雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株(hf2株)及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于獸醫生物醫藥領域，涉及一株雞傳染性支氣管炎疫苗株HF2及該疫苗株在防制雞傳染性支氣管炎中的應用和應用效果。本發明疫苗株的微生物保藏號是：7708。本發明公開的疫苗株安全性良好，對雞傳染性支氣管炎具有良好的保護效力。該疫苗株可用于制備防治雞傳染性支氣管炎的滅活單苗或聯苗，毒株經致弱后可用于制備防治雞傳染性支氣管炎的弱毒活疫苗或聯苗。
【專利說明】雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株(HF2株)及其應用
[0001]【技術領域】
[0002]本發明屬于獸醫生物新醫藥【技術領域】，涉及一株雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株及其應用。
【背景技術】
[0003]雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis virus)引起的一種急性高度接觸性傳染病,該病流行范圍廣，有養雞的地方就有該病的存在。各品種、各日齡的雞均可感染，除引起支氣管炎表現咳嗽、噴嚏、氣管羅音等呼吸道癥狀外，在產蛋雞會造成產蛋下降、蛋品質降低，有些毒株還會造成腎臟病變，嚴重時造成死亡。IBV感染引起的家禽生產指標下降以及為防控病毒感染投入的疫苗和其他人力物力，造成巨大的經濟損失，是危害養雞生產的最重要頑疾之一。
[0004]雞傳染性支氣管炎歷史悠久，自1930年在美國北達科塔州首次發現至今已近百年。在傳支防控上除嚴格生物安全措施外，接種疫苗以提高雞群的抗感染能力是常規手段，傳支病毒變異頻繁，血清型之間交叉保護差甚至沒有交叉保護，隨著新的血清型的出現，不斷有新的毒株被研發制造疫苗用來防控疾病。有些疫苗株廣泛使用如H120系列的疫苗，也有些疫苗局限在當地或幾個地方使用如Ark、4/91等。
[0005]疫苗的使用確實對傳支的控制做出了巨大貢獻。但是，在疫苗的密集使用下傳支仍時有發生，且不斷有新的變異株出現，傳染性支氣管炎病毒變異株眾多，單一疫苗株只能對同源的毒株產生免疫力，而對異源毒株只能提供部分保護或根本不保護，被公認為傳支防控的難題。
[0006]我國在1953年已有呼吸型IB的報道，1982年鄺榮祿等在廣東首次報道腎型IB發生。Mass型疫苗(H120、H52)是使用最為廣泛的疫苗，而且直到90年代Mass型疫苗仍可以很好的控制傳支的流行，之后不斷有變異株突破H120的防疫，在免疫了 H120的雞群中分離到高致病的傳支毒株像HF2株、QX株、Ql株、A2株、LX4株等。目前廣泛使用的疫苗仍然是Mass型疫苗，主要有H52、H120、Ma、W93等毒株，而對新的流行株這些疫苗株已經不能夠提供足夠保護作用，因此急需研發新的適用當前流行情況疫苗株。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是針對現有傳支疫苗毒株不適應新的流行毒株的問題，從臨床發病雞群中篩選出安全高效且能代表當前流行情況的毒株，用該毒株制備疫苗能更好的防制雞傳染性支氣管炎。
[0008]本發明所要解決的技術問題是通過如下途徑`實現的:
本發明提供一種雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株HF2，微生物保藏號是:CGMCC N0.7708,分類命名:禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus);保藏時間2013年5月31日；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地點:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。[0009]本發明提供的IBV疫苗株HF2的來源于:
2007年安徽某雞場23日齡的青腳麻雞發生類似傳支疾病，臨床上表現為呼吸道癥狀，剖檢主要為腎臟病變腎臟腫大呈“花斑腎”，采集病死雞腎臟，進行了病毒的分離鑒定、PCR擴增、雞胚血清中和試驗、動物回歸實驗等病原生物學特性研究，得到一株可代表現在流行毒株的禽傳染性支氣管炎病毒，命名為IBVHF2株。[0010]IBVHF2株具有如下特性:
(I)病毒適應雞胚后，在接毒后144小時雞胚呈現發育小、蜷縮、內臟有尿酸鹽沉積等病變。
[0011](2)病毒回歸7日齡SPF雞可復制出和上述臨床發病一樣病例，主要表現呼吸道癥狀、消瘦等，死亡率20-40%，剖檢可見氣管有炎性滲出物，腎臟腫大，尿酸鹽沉積等病變。
[0012](3)該病毒的SI基因序列為seq Nol.與疫苗株的同源性不到78%。
[0013](4)將HF2、M41株陽性血清分別與臨床分離毒株進行雞胚中和實驗，結果顯示:HF2株對最近分離到的毒株保護效果最好。
[0014]本發明提供的雞傳染性支氣管炎病毒有益效果如下:
IBVHF2毒株分離自臨床發病雞群，與當前流行毒株同源性高，通過以下兩種途徑:一、直接滅活后制備滅活苗；二、通過雞胚連續傳代得到安全無致病力且保留免疫原性的弱毒株生產弱毒疫苗；作為疫苗生產用種毒，有針對性預防臨床流行毒株，有效解決了免疫Mass型疫苗后依然發病的現狀。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明提供的毒株應用領域和形式構成任何限制。
[0016]實施例1傳染性支氣管炎病毒HF2毒株分離鑒定 一、病毒的分離培養
無菌采集病死雞腎臟，按1:5的比列加入滅菌生理鹽水，研磨，凍融3次，5000rpm離心20min，上清液濾過除菌后尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0.2ml，雞胚37°C孵育,每天照胚2次，棄去24小時之內的死亡胚，96小時取5枚收獲尿囊液，其余繼續孵育至144小時，記錄雞胚病變情況。如此盲傳5代。收獲的病毒存于-80°C。至第3代雞胚呈現典型的傳支病毒病變，表現雞胚發育遲緩、胚體蜷縮失水等。至第5代測定病毒含量為105.5EID50/0.1mlo
