一種藥物組合物及其在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種藥物組合物，其藥效成分由表達SDF-1/HOXB4融合基因的間充質干細胞（MSCs）與CD34+造血干細胞（HSCs）組成。本發明構建了腺病毒表達載體，分別表達SDF-1、HOXB4及其融合蛋白SDF-1/HOXB4，觀察表達SDF-1/HOXB4融合基因的間充質干細胞聯合臍血CD34+干細胞共移植對輻射損傷小鼠的影響，結果表明表達SDF-1/HOXB4融合基因的間充質干細胞（MSCs）聯合臍血CD34+造血干細胞（HSCs）共移植能促進造血重建及植入，提高移植成功率。
【專利說明】一種藥物組合物及其在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種藥物組合物，特別是一種治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物。
【背景技術】
[0002]造血干細胞(Hematopoietic Stem Cells, HSCs)移植是治療血液病、惡性實體瘤放化療引起的骨髓造血功能障礙以及多種缺血性貧血的有效方法之一(Borhane G;MickieB.Transplantation of human hematopoietic repopulating cells:mechanismsof regeneration and differentiation using human—mouse xenografts.CurrentOpinion in Organ Transplantation.2008; 13 (I): 44-52.)。但移植后 HSCs 歸巢率低，且自我增殖能力有限，成為制約骨髓造血重建的瓶頸問題。近年來，隨著人們對骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的基礎和臨床研究進展，很多研究證實MSCs與HSCs聯合移植能促進造血干細胞的植入和造血重建(Fliednei* TM，PowlesR，Sirohi B，et al.Radiologic and nuclear events: the METREP0L severity ofeffect grading system.Blood.2008;111 (12):5757-8 ； Isern J，Martin-AntonioBjGhazanfari R，et al.Self-Renewing Human Bone Marrow MesenspheresPromote Hematopoietic Stem Cell Expansion.LID-S2211-1247 (13)00165-4[pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041 [doi].Cell Rep.2013 ;Isern J，Martin-AntonioBjGhazanfari R，et al.Self-Renewing Human Bone Marrow MesenspheresPromote Hematopoietic Stem Cell Expansion.LID-S2211-1247 (13)00165-4 [pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041 [doi].Cell Rep.2013 ;賈新濤，穆媛媛，賈瀟瀟等.人臍血⑶34+細胞在N0D/SCID小鼠上有效重建造血系統[J].第三軍醫大學學報，2011，33(11) ; 1136-1140.)。MSCs作為造血微環境主要細胞成分能選擇性粘附并支持 HSCs 增殖和遷移(Le Blanc K，Samuelsson H，Gustafsson B，et al.Transplantationof mesenchymal stem celIs to enhanc`e engraftment of hematopoietic stemcells.Leukemia.2007; 21 (8): 1733-8)，在這個過程中趨化因子 SDF-1 及其受體 CXCR4對HSCs的歸巢和植入起到了重要的調節的作用，MSCs高表達的SDF-1能介導HSCs增殖和遷移，吸引其向骨髓回歸定植(Broxmeyer HE，Hangoc Gj Cooper S，et al.AMD3100and CD26 modulate mobilization, engraftment，and survival of hematopoieticstem and progenitor cells mediated by the SDF-1/CXCL12-CXCR4 axis.Ann N YAcad Sc1.2007; 1106:1-19.)。轉錄因子H0XB4對于調節HSCs自我更新與分化間的平衡起著重要作用，能夠有效地增強HSCs自我更新能力(Lu SJj Feng Qj Ivanova Y，etal.Recombinant HoxB4 Fusion Proteins Enhance Hematopoietic Differentiation ofHuman Embryonic Stem Cells.Stem Cells Dev.2007;16(4):547-60 ；Bonde Sj DowdenAM，Chan KMj et al.H0XB4 but not BMP4 confers self-renewal properties toES-derived hematopoietic progenitor cells.Transplantation.2008;86(12):1803—9 ;Tang Y，Chen J，Young NS.Expansion of haematopoietic stem cells fromnormal donors and bone marrow failure patients by recombinant hoxb4.Br JHaematol.2009; 144(4):603-12.)。現有的研究結果提示通過轉入融合基因的MSCs作為飼養層細胞，可以更加有效地在體外擴增臍血CD34+細胞，(張佩，陳婷婷，葉楓等.表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞對造血干細胞體外擴增及干性維持的作用.第三軍醫大學學報.2013.35 (7).589-594.)。但是H0XB4作為轉錄因子過高表達可能會對細胞其他生物學方面造成影響，提高H0XB4的表達水平可增強⑶34+細胞的增殖和自我更新，與此同時也減弱了細胞的短期分化能力(鐘波，葉楓，王濤等.不同活性的survivin基因啟動子片段的克隆及鑒定[J].第三軍醫大學學報，2011，33(11):1115-1118 ；BellΕ.Transplantation:Making space for HSCs.Nature Biotechnology.2008;8(I):4-5)。所以融合基因是否會對造血細胞自身特性或者分化能力造成影響，是否在體內還能發揮同樣功能還需進一步探討和研究。
