一種新型藥物蛋白draco及其在防治豬藍耳病中的應用的制作方法

一種新型藥物蛋白draco及其在防治豬藍耳病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型藥物蛋白DRACO及其在防治豬藍耳病中的應用。本發明利用NCBI上豬相關序列，設計出既有活性又能夠進入細胞的DRACO蛋白編碼基因，然后在原核表達系統中表達并純化出DRACO蛋白，在Marc-145細胞水平上通過qRT-PCR、Western-Blot、細胞上清TCID50檢測及IFA等方法研究其對HP-PRRSV的抗病毒作用，并進一步闡述DRACO在病毒吸附和進入細胞兩個過程中的抗病毒機制。本發明所述方法制得的DRACO對HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成為一種新型的防治豬藍耳病的藥物。
【專利說明】一種新型藥物蛋白DRACO及其在防治豬藍耳病中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域。更具體地，涉及一種新型藥物蛋白DRACO及其在防治豬藍耳病中的應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse, PRRSV)引起。該病最早于1987年在美國爆發，隨后蔓延到歐洲，我國于1996年分離到該病毒。目前，根據基因組序列和抗原性差異，將PRRSV分為兩種基因型，一種以Lelystad Virus (LV)毒株為代表的歐洲型，另一種以ATCC VR-2332毒株為代表的美洲型。在我國，PRRSV主要以美洲型為主，但據報道也分離到歐洲型毒株。2006年，我國爆發了豬高熱病，對養豬業造成嚴重的經濟損失，后來將此毒株定義為高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV )。PRRS主要引起妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年齡段豬特別是仔豬呼吸道癥狀，特征性病變為間質性肺炎，死亡率極高，是一種高度接觸性的全球性的重要傳染病。
[0003]PRRSV屬于尼多病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，電鏡下觀察病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜。病毒基因組為一條單股正鏈RNA，全長約為15Kb，含有5'和3'非編碼區，中間為10個開放閱讀框(openreading frame, ORF),其中 0RF2-7 分別翻譯病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它們不僅是病毒粒子的主要組成部分，而且在病毒粒子的包裝、成熟、免疫逃避及抗體誘導中產生重要的作用。
[0004]PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難于防控主要表現在以下幾方面:(1)嗜巨噬細胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs) , PAMs是免疫細胞,破壞PAMs,從而破壞機體免疫系統,從而引起免疫抑制；(2)抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個原因，疫苗沒有交叉保護力；(3)抗體依賴性增強，PRRSV的感染會刺激機體產生抗體，但低效價的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進作用；(4)病毒持續性感染，PRRSV感染后，能夠長時間在豬體內檢測到病毒血癥；(5)混合感染，目前臨床上混合感染，特別是圓環病毒、副豬嗜血桿菌等與PRRSV的混合感染使PRRSV防控難上加難。
[0005]目前PRRSV防控主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，臨床上用的較多的是弱毒疫苗。其中滅活疫苗有如下缺點:(1)需要大劑量接種或應用濃縮抗原，免疫期短，常需強化接種；(2)不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；(3)產生完全免疫力需要2-3周，不利于緊急預防接種與降低疫苗費用；(4 )存在滅活不徹底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返強、重組及潛在感染的危險。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越來越多的問題。
【發明內容】

[0006]本發明為了克服現有防控PRRSV病毒的疫苗存在的問題，研究尋找一種對PRRSV病毒有很好的抗病毒效果的藥物，能夠更好地防治豬藍耳病。
[0007]本發明的目的在于提供一種有活性且能夠進入細胞的新型藥物蛋白DRACO的編
碼基因。
[0008]本發明的另一目的在于提供一種有活性且能夠進入細胞的新型藥物蛋白DRACO。
[0009]本發明的又一目的是提供上述蛋白DRACO在制備抗病毒病藥物中的應用。
[0010]優選地，所述的病毒是在轉錄和復制過程中能夠產生長的dsRNA螺旋區的病毒。
[0011]更優選地，所述的病毒是PRRSV病毒。
[0012]上述DRACO基因序列為SEQ ID N0.1所示。DRACO氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示，DRACO蛋白由3部分組成:轉導標簽、dsRNA檢測結構域及細胞凋亡誘導結構域。
