活化ampk的化合物及其使用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于活化AMPK的化合物，其為腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受的鹽。并公開了該化合物的應用，此化合物適用于活化AMPK(AMP-活化蛋白激酶)，并使用該化合物于預防或治療生理狀況或疾病，因此于哺乳動物預防或治療可被AMPK改善的生理狀況或疾病。
【專利說明】活化AMPK的化合物及其使用
【技術領域】
[0001] 本發明關于腺嘌呤，此化合物適用于活化AMPK (AMP-活化蛋白激酶），并使用該 化合物于預防或治療生理狀況或疾病。
【背景技術】
[0002] AMPK明確為細胞能量的感應器及能量需求的回應者。AMPK為異三元體由催化性 α次單元體、調節性β、Y次單元體組成，所有次單元體在真核生物具高度保留性。AMPK 活化是借由其上游激酶如LKB1、鈣離子/攜鈣素依賴的蛋白質磷酸激酶（Ca27Calmodulin dependent kinase)及TAKl磷酸化α次單元體具保留性的第172蘇胺酸殘基，由生理或 病理壓力造成高ΑΜΡ/ΑΤΡ比例亦活化AMPK。AMPK活化后會促進分解代謝路徑進行并抑制 合成代謝，借由減少ATP消耗及促進ATP生成進而恢復細胞能量平衡。
[0003] 作為一能量代謝平衡調節者，AMPK被認為對代謝癥候群，包括第二型糖尿病、心血 管疾病、脂肪肝等為一具潛力的藥物標的。許多代謝癥候群都與胰島素抵抗有關。胰島素 抵抗是為一病理狀態，在此狀況細胞無法對胰島素進行回應，因此血液中過多的葡萄糖無 法移除至骨胳肌或脂肪組織。在肌肉細胞中，AMPK活化以非胰島素依賴性方式，通過轉錄 調控增加葡萄糖運輸蛋白（GLUT4)表現量，并誘導GLUT4轉移至細胞膜上導致細胞攝取葡 萄糖速率增加。AMPK活化亦分別借由抑制乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase) 及羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase)抑制脂肪酸及膽固醇合成。此 外AMPK活化導致數個轉錄因子的抑制，包括SREBP-lc，ChREBP and HNF-4a，并下降調節 脂肪酸合成及糖質新生作用相關酵素的蛋白質表現。上述提及的研究發現，均支持AMPK是 為代謝癥候群尤其糖尿病的治療標的。
[0004] 除了能量代謝平衡調節外，AMPK亦參與數個細胞機制的調節，包括發炎反應、細 胞生長、細胞雕亡、自體吞噬、老化及分化。許多研究顯示AMPK為發炎反應抑制者。AMPK 活化通過抑制細胞核轉錄因子（NF-kB)的訊息傳遞抑制發炎反應。細胞核轉錄因子的訊 息傳遞為活化先天免疫及后天免疫主要路徑，當AMPK活化后會通過刺激SIRTl、Forkhead box 0 (FoxO)或 peroxisome proliferator-activated receptor co-activator Ια (PGCla)抑制細胞核轉錄因子的轉錄活性以達到抑制發炎反應的效果。此外數個研究室 亦證明AMPK活化抑制環氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，C0X_2)的蛋白質表現。環氧化 酶-2是為一誘導性酵素，可被發炎性細胞激素及生長因子調控，其功能為將花生四烯酸轉 化成前列腺素因而導致發炎反應及疼痛，因此抑制環氧化酶的活性或表現已被證實具抗發 炎作用。
[0005] 數個AMPK活化劑已于生物體內實驗被證實具抗發炎功能。舉例而言， 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR)于小鼠模式已被證實可緩 解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯鈉所引起的急性及復發性結腸炎，AICAR治療顯著 降低疾病小鼠的體重減少并減緩發炎反應。此外AICAR對于人類多發性硬化癥動物模式 (EAE)有明顯的治療效果，亦降低以脂多醣誘導小鼠肺損傷的嚴重程度。
[0006] 細胞訊息傳遞路徑失調可能會導致細胞異常生長，最終導致癌癥。哺乳動物雷帕 霉素標靶蛋白（mTOR)是為一絲胺酸/蘇胺酸激酶，其調控細胞生長及自體吞噬作用。哺 乳動物雷帕霉素標靶蛋白訊息傳遞路徑的活性失調在許多不同癌癥被發現，因此哺乳動 物雷帕霉素標靶蛋白抑制劑被認為是癌癥治療的潛力藥物。大量研究證實AMPK磷酸化 tuberous sclerosis complex 2 (TSC2)及Raptor達到抑制哺乳動物雷帕霉素標革巴蛋白 路徑。各種AMPK活化劑包括AICAR、metformin、phenformin已被證實抑制哺乳動物雷帕霉 素標靶蛋白訊息路徑，并抑制癌細胞生長。