一種疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種新城疫病毒融合蛋白，該融合蛋白包括F蛋白中的兩個保護性抗原片段F1蛋白和F2蛋白，還包括HN蛋白。其中，所述F1蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，所述F2蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.4，所述HN蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.6。本發明還公開了含免疫量的新城疫病毒融合蛋白的疫苗組合物及其在預防和/或治療基因VII型新城疫病毒中的應用。該新城疫疫苗組合物能同時產生細胞免疫和體液免疫；還對基因VII型的新城疫病毒均能產生保護性免疫，具有廣譜性。
【專利說明】-種疫苗組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種疫苗組合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 新城疫（New castle Disease, ND)俗稱亞洲雞癌，是由新城疫病毒（New castle Disease Virus, NDV)引起的一種可導致禽類急性、高度接觸性、致死性傳染病，常呈敗血 癥，W呼吸困難、下癡、神經機能奈亂、黏膜和漿膜出血為主要特征，是當今全球范圍內最嚴 重的家禽傳染病之一，被世界動物衛生組織（0IE)列為A類傳染病。
[000引 自1926年發現ND W來，ND已經發生了四次大流行。從臨床上分離到的NDV毒株 基因型來看，目前流行的ND主要是由基因VII型NDV為主的毒株所致，使我國的養禽業遭 受了巨大的經濟損失。目前，接種疫苗仍然是預防和控制新城疫病毒大流行的最有效手段。
[0004] NDV屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、腮腺炎病毒屬禽副粘病毒血清1型，是有囊 膜的負鏈、不分階段的RNA病毒。現有的NDV只有一個血清型，但各毒株之間的毒力、對動物 的致病性均有很大的差異。其基因組結構模式為3' -NP-P-M-F-HNA-5'的，依次編碼6種特 異性的結構蛋白；核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP)、磯蛋白（陸OS地0 protein，P)、 基質蛋白（Matrix protein, M)、融合蛋白（F^ision protein, F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白 (Heamagglutinin-Neuraminidase protem, HN)、大分子蛋白（Large protein, L)〇 其中，HN 蛋白和F蛋白構成囊膜外表面的纖突，與NDV的致病性密切相關；并且，該兩種蛋白是NDV 的功能性糖蛋白，是重要的宿主保護性抗原，具有良好的免疫原性。
[0005] 在感染過程中，首先，HN蛋白介導病毒識別，并吸附于細胞表面含唾液酸的受體， W參與病毒粒子的感染；然后，F蛋白通過釋放融合多膚，促進病毒囊膜與宿主細胞膜表面 脂蛋白膜的融合，從而促進核衣殼釋放到胞漿中，使病毒基因組進入宿主細胞，發揮致病作 用。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種新型的新城疫病毒融合蛋白，W及含免疫量的新城疫病毒融合 蛋白的疫苗組合物及其應用。該疫苗組合物能同時產生細胞免疫和體液免疫；還對基因 VII型的新城疫病毒均能產生保護性免疫，具有廣譜性。
[0007] 本發明的主要目的在于提供一種新城疫病毒融合蛋白，包括；（1) F蛋白中的兩個 保護性抗原片段F1蛋白和巧蛋白；（2) HN蛋白。