[0013]轉導標簽為PTD且存在于蛋白N端，氨基酸序列為SEQ ID N0.3。dsRNA檢測結構域氨基酸序列為DRACO蛋白氨基酸序列的第14位到第194位，如SEQ ID N0.6，細胞凋亡誘導結構域氨基酸序列為DRACO蛋白氨基酸序列的第195位到第291位，如SEQ ID N0.7。
[0014]一種原核表達載體，是由出發載體PET-28A的多克隆位點插入DRACO基因序列SEQID N0.1構建而成。
[0015]一種重組原核表達菌株，含有上述DRACO的編碼基因序列。
[0016]DRACO抗病毒機制為:大部分病毒在轉錄和復制過程中都會產生長的dsRNA螺旋區，而未被感染的細胞不會產生，故被病毒感染的細胞能被DRACO檢測到，啟動細胞凋亡信號通路，從而使病毒感染的細胞凋亡，而正常細胞不受影響。
[0017]PRRSV病毒在轉錄和復制過程中會產生較長的dsRNA螺旋區，故本發明研究DRACO對PRRSV病毒的防治作用，并已在細胞水平證明DRACO對PRRSV有很好的抗病毒效果。
[0018]本發明上述目的通過以下技術方案予以實現:
首先根據NCBI上豬的相關基因序列設計DRACO蛋白編碼基因，然后利用大腸桿菌原核表達系統表達并純化出DRACO蛋白 ，進而在細胞水平上研究DRACO對HP-PRRSV的抗病毒效果。具體實驗設計如下:
根據 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)查找獲得的豬蛋白激酶 R (ProteinKinase R, PKR)(即dsRNA檢測結構域)(序列號為AB104654.1)基因部分序列(如SEQ IDN0.4所不)和細胞凋亡蛋白酶激活因子I (apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1，序列號為AF013263.1)的基因部分序列(如SEQ ID N0.5所示)，N端加上轉導肽序列PTD，設計得到DRACO蛋白編碼基因，序列為SEQ ID N0.1所示。
[0019]將設計得到的DRACO序列送生工生物工程(上海)有限公司(http://sangon.com/)合成；將合成得到的DRACO蛋白編碼基因克隆到原核表達載體pET_28A，構建得到原核表達載體pET-DRACO，然后在表達菌株BL21 (DE3)中IPTG誘導表達；最后經過純化得到DRACO蛋白。
[0020]DRACO細胞毒性試驗:AlamarBlue (購自Invitrogen公司)作為活細胞代謝指示劑，在線粒體酶促還原反應下會產生可測量的熒光代謝產物，通過測定其熒光強度可監測細胞活性。使用多功能酶標儀分別讀取540nm激發光和590nm發射光熒光值，制作DRACO細胞毒性圖。[0021]DRACO抗病毒試驗:用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養Marc-145細胞至細胞匯合度為60-70%，棄去培養液，PBS洗3次，分別加入含MOI=0.1和I (空斑形成單位PFU=0.7XTCID50,感染復數MOI=病毒數/細胞數)HP-PRRSV病毒的2%胎牛血清的DMEM培養液，37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，加入不同濃度的DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液，37°C培養36h，收集上清做TCID5tl檢測；收集細胞做qRT_PCR(N基因定量引物見SEQ IDN0.8 和 SEQ ID N0.9)和 Western-Blot 檢測。
[0022]DRACO 抗病毒間接免疫突光試驗(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA):同上抗病毒試驗方法，收集細胞，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS洗lOmin，10%Triton_100穿孔15min，PBS洗lOmin，然后用PBS稀釋的1%BSA封閉30min，加入抗PRRSV病毒N蛋白的一抗，室溫Ih,再加入抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗IOmin,然后在突光顯微鏡下觀察DRACO抗病毒效果。
[0023] DRACO抗病毒機制研究:(I )DRAC0是否通過影響HP-PRRSV吸附Marc-145細胞從而達到抗HP-PRRSV的目的的研究:首先，當Marc-145細胞在6孔板中匯合度為70%時，PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并加入濃度梯度的DRACO，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培養箱中培養24h，收集細胞對N基因做qRT-PCR和Western-Blot檢測；
(2) DRACO是否通過抑制HP-PRRSV進入Marc-145細胞來達到抗HP-PRRSV的目的的研究:首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然后加入濃度梯度的DRACO的營養液在5%C02、37°C培養箱中培養6h，PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，收集細胞進行Western-Blot檢測；
