利要求27的用途，其中所述藥物被用于治療和/或預防疾病或病癥，其中所述疾病或病癥受SDF-1介導。
29.權利要求28的用途，其中所述疾病或病癥選自眼后部疾病(back-of-the-eyediseases);乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、結腸癌、肺癌和胃癌；骨肉瘤；黑素瘤；神經膠質`瘤；成髓細胞瘤和成神經細胞瘤；白血病；WHIM綜合征；免疫缺陷綜合征；病理性新生血管形成；炎癥；多發性硬化癥；類風濕性關節炎/骨關節炎和腎炎。
30.權利要求29的用途，其中所述疾病或病癥選自糖尿病性視網膜病和老年黃斑變性
31.權利要求27的用途，其中所述藥物被用于抑制血管發生、新生血管形成、炎癥和轉移。
32.包含SDF-1和權利要求1-25中任一項的核酸分子的復合物。
【文檔編號】A61K31/7105GK103555725SQ201310486348
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2007年7月18日 優先權日:2006年7月18日
【發明者】W·普爾斯克, F·雅洛世, D·尤爾伯格, S·克魯斯曼, K·布赫納, C·馬什, N·丁斯 申請人:諾松制藥股份公司