[000引優選地，所述的F1蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2,所述的巧蛋白的氨基酸序 列為SEQ ID NO. 4,所述的HN蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 6。
[0009] 更優選地，所述的FI蛋白的核巧酸序列為SEQ ID NO. 1，所述的巧蛋白的核巧酸 序列為SEQ ID NO. 3,所述的HN蛋白的核巧酸序列為SEQ ID NO. 5。
[0010] 優選地，所述的新城疫病毒融合蛋白為在HN蛋白兩端分別添加FI蛋白片段和巧 蛋白片段。
[0011] 本發明的另一目的在于提供一種制備所述的新城疫病毒融合蛋白的方法，所述制 備方法包括；通過基因工程手段，依次構建新城疫病毒融合蛋白的克隆載體、表達載體，并 對新城疫病毒融合蛋白進行表達、純化及鑒定。
[0012] 本發明的再一目的在于提供一種用于預防基因VII型新城疫病毒感染的疫苗組 合物，其包括一免疫量的所述的新城疫病毒融合蛋白和/或一獸醫學上可接受的佐劑。
[0013] 優選地，所述的新城疫疫苗組合物單位劑量中含新城疫病毒融合蛋白組分的含量 為 5-50 y g，優選為 10-40 y g。
[0014] 含本發明所述的新城疫病毒融合蛋白的疫苗組合物中，較佳地還可包括一獸醫學 上可接受的佐劑，所適用的免疫佐劑不限，可W是任何一種常用于疫苗的佐劑，包括油佐 齊U、鉛膠佐劑、蜂膠佐劑、丙帰酸聚合物佐劑、水性佐劑、脂質體中的一種或幾種。
[0015] 本發明所用術語"丙帰酸聚合物佐劑"為至少含有丙帰酸聚合物的佐劑溶液；優選 地，所述丙帰酸聚合物還可為丙帰酸聚合物、可代謝油的混合物；更優選地，所述丙帰酸聚 合物為均聚物或共聚物，進一步優選為Carbopol。
[0016] 本發明所用術語"水性佐劑"又稱"水佐劑"、"水基佐劑"或"水溶性佐劑"，是一種 聚合物水溶性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，滴入水中能迅速與水混溶。
[0017] 本發明所用術語"脂質體"是理想的免疫佐劑，W其制備的新城疫疫苗組合物還可 稱為"新城疫病毒樣顆粒";其膜材包括磯脂、固醇類；更優選地，所述脂質體的膜材包括卵 磯脂、豆磯脂、腦磯脂、磯脂醜己醇胺、膽固醇、二蹤擱醜磯脂醜膽堿、二蹤擱醜磯脂醜己醇 胺、二硬脂醜磯脂醜膽堿、膽固醇己醜、牛膽酸軸、蛋磯脂醜膽堿、磯脂醜絲胺酸、磯脂醜肌 醇、神經銷磯脂、銷髓磯脂、二錄蠟磯酸醋、二肉豆證卵磯脂、二肉豆證醜磯脂醜膽堿、硬質 醜胺、二氧己帰十六焼基離、四氧己帰十二焼基離中的一種或幾種。
[0018] 優選地，所述的脂質體是中性脂質體、負電性脂質體或正電性脂質體；更優選地， 所述的脂質體為正電性脂質體。
[0019] 優選地，所述的脂質體將新城疫病毒融合蛋白包裹于脂質體內或鑲嵌于脂質體膜 中或由于電荷作用而吸附于膜上。
[0020] 本發明還提供一種制備所述的新城疫病毒樣顆粒的方法，所述的制備方法包括：
[0021] (1)將通過基因工程手段所獲得的新城疫病毒融合蛋白純化、凍干后，用含穩定劑 的緩沖液制備成新城疫抗原原液；
[0022] (2)將脂質體原料溶于有機溶劑中，將所述脂質體溶液于旋轉蒸發儀中真空旋轉 蒸發，成膜，在膜材中加入所述緩沖液，并加入幾粒小玻璃珠，旋轉蒸發，待薄膜從瓶壁上完 全脫落后，靜置得空脂質體；
[0023] (3)將所述新城疫抗原原液加入制得的空脂質體中，用高壓勻漿機高壓均質循環 脂質體顆粒，除菌過濾，即成所述新城疫病毒樣顆粒。
[0024] 優選地，所述步驟（1)中的所述穩定劑為氨基酸、單糖、二糖、多元醇中的一種或幾 種；所述步驟（2)中的所述有機溶劑為二氯甲焼、氯仿、己離、丙麗溶液中的一種或幾種；所 述步驟（2)中所述膜材的終濃度為1%-5% (W/W)，優選為2% (W/W);所述步驟（2)中所述旋 轉蒸發溫度為30-65C，所述高壓壓力為15-30化a ;所述步驟（1 )、（2)中的所述緩沖液為抑 值5. 4-7. 8范圍內的磯酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、碳酸軸緩沖液、生理鹽水中的一種或 幾種。