(3 )當PRRSV進入細胞4h和6h后，PG-1是否還有抗病毒作用的研究。首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗
3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培養箱中培養4h和6h，PBS洗3次，分別將濃度為40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養6h，PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞進行 Western-Blot 檢測。
[0024]統計學分析。以上所有試驗至少3次獨立重復，結果采用平均值和標準誤表示，使用泣t 來分析。所有統計分析均采用以八％ 作為具有顯著統計學差異的檢驗標準，分析軟件為SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0025]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:
本發明首次設計得到一種新的防治豬藍耳病的藥物DRACO蛋白，最終設計并合成的DRACO具有活性且能夠進入細胞發揮作用。
[0026]通過TCID5(1、qRT-PCR、IFA 及 Western-Blot 等多種方法證明了 DRACO 對 HP-PRRSV有很好的抗病毒作用，為研制抗豬藍耳病的新型藥物奠定了基礎。
[0027]本發明對DRACO抗HP-PRRSV的機制進行了研究，包括病毒吸附細胞和進入細胞兩個過程的研究。結果表明DRACO能夠顯著性地降低N基因和N蛋白表達水平，且隨著DRACO濃度的升高，抑制效果更明顯，且DRACO抗病毒作用主要發生在PRRSV進入細胞過程中，當PRRSV進入細胞4h和6h后，DRACO抗病毒效果不明顯。【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為DRACO原核表達SDS-PAGE圖。
[0029]圖2為DRACO表達后純化圖。1:100mM咪唑緩沖液洗脫；2:300mM咪唑緩沖液第一次洗脫；3:300mM咪唑緩沖液第二次洗脫。
[0030]圖3為DRACO細胞毒性試驗結果統計圖。
[0031]圖4為DRACO抗病毒試驗中，分別經不同濃度DRACO處理后的HP-PRRSV感染的Marc-145細胞上清中的病毒滴度圖。
[0032]圖5為DRACO抗病毒試驗中，經80mg/L DRACO作用36h后，N基因相對于內參GAPDH的表達水平圖。
[0033]圖6為DRACO抗病毒試驗中，經不同濃度DRACO處理36h后，N蛋白表達水平圖。
[0034]圖7為DRACO抗病毒間接免疫熒光試驗檢測DRACO抗病毒效果圖；綠色為抗PRRSVN蛋白顏色，藍色為Hoechst染細胞核顏色。
[0035]圖8為DRACO抗病毒機制一病毒吸附細胞過程中，N基因相對于內參GAPDH的表達水平圖。
[0036]圖9為DRACO抗病毒機制一病毒吸附細胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0037]圖10為DRACO抗病毒機制一病毒進入細胞過程中，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0038]圖11為DRACO抗病毒機制一病毒進入細胞4h后，N蛋白Western-Blot檢測圖。
[0039]圖12為DRACO抗病毒機制一病毒進入細胞6h后，N蛋白Western-Blot檢測圖。
【具體實施方式】
[0040]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試驗方法、試劑以及設備為本【技術領域】常規方法、試劑和設備。
[0041]實施例1 DRACO基因設計合成與表達分析
1、DRACO基因設計合成:根據NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)查找獲得的豬蛋白激酶R (Protein Kinase R, PKR)(序列號為AB104654.1)基因部分序列(如SEQ IDN0.4所不)和細胞凋亡蛋白酶激活因子I (apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1，序列號為AF013263.1)的基因部分序列(如SEQ ID N0.5所示)，N端加上轉導肽序列PTD，PTD氨基酸序列為SEQ ID N0.3所示，設計得到DRACO蛋白編碼基因，序列為SEQ IDN0.1所示。該基因編碼的DRACO蛋白氨基酸序列為SEQ ID N0.2。將設計得到的DRACO序列送生工生物工程(上海)有限公司(http://sangon.com/)合成。
[0042]2、構建DRACO基因重組原核表達菌株:將上述合成得到的DRACO基因克隆到原核表達載體PET-28A，構建得到原核表達載體pET-DRACO，其插入酶切位點為Kpn I和HindIII;然后將原核表達載體pET-DRACO轉化菌株BL21 (DE3)感受態細胞，Kan+抗性篩選、鑒定、測序，陽性重組表達菌株甘油保存于-80° C冰箱。