【發明內容】
[0003]本發明兼顧了造血微環境重建過程中“趨化識別”和“自我更新”，將配體受體結合的特異性同干細胞移植治療促進輻射后造血重建進行組合，構建了腺病毒表達載體，分別表達SDF-1、H0XB4及其融合蛋白SDF-1/H0XB4，觀察表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞聯合臍血CD34+干細胞共移植對輻射損傷小鼠的影響，結果表明表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)聯合臍血⑶34+造血干細胞(HSCs)共移植能促進造血重建及植入，提高移植成功率。
[0004]一種藥物組合物，其藥效成分由表達SDF-1 /H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)與CD34+造血干細胞 (HSCs)組成。
[0005]所述表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)與臍血⑶34+造血干細胞(HSCs)的細胞用量比為8:1。
[0006]所述⑶34+造血干細胞來源于臍血。
[0007]上述藥物組合物在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應用。
[0008]所述骨髓造血功能障礙疾病由輻射引起。
[0009]本發明將表達SDF-1、H0XB4和SDF-1/H0XB4基因的3個腺病毒載體分別轉染正常人骨髓MSCs，將其聯合臍血CD34+細胞經尾靜脈移植到輻射損傷的N0D/SCID小鼠體內(MSCs 8 X IO5 個細胞 / 只，CD34+1 X IO5 個細胞 / 只)，分別為 SDF_l/MSCs+CD34+ 組(SDF-1組)、H0XB4/MSCs+CD34+ 組(H0XB4 組)、SDFl_H0XB4/MSCs+CD34+ 組(S-H 組)，另外 3 組為未轉染MSCs+CD34+組(MSC-HSC組)、單純CD34+組(HSC組)、單純輻照組(IR組)。檢測移植后各組小鼠存活率、外周血象恢復、骨髓病理變化及人源⑶45+細胞植入率。結果表明SDF-1組、H0XB4組、S-H組造血受抑較IR組輕，恢復快，存活率較IR組高(P〈0.05)。以S-H組促造血恢復作用顯著加強，且在移植后6周⑶45+細胞植入率(47.43±8.89%)較其余組高。這說明表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)聯合臍血⑶34+造血干細胞(HSCs)共移植能促進造血重建及植入，提高移植成功率。
【專利附圖】
【附圖說明】[0010]圖1各組小鼠移植后不同時間骨髓組織病理學觀察
[0011]其中:A-F分別為IR組、HSC組、MSC-HSC組、SDF-1組、H0XB4組、S-H組移植后第14天(X400) ；G-K分別為HSC組、MSC-HSC組、SDF-1組、H0XB4組、S-H組移植后第21天(X400)
[0012]圖2.各組小鼠骨髓⑶45+細胞比例【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0014]材料與方法
[0015]I載體及試劑
[0016]分別表達SDF-1、H0XB4 及其融合蛋白 SDF-1/H0XB4 的 pAD-SDF-1-1RES-EGFP、pAD-H0XB4-1RES-EGFP、pAD-SDF-l-(GlySer) 3-H0XB4-1RES-EGFP 腺病毒載體由 申請人:構建，可以對外發放。構建方法見“張佩，陳婷婷，葉楓等.表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞對造血干細胞體外擴增及干性維持的作用.第三軍醫大學學報.2013.35
(7).589-594.”
[0017]培養基DMEM+10%胎牛血清購自Invitrogen公司，MACS磁性分離試劑盒購自Miltenyi公司，FITC標記的鼠抗人CD45及對照IgG2b、IgGl購自BD公司，淋巴細胞分離液TBD公司。
[0018]L 2實驗動物及標本來源
[0019]N0D/SCID雌性小鼠118只，8~10周，體重約為18~22g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。人臍血取自本院婦產科健康孕婦足月順產嬰兒臍帶，每人采集量60~90ml。骨髓取自本院血液科門診骨髓檢查無異常患者，每人采集2~4ml。所有標本采集均獲醫院倫理委員會批準和患者本人及家屬同意。
[0020]1.3細胞分離和培養
[0021 ] 骨髓間充質干細胞按密度梯度離心法分離，方法見(.TunR S，PanchalinRamKM.Rosenberg L.et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells indefined serum-free media [J].Stem Cells International.Volume 2012 (2012),do1:10.1155/2012/123030.鐘波，葉楓，王濤等.不同活性的survivin基因啟動子片段的克隆及鑒定[J].第三軍醫大學學報，2011，33 (11):1115-1118.培養至第3代，0.25%胰酶消化后計數備用。將人臍血標本按照骨髓密度梯度離心法進行單個核細胞分離，利用MASC磁珠系統進行CD34+細胞純化，細胞過柱2次備用。(上述細胞分離和培養的詳細方法見“張佩，陳婷婷，葉楓等.表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞對造血干細胞體外擴增及干性維持的作用.第三軍醫大學學報.2013.35 (7).589-594.”)