[0025] 本發明所述的新城疫疫苗組合物制備方法，還包括薄膜法與冷凍干燥法結合、逆 相蒸發法與冷凍干燥法結合、薄膜分散法、冷凍干燥法、注入法、加壓擠出法、烙融法、復乳 法、凍融法、表面活性劑處理法、前脂質體法、空白前脂質體法、抑及醋酸梯度法等。
[0026] 本發明還提供了所述的新城疫病毒融合蛋白及所述的新城疫疫苗組合物在制備 預防和/或治療基因VII型新城疫病毒中的應用。
[0027] 本發明在制備用于保護動物免患基因VII型新城疫病毒所引起的疾病的新城疫 疫苗組合物中的應用時，所用新城疫疫苗組合物的免疫量為0. 3mL/羽。
[0028] 所述的新城疫疫苗組合物在給予免疫動物時，可W通過肌肉注射、皮下注射、口服 途徑、靜脈注射或點眼、滴鼻途徑，優選為通過皮下注射或肌肉注射。
[0029] 基于此，本發明具有W下突出的優點：
[0030] ( 1)本發明所述的新城疫病毒融合蛋白是通過基因工程手段獲得的，易于大規模 生產，便于儲存；
[0031] (2)本發明所述的新城疫疫苗組合物所含抗原的主要組分為新城疫病毒融合蛋 白，而該融合蛋白包含F1蛋白、巧蛋白和HN蛋白，能同時刺激機體產生細胞免疫和體液免 疫；
[0032] (3)本發明所述的新城疫疫苗組合物具有廣譜性，能抗基因VII型的新城疫病毒， 免疫動物后可誘導動物產生抗基因VII型新城疫病毒的抗體。
[0033] 序列表中：
[0034] 序列1為新城疫病毒F1蛋白的核巧酸序列；
[0035] 序列2為新城疫病毒F1蛋白的氨基酸序列；
[0036] 序列3為新城疫病毒巧蛋白的核巧酸序列；
[0037] 序列4為新城疫病毒巧蛋白的氨基酸序列；
[0038] 序列5為新城疫病毒HN蛋白的核巧酸序列；
[0039] 序列6為新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但該些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可W對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但該些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0041] 本實施例中所用的"免疫量"是指提供針對新城疫疫苗組合物的免疫劑量，主要取 決于W下因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態W及動物之前是否接受 過對抗同樣病毒的疫苗。
[0042] 本實施例中所用的新城疫病毒F1蛋白、巧蛋白、HN蛋白的序列，來源于已報道的 新城疫中國分離株，在NCBI中的登錄號為JF343539。
[0043] 本實施例通過基因工程手段，W大腸桿菌表達載體為例進行表達，從而獲得新城 疫病毒融合蛋白，但該實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
[0044] 本實施例W油佐劑、脂質體作為佐劑制備新城疫疫苗組合物為例進行闡述，但該 實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
[0045] 本實施例中所用的攻毒毒株為新城疫北京株，該毒株的保藏號為CVCC AV1611，保 藏單位為國家獸醫微生物菌種保藏管理中也，購自中國獸醫藥品監察所。
[0046] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0047] 實施例1新城疫病毒融合蛋白克隆載體的構建