[0043]3、重組表達菌株的誘導表達:吸取上述甘油保種的重組大腸桿菌50 μ L，加入裝有5mL Kan+抗性的LB液體培養基的細菌培養瓶，37° C振蕩培養過夜，分別吸取上述復蘇的菌液50 μ L，加入兩個裝有200mlLKan+抗性的LB液體培養基的細菌培養瓶，37° C搖床培養4h，至OD6tltl達到0.6~1.0時，一瓶加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L (5 μ I)誘導表達，另一瓶不加，做好標記，繼續培養3h后,8000rpm離心2min收集菌體。
[0044]4、DRACO可溶性分析:用500 μ ILPBS懸浮菌體，選擇合適的浮漂，置于冰水中，清洗3次，選取合適的探頭(探頭置于液面下，防止產生泡沫)，調節工作時間IOmin ;調節破碎5S，停止5S ;選擇功率30% (150 W)，破碎完成后于4° C 12000rpm離心15~20min，收集上清液，沉淀用300 μ ILPBS懸浮，于-80° C保存。
[0045] 5、DRACO蛋白SDS-PAGE鑒定:取上清液和懸浮的沉淀40 μ L，加入10 μ L的
5X loading buffer,沸水中煮IOmin,進行SDS-PAGE分析,分析DRACO表達蛋白的可溶性。見附圖1，圖中I為未加IPTG誘導表達，2為IPTG誘導表達，M為預染蛋白分子Marker。
[0046]實施例2 DRACO蛋白的純化
利用His-tag過柱純化DRACO蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(購自Thermo Scientific公司，貨號:23227)測定DRACO蛋白濃度。
[0047]1.準備好蛋白樣品，憐酸鹽緩沖液、Binding buffer、Washing buffer、Elutionbuffer、20%乙醇、蒸餾水，在鐵架臺上裝好N1-NTA層析柱。
[0048]2.用注射器加入柱體積(5mL) 4倍的ddH20清洗N1-NTA層析柱，平衡層析柱，用柱體4倍體積的Binding buffer,平衡柱子,Binding buffer起了粘附作用，目的是為了接下來的，過濾含Hi s標簽的蛋白粘附在N1-NTA樹脂，將含Hi s標簽的過濾好的蛋白，用相同的方法，加到裝有N1-NTA樹脂的層析柱。
[0049]3.用柱體積的4倍的Washing buffer,用相同的方法注入到裝有N1-NTA樹脂的層析柱去除一些弱結合和非特異性結合的目的蛋白，用柱體積4倍的Elution buffer，用相同的方法注入N1-NTA層析柱從鎳柱上洗脫下帶有His標簽的目的蛋白，用1.5mlLEP管分裝，每管lmL，-80° C保存。
[0050]4.用柱體積4倍的含300mM咪唑的磷酸鹽緩沖液，注入N1-NTA層析柱，除去所有雜蛋白，清洗層析柱，用柱體積的4倍的ddH20，清洗裝有N1-NTA樹脂的層析柱，保存層析柱，用柱體積的4倍的20%乙醇清洗N1-NTA層析柱后，4° C保存。純化得到的DRACO蛋白進行SDS-PAGE分析，結果如圖2。
[0051]實施例3 DRACO細胞毒性試驗
AlamarBlue (購自Invitrogen公司)作為活細胞代謝指示劑,在線粒體酶促還原反應下會產生可測量的熒光代謝產物，通過測定其熒光強度可監測細胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養Marc-145細胞至60_70%，棄去培養液，加入含DRACO倍比稀釋的營養液作用36h，設定PBS對照組，然后加入10% (V/V)比例AlamarBlue繼續培養3h，使用多功能酶標儀分別讀取540nm激發光和590nm發射光熒光值，制作DRACO細胞毒性圖。見附圖3，以PBS對照組細胞活性作為100%，倍比稀釋的DRACO處理的細胞的熒光值比上PBS對照組熒光值即為不同濃度下DRACO相對細胞活性，由圖3可知，當DRACO濃度為80mg/L時，其對Marc-145細胞沒有毒性，細胞活性100%，此濃度即為后面試驗的最大濃度。
[0052]實施例4 DRACO抗病毒試驗
1.在含10%胎牛血清的DMEM培養基的6孔板中培養Marc-145細胞至細胞匯合度70%時，棄去培養液，PBS洗3次，分別以MOI=0.1和I接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37 °C繼續培養5h。[0053]2.PBS洗3遍，將濃度為80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，并設PBS對照組，PBS洗3遍，每孔加400 μ L Trizol，提RNA,做qRT-PCR檢測。結果見圖5，結果表明在轉錄水平上，DRACO可顯著性地降低N基因表達水平。
[0054]3.同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，分別將濃度為40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，并設PBS對照組，收集ImL上清做TCID5tl檢測，結果見圖4，結果表明DRACO可顯著性地減少細胞上清中的病毒產量，抑制病毒釋放到細胞上清中。另外棄去剩余培養液，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解細胞，測蛋白濃度，Western-Blot檢測，結果見圖6，結果表明在蛋白翻譯水平上，DRACO可明顯的降低N蛋白表達水平。