[0022]1.4實驗分組設計
`[0023]所有小鼠接受60Co Y射線3.5Gy全身輻照，將小鼠按照完全隨機設計每組各12只分為:①SDF-l/MSCs+CD34+組(SDF-1組):福照后12小時內經尾靜脈分別輸入SDF-1/MSCs (8 X IO5 個細胞 / 只)、CD34+ 細胞(I X IO5 個細胞 / 只)H0XB4/MSCs+CD34+ 組(H0XB4組):H0XB4/MSCs (8 X IO5 個細胞 / 只)、CD34+ 細胞(I X IO5 個細胞 / 只)；? SDF1-H0XB4/MSCs+CD34+ 組(S-H 組):SDFl_H0XB4/MSCs (8 X IO5 個細胞 / 只)、CD34+ 細胞(I X IO5 個細胞/只);④普通MSCs+CD34+組(MSC-HSC組):未轉染MSCs (8 X IO5個細胞/只)、CD34+細胞(IX IO5個細胞/只);⑤單純CD34.組(HSC組):CD34+細胞(IX IO5個細胞/只);⑥單純輻照組(IR組)，0.3ml生理鹽水。
[0024]1.5動態觀察小鼠一般狀況及血象、骨髓組織恢復情況
[0025]每日觀察各組小鼠(n=12)外表、活動力、飲食、排糞等情況并測量體質量，記錄各組存活率。于移植后第7、14、21、28天各組小鼠行斷尾采血，測定白細胞、血紅蛋白和血小板水平。第14、28天各組分別脫頸處死小鼠2只，行瑞氏染色觀察骨髓細胞學學變化。
[0026]1.6流式細胞儀檢測小鼠人源⑶45+細胞植入率
[0027]于移植后第6周脫頸處死一只小鼠，生理鹽水沖出小鼠脛骨、股骨骨髓。制備單細胞懸液，裂解紅細胞后，用鼠抗人FITC標記的⑶45抗體與細胞懸液避光孵育，PBS洗滌后流式檢測。
[0028]1.7統計學處理
[0029]計量資料以f:t S表示，采用SPSS 21.0統計軟件分析，各時間點血液指標比較采用單因素方差分析，方差齊性事后檢驗采用SNK方法分析，方差不齊事后檢驗采用Games-Howell方法分析。各組存活率比較采用卡方檢驗。檢驗水平P〈0.05具有統計學意義。
[0030]2 結果
[0031]I 一般狀況觀 察及小鼠存活率
[0032]各組小鼠在照射后24h均出現被毛凌亂、活動減少、拒食，以后體重逐漸下降。至照后21d時，IR組小鼠全部死亡。移植各組小鼠在移植后7~10d，活動、進食及飲水量逐漸增加，體質量開始恢復。至第14天，各組小鼠存活率差異有統計學意義(P〈0.05，表1)。其中，S-H組(100%)、SDF-1組(83%)、H0XB4組(75%)與IR組(25% )小鼠存活率差異有統計學意義，并且S-H組與HSC組、MSC-HSC組差異有統計學意義(P〈0.05，表2)。至第28天，各組小鼠死亡率差異仍有統計學意義(P〈0.05，表1)，其中S-H組、SDF-1組、H0XB4組分別與IR組、HSC組小鼠存活率差異有統計學意義，并且S-H組與MSC-HSC組小鼠存活率差異有統計學意義(P〈0.05，表2)。
[0033]表1各組小鼠存活率比較
【權利要求】
1.一種藥物組合物，其藥效成分由表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)與⑶34+造血干細胞(HSCs )組成。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，所述表達SDF-1/H0XB4融合基因的間充質干細胞(MSCs)與臍血CD34+造血干細胞(HSCs)的細胞用量比為8:1。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，所述⑶34+造血干細胞來源于臍血。
4.權利要求1至3任一所述的藥物組合物在制備治療骨髓造血功能障礙疾病的藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述·的應用，所述骨髓造血功能障礙疾病由輻射引起。
【文檔編號】A61K35/14GK103585179SQ201310474067
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】張勇, 張佩, 陳婷婷, 范文霞, 錢峰華, 裴莉, 徐雙年, 鄒仲敏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院