[0048] 根據 NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的新城疫 Qiina/ Guangxi9/2003 (登錄號；JF343539)中的基因序列，分別選取F1、F2、HN蛋白基因的核巧酸 序列（詳見序列表SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3)，通過基因工程手段將他們 串聯起來作為新城疫病毒的融合蛋白。
[004引 1. 1弓I物設計
[0050] 根據選取的F1、HN、巧蛋白基因的核巧酸序列，即SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 2,分別設計各自片段的引物，詳情如下。其中，FI上下游引物兩端分別添加SacI 和甜al限制性內切酶位點；HN上下游引物兩端分別添加甜al和化〇1限制性內切酶位點； 巧上下游引物兩端分別添加化〇1和Hindlll限制性內切酶位點。
[0051] 引物1擴增F1片段，序列如下：
[0052] 上游：CGAGCTCATGCTTGACGGCAGGCCTCTTGCAG
[0053] 下游：GCTCTAGAGCGCGGTCCATACCTATAAAGC
[0054] 引物2擴增HN片段，序列如下：
[00巧]上游：GCTCTAGAGCTTTATAGGTATGGACCGCGC
[0056] 下游：CCGCTCGAGGTCTTTGAATATTAAACCTTAT
[0057] 引物3擴增巧片段，序列如下：
[0058] 上游：CCGCTCGAGATAAGGTTTAATATTCAAAGAC
[0059] 下游：CCCAAGCTTTTAGACTTTTTCTAGCTTGCTGTTG
[0060] 1. 2RT-PCR
[0061] 新城疫病毒尿囊液培養上清，按照RNA提取試劑盒說明書，提取新城疫病毒總 RNA，并按照反轉錄試劑盒說明，將其反轉錄成相應cDNA片段，-2(TC保存。W cDNA片段為模 板，按照PCR反應試劑盒說明，分別擴增FUHNJ2片段，PCR反應程序為；95°C預變性5min， 94°C變性45s，52°C復性30s，72°C延伸60s，35個循環，最后72°C延伸lOmin。擴增產物使 用1%凝膠進行電泳檢測。
[0062] 檢測結果顯示；分別出現 264、1716、360bp附近出現條帶，與Fl、HN、巧目的基因 片段大小相同。
[0063] 將目的片段分別使用凝膠回收試劑盒進行回收。
[0064] 1. 3克隆載體的構建
[006引將回收的F1、HN、巧片段，分別與克隆載體PMD18-T進行連接，連接體系為：目的 基因20 y L、pMD18-T載體0. 5 y L、連接酶緩沖液2. 0 y UT4DNA連接酶1. 0 y L、滅菌雙蒸水 8. 5y L ;連接反應條件為16°C、30min。將連接產物加入D冊a感受態細胞，冰上放置30min， 然后42°C加熱45s，置冰上Imin，加入890 y L的LB液體培養基，37°C振蕩培養60min，將培 養物接種含100 y g/mL氨予青霉素的LB瓊脂培養板，37C培養過夜。
[0066] 觀察結果顯示；LB固體培養基出現白色小菌落。
[0067] 挑典型菌落，接種于含有lOOy g/mL氨予青霉素的LB液體培養基，200rpm培 養lOh。使用質粒回收試劑盒提取各轉化菌質粒，分別命名為PMD18-T-F1、PMD18-T-HN、 PMD18-T-F2,并進行酶切鑒定。
[006引1. 4克隆載體的構建和鑒定
[0069] 1. 4. lpMD18-T-Fl 和 PMD18-T-HN 的酶切鑒定
[0070] 將1. 3轉化菌提取質粒后，PMD18-T-F1使用SacI和甜al限制性內切酶進行雙酶 切；PMD18-T-HN使用甜al和化〇1限制性內切酶進行雙酶切，酶切產物電泳后，將鑒定為陽 性的質粒，送基因公司進行測序分析。結果顯示；PMD18-T-F1酶切后，出現2600bp左右的載 體片段和26化P左右的F1片段；PMD18-T-HN酶切后，出現2600bp左右的載體片段和1700bp 左右的HN片段。