[0055]4.在含10%胎牛血清的DMEM培養基的12孔板中培養Marc-145細胞至細胞匯合度70%時，棄去培養液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培養液中37°C繼續培養5h，PBS洗3遍，分別將濃度為40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養36h，并設PBS對照組，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS 洗 lOmin，10%Triton_100 穿孔 15min，PBS 洗 lOmin，然后用 PBS 稀釋 1%BSA 封閉 30min，抗PRRSV N蛋白一抗室溫lh，抗鼠二抗作用lh，Hoechst染核5min，PBS洗lOmin，IFA檢測。結果見圖7，由圖7可知，DRACO濃度為40、60、80mg/L時，PRRSV病毒N蛋白熒光值明顯低于PBS對照組，表明PRRSV病毒N蛋白幾乎沒有在細胞中表達，即說明DRACO抗病毒效果明顯，且當DRACO濃度為80mg/L時,抗病毒效果最明顯。
[0056]實施例5 DRACO抗病毒機制研究:HP_PRRSV吸附抑制試驗
1.在Marc-145細胞匯合度7 0%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分別加入濃度為40、60、80mg/L DRACO，4°C孵育2h。
[0057]2.PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培養箱中繼續培養24h，棄去培養液，PBS洗3次，收集細胞，每孔加400 μ L Trizol,提RNA，對N基因做qRT-PCR檢測，見圖8 ;裂解細胞，測蛋白濃度，Western-Blot檢測，見圖9，結果表明DRACO能夠顯著性地降低N基因和N蛋白表達水平，且隨著DRACO濃度的升高，抑制效果更明顯，說明在HP-PRRSV吸附細胞過程中，DRACO有抗病毒效果。
[0058]實施例6 DRACO抗病毒機制研究:HP_PRRSV進入抑制試驗
1、在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h。
[0059]2、PBS洗3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，然后分別加入濃度為40、60、80mg/L DRAC0，在 5%C02、37°C培養箱中培養 6h。
[0060]3、PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞進行Western-Blot檢測，見圖10，結果表明在HP-PRRSV進入細胞過程中，DRACO有很好的抗病毒效果，甚至濃度為40mg/L時，都檢測不到N蛋白表達水平，說明DRACO抗病毒作用主要發生在PRRSV進入細胞過程中。
[0061]4、當PRRSV進入細胞4h和6h后，PG-1是否還有抗病毒作用。首先，在Marc-145細胞匯合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗
3次，將未吸附到細胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培養箱中培養4h和6h，PBS洗3次，分別將濃度為40、60、80mg/L DRACO的2%胎牛血清的DMEM培養液加入細胞37°C培養6h，PBS洗3次，換新鮮的含2%胎牛血清的營養液繼續培養24h，棄去營養液，PBS洗3遍，收集細胞Western-Blot檢測，見附圖11 (4h)和12 (6h)，結果表明，當HP-PRRSV在37°C進入細胞4h和6h后再用不同濃度DRACO處理，DRACO抗病毒效果不明顯，只有當DRACO濃度為80mg/L時,才有抗病 毒效果,說明在病毒進入細胞后，DRACO抗病毒效果不明顯。
【權利要求】
1.一種新型藥物蛋白DRACO的編碼基因，其特征在于，DRACO基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種新型藥物蛋白DRAC0，其特征在于，DRACO的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.根據權利要求2所述新型藥物蛋白DRAC0，其特征在于，該蛋白由3部分組成:轉導標簽、dsRNA檢測結構域及細胞凋亡誘導結構域，其中轉導標簽為PTD且存在于蛋白N端，PTD氨基酸序列為SEQ ID N0.3。
4.根據權利要求3所述新型藥物蛋白DRAC0，其特征在于，所述的dsRNA檢測結構域氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，細胞凋亡誘導結構域氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
5.一種重組原核表達載體，其特征在于，由出發載體的多克隆位點插入權利要求1所述SEQ ID N0.1基因序列。
6.一種重組原核表達菌株，其特征在于含有權利要求1所述DRACO的編碼基因序列。
7.權利要求1所述DRACO的編碼基因在制備抗病毒病藥物中的應用。
8.權利要求2所述新型藥物蛋白DRACO在制備抗病毒病藥物中的應用。
9.根據權利要求7或8所述應用，其特征在于，所述的病毒是在轉錄和復制過程中能夠產生長的dsRNA螺旋區的病毒。
10.根據權利要求7或8所述應用，其特征在于， 所述的病毒是PRRSV病毒。
【文檔編號】A61P31/14GK103571863SQ201310469225
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】劉小紅, 郭春和, 莫德林, 陳瑤生, 高進濤 申請人:中山大學