[0017]二、病毒鑒定 1、血凝性
1-5代收獲的尿囊液進行血凝試驗。結果各代次尿囊液對1%的雞紅細胞均不發生凝集，病毒無血凝性，排除為正粘病毒、副粘病毒、腺病毒等有血凝性的禽類病毒的可能性。
[0018]2、PCR 鑒定
第五代尿囊液200微升，TAKARA公司RNA提取試劑RNAiso Plus提取病毒RNA，用OIE推薦的SI高變區引物進行RT-PCR。上游5’ -TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3’下游:5’-CNG-TRT-TRT-AYT-GRC-A-3’，目的條帶700bp左右。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果在700bp左右有目的條帶，證明分離病毒為IBV。[0019]3、傳支SI基因測序與分析
第五代尿囊液200微升，TAKARA公司RNA提取試劑RNAiso Plus提取病毒RNA，用擴增SI基因全長的引物進行RT-PCR。IBVSl上游:AACAAAAGACAGACTTAGT，IBVSl下游:AACTGTTAGTTATGAGCAC ;產物長度1800bp左右。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶清晰無雜帶，直接送至上海美吉公司測序。序列拼接后全長1788bp。序列見SEQ IDNO:1。
[0020]IB VHF2 SI 基因序列提交 Gene bank, Accession No:JX080381。與H120 (EU822341)、H52 (AF352315)、W93 (AY842862)、M41 (DQ664534) ,4/91 (JN192154)、LDT3-A (AY702975)等疫苗株的SI基因進行多重比對，同源性較低均低于85%，分別為77.9%,77.8%,77.7%,77.8%,79.0%、84.5%。與疫苗株相比 IBVHF2 和 LDT3-A 在 70-72 為有3個堿基的插入，IBVHF2、LDT3-A和4/91在361-367有7個堿基插入，此外IBVHF2S1還有多處核苷酸發生變異。Si基因編碼的纖突蛋白位于病毒的表面，誘導機體產生中和抗體，與機體的保護反應密切相關。Si基因是病毒演化過程中最易發生變異的基因，其序列相差大于5%可能就不能產生或不能完全產生交叉保護作用。
[0021]4、動物回歸試驗
7日齡SPF雞10只，滴鼻點眼途徑接種第五代病毒，50微升每只，雞群在攻毒2天后開始出現臨診癥狀，6天后開始有雞只死亡，發病率為100% (10/10)，死亡率為40% (4/10)。發病雞表現出輕度呼吸道癥狀，部分雞精神不振，拉稀，飲水增多，采食量下降。病死雞極度消瘦，剖檢可見腎臟腫大、花斑腎、氣管出血、氣管粘液等。從第10天以后臨床癥狀逐漸出現好轉，到攻毒后14天，基本上恢復正常。用分離到的傳支病毒感染易感雛雞可復制出臨床病例。
[0022]5、血清中和試驗` 5.1 IBVHF2毒株陽性血清制備:20日齡SPF雞20只飼養于負壓隔離器中，滴鼻點眼途徑接種IBVHF2第五代毒，劑量0.1ml/只，10天后將沒有死亡的小雞頸部皮下注射IBVHF2油乳劑滅活苗0.3ml, 14天后再次頸部皮下注射HF2油乳劑滅活苗0.5ml, 10天后心臟采血，無菌分離血清，按每毫升2000單位加入青鏈霉素，分裝備用。
[0023]5.2血清雞胚半數保護量測定:采用固定病毒稀釋血清的方法，IBVHF2、M41病毒分別用滅菌生理鹽水稀釋至200個EID50/0.lml,M41陽性血清(購自中國獸醫藥品監察所)與上述自制IBVHF2陽性血清分別用滅菌生理鹽水2倍倍比稀釋，各稀釋度血清(2_5-2_8)分別與相應病毒等量混合，室溫中和lh，每組尿囊腔接種6枚10日齡的SPF雞胚，0.2ml/枚，接種后繼續孵化至6天后記錄雞胚感染數,參照Reed和Muench方法,計算雞胚半數保護量(Ero5tl)。結果見表1。
[0024]表1血清的雞胚半數保護量
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_ WivmM.HTO5_%l_5fi)LfiO-121
5.3雞胚中和試驗:采用固定病毒(200個EID5tl)固定血清(20個EPD5tl)的方法，將以上2種陽性血清與12株2007-2010年間臨床分離株和疫苗毒株M41株、IBVHF2株等量混合，置室溫中和I小時，分別尿囊腔接種6枚10日齡的SPF雞胚，0.2ml/枚，接種后繼續孵化至6天后記錄雞胚感染數。結果見表2。
[0025]表2雞胚中和試驗結果
【權利要求】
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株IBVHF2，微生物保藏號CGMCC No是7708。
2.一種疫苗組合物，其特征在于包含滅活的如權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株和藥學上可接受的佐劑。
3.一種疫苗組合物，其特征在于包含致弱的如權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株和藥學上可接受的凍干保護劑。
4.權利要求1所述的疫苗株IBVH`F2在制備防制禽傳染性支氣管炎藥物中應用。
【文檔編號】A61K39/215GK103497934SQ201310463171
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月8日 優先權日:2013年10月8日
【發明者】許秀梅, 毛火云, 王偉 申請人:南京天邦生物科技有限公司