[0071] 將酶切正確的質粒送基因公司測序，測序結果表明：目的基因和載體連接正確。
[0072] 1. 4.化MD18-T-F1-HN 的構建
[0073] PMD18-T-F1、PMD18-T-HN分別使用SacI和甜al限制性內切酶雙酶切，酶切產 物電泳后，使用DNA凝膠回收試劑盒，將酶切后F1、PMD18-T-HN目的條帶回收。使用DNA 連接試劑盒，將F1、PMD18-T-HN進行連接，連接體系為；F1片段ly L、PMD18-T-HN5U L、 buffers uL、連接酶2 uL，滅菌水10 uL ;連接條件為；16°C反應過夜。連接產物轉化D冊a 感受態細胞，轉化過程同1.3。
[0074] 結果表明；PMD18-T-F1酶切后，出現26化P的F1片段和2600bp的載體片段； PMD18-T-HN酶切后，在4300bp附近出現條帶。
[00巧]將F1片段和PMD18-T-HN連接后轉化D冊a感受態細胞，培養過夜，在LB固體培 養基出現白色小菌落，挑單菌落接種含100 y g/mL氨予青霉素的LB液體培養基，出現渾濁， 使用質粒提取試劑盒提取質粒，進行鑒定。
[0076] 1. 4. ：3pMD18-T-Fl-HN 鑒定
[0077] 將1. 4. 2提取的質粒，使用SacI、化〇1限制性內切酶雙酶化酶切產物進行電泳， 將酶切正確的質粒送基因公司進行測序。
[0078] 結果表明；酶切后，出現2600bp的載體片段和2000bp左右的目的條帶。將酶切正 確的質粒進行測序分析，分析結果顯示；F1和HN正確連接到載體，PMD18-T-F1-HN連接成 功。
[0079] 1. 5pMD18-T-Fl-HN-F2 載體的構建和鑒定
[0080] 1. 5. lpMD18-T-Fl-HN-F2 載體的構建
[0081] PMD18-T-F2、PMD18-T-F1-HN分別使用化〇1、Hindlll雙酶切，酶切產物電泳 后，使用膠回收試劑盒分別回收巧、PMD18-T-F1-HN目的條帶，使用DNA連接試劑盒，將 F2、PMD18-T-F1-HN目的條帶進行連接，連接體系為；巧片段1 y L、PMD18-T-F1-HN5 y L、 buffers y L、連接酶2 y L，滅菌水10 y L ;連接條件為；16°C反應過夜。連接產物轉化D冊a 感受態細胞，轉化過程同1.3。
[0082] 結果顯示：化oI、HindIII雙酶切后電泳后，在360bp和5000bp附近出現條帶。將 其回收后連接，連接產物轉化D冊a感受態細胞，培養過夜，在含100 y g/mL的LB固體培養 基出現小菌落，挑單菌落接種100 y g/mL氨予青霉素的LB液體培養基，出現渾濁，使用質粒 提取試劑盒提取質粒，送基因公司進行測序分析，同時進行酶切鑒定。
[008引 1. 5. ：3pMD18-T-Fl-HN-F2 載體的鑒定
[0084] PMD18-T-F1-HN-F2質粒使用SacI、Hindlll進行雙酶切鑒定，酶切產物電泳。結 果顯示；電泳后，分別出現2600bp的載體片段和2400bp左右的目的條帶。
[0085] 將鑒定為陽性的質粒送基因公司進行測序分析，結果顯示；PMD18-T-F1-HN-巧連 接正確。
[0086] 實施例2新城疫病毒融合蛋白表達載體的構建
[0087] 2. lpET-28a-T-Fl-HN-F2 表達載體的構建
[0088] pET-28a和PMD18-T-F1-HN-F2分別使用SacI、Hindlll進行雙酶切，酶切產物進 行電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收相應的目的條帶。結果顯示；酶切后，pET-28a載體 在5300bp附近出現條帶，PMD18-T-F1-HN-F2在2400bp附近出現條帶。
[0089] 將目的條帶回收，使用DNA連接試劑盒進行連接，連接體系為；pET-28al y L、 F1-HN-F25U L、buffer2y L、連接酶2y L，滅菌水lOy L ;連接條件為；16°C反應過夜。連接 產物轉化Bal21感受態細胞，轉化過程同1. 3,轉化菌接種含50 y g/mL卡那霉素的LB瓊脂 平皿。
[0090] 2.化ET-28a-T-Fl-HN-F2 表達載體的鑒定
[0091] 將2. 1轉化的Bal21細胞隔夜培養，挑單菌落接種含50 y g/mL卡那霉素的LB培 養基，37C、ISOrpm培養過夜，使用DNA提取試劑盒提取相應質粒，將質粒使用PCR試劑盒進 行鑒定。將PCR陽性質粒送基因公司進行測序分析。
[0092] 結果顯示；PCR擴增出2400bp的目的條帶，而陰性對照未出現條帶；測序結果表 明，pET-28a-T-Fl-HN-巧構建正確。
[0093] 實施例3新城疫病毒融合蛋白的表達、鑒定及純化
[0094] 3. 1新城疫病毒融合蛋白的表達及鑒定
[0095] 將含祀T-28a-T-Fl-HN-F2質粒的Bal21菌，按1% (V/V)接種量接種含50 y g/ 血卡那霉素的LB液體培養基，37°C、180巧m培養6-她，使細菌ODe。。在0. 6-1. 0之間，加入 IPTG，使終濃度為Immol/L，繼續培養化，取樣進行SDS-PAGE電泳，使用雞抗新城疫陽性血 清進行Western blot鑒定。
[0096] 結果顯示；相對于對照，含祀T-28a-T-Fl-HN-F2質粒的Bal21菌經IPTG誘導化， 在80邸a附近出現相應的目的條帶，主要存在于包涵體中。Western blot結果表明；該重 組蛋白可與雞抗新城疫陽性血清發生特異性結合反應。
[0097] 3. 2新城疫病毒融合蛋白的純化
[0098] 使用Ni+親和層析柱對上述表達產物進行純化。將含祀T-28a-T-Fl-HN-巧質粒的 Bal21菌，按1% (V/V)接種量接種含50 y g/mL卡那霉素的LB液體培養基，37C、ISOrpm培 養6-她，使細菌ODe。。在0. 6-1. 0之間，加入IPTG使其終濃度為Immol/L，繼續培養化后， 收集細菌進行超聲破碎，800化pm離也30min，收集沉淀，使用包涵體溶解液溶解后，使用Ni+ 親和層析柱進行純化，純化蛋白使用生理鹽水進行透析，透析蛋白使用紫外分光光度計測 定蛋白濃度，使用SDS-PAGE對其純度進行鑒定。
[0099] 鑒定結果表明；新城疫病毒融合蛋白，即重組T-F1-HN-F2蛋白，經Ni+親和層析柱 純化，透析后得到濃度為200 y g/mL的含新城疫病毒融合蛋白溶液，將其作為新城疫病毒 融合蛋白的儲備液；透析蛋白使用SDS-PAGE鑒定，僅在80KDa附近出現條帶。
[0100] 將鑒定合格后的新城疫病毒融合蛋白使用凍干機進行凍干，W便長期保存。
[0101] 實施例4不同佐劑類型的新城疫疫苗組合物的制備
[0102] 4. 1不含佐劑的新城疫疫苗組合物的制備
[0103] 將實施例3制備的200 y g/mL新城疫病毒融合蛋白的儲備液，用生理鹽水進行稀 釋，使其含新城疫病毒融合蛋白的終濃度分別為5、25、50^3/111以依次編碼為疫苗1、疫苗 2、疫苗3。
[0104] 將制備的疫苗1、疫苗2、疫苗3于2-8°C保存備用。
[0105] 4. 2含油佐劑的新城疫疫苗組合物的制備
[0106] 取注射用白油94份，加司本-806份混合后，加硬脂酸鉛2份，邊加邊攬拌至透明 為止，高壓滅菌后備用，即為油相。
[0107] 將實施例3制備的200 y g/mL新城疫病毒融合蛋白的儲備液進行稀釋，使其含新 城疫病毒融合蛋白的濃度依次為15、75、150 y g/mL，分別于無菌容器中，加入4%滅菌并冷 卻后的吐溫-80,邊加邊攬拌，使吐溫-80完全溶解為止，即為水相1、水相2、水相3。
[0108] 乳化機的轉子先用0. 5%甲酵溶液浸泡消毒化W上，使用前W熱的無菌蒸觸水沖 洗干凈。取油相2份置乳化器內，開動電機攬拌，然后依次分別徐徐加入1份水相1、水相 2、水相3,再W 1750化/min乳化5min即可。在乳化終止前加入1%硫柳隸軸，使其終濃度為 0. 01%。制備的疫苗即為含油佐劑的5、25、50 y g/mL新城疫病毒融合蛋白的疫苗組合物，將 其編碼為疫苗4、疫苗5、疫苗6,于2-8C保存備用。
[0109] 4. 3新城疫病毒樣顆粒的制備
[0110] 將實施例3制備出的凍干后的新城疫病毒融合蛋白用含1%海藻糖的生理鹽水溶 解，制備成200 y g/mL的新城疫抗原原液。
[0111] 本實施例所述的新城疫疫苗組合物的制備方法之薄膜法與冷凍干燥法相結合，包 括W下操作步驟：
[0112] (1)將大豆卵磯脂、膽固醇按照質量比為3:1混合，然后溶于H氯甲焼中，將該混 合溶液置于旋轉蒸發儀的茄型瓶中，45C水浴作為蒸發溫度，真空旋轉蒸發，成膜。
[011引（2)按膜材終濃度為2% (W/W)加生理鹽水，并加入幾粒小玻璃珠，45C旋轉蒸發， 待薄膜從瓶壁上完全脫落后，靜置約25min，使瓶中液體呈乳白色息濁液。
[0114] (3)將不同體積的新城疫抗原儲備液加入制得的空脂質體中，用高壓勻漿機在 15-30化a的高壓下均質循環脂質體顆粒5次，除菌過濾后即為所制備的新城疫病毒樣顆 粒，使含新城疫病毒融合蛋白的含量依次為5、25、50 y g/mU依次編碼為疫苗7、疫苗8、疫 苗9。
[0115] 實施例5新城疫疫苗組合物的檢驗
[0116] 將實施例4制備的不同佐劑類型的新城疫疫苗組合物（即疫苗1至疫苗9)按照 《中華人民共和國獸用生物制品規程》（二〇〇〇年版）方法進行無菌檢驗W及安全檢驗。
[0117] 無菌檢驗和安全檢驗結果顯示；各疫苗組合物均符合規定的標準。
[011引實施例6動物實驗
[0119] 選取30日齡的SPF雞95只，隨機挑選5只作為空白對照，其余90只隨機分成9 組，10只/組，分別經肌肉注射實施例4制備的不同佐劑類型的新城疫疫苗組合物（即疫苗 1至疫苗9)、生理鹽水(作為空白對照)，注射劑量0. 3血/羽。
[0120] 于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分別采集并分 離各試驗組的血清，并利用血凝抑制試驗（HI)檢測血清中的新城疫抗體水平，檢測結果見 表1。
[0121] 表1不同時間段各試驗組新城疫抗體水平的檢測結果匯總
[0122]
【權利要求】
1. 一種新城疫病毒融合蛋白，包括： (1) F蛋白中的兩個保護性抗原片段F1蛋白和F2蛋白； (2) HN蛋白。
2. 根據權利要求1所述的新城疫病毒融合蛋白，其特征在于，所述的F1蛋白的氨基酸 序列為SEQ ID NO. 2,所述的F2蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4,所述的HN蛋白的氨基 酸序列為SEQ ID NO. 6。
3. 根據權利要求1所述的新城疫病毒融合蛋白，其特征在于，所述的新城疫病毒融合 蛋白為在HN蛋白兩端分別添加F1蛋白片段和F2蛋白片段。
4. 一種用于預防新城疫病毒基因VII型病毒感染的疫苗組合物，其包括一免疫量的如 權利要求1所述的新城疫病毒融合蛋白和/或一獸醫學上可接受的佐劑。
5. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物單位劑量中含 新城疫病毒融合蛋白的含量為5-50 y g，優選為10-40 y g。
6. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的佐劑包括油佐劑、鋁膠佐 齊U、蜂膠佐劑、丙烯酸聚合物佐劑、水性佐劑、脂質體中的一種或幾種。
7. 權利要求4-6任一項所述的疫苗組合物在預防和/或治療基因VII型新城疫病毒中 的應用。
【文檔編號】A61P31/14GK104513317SQ201310462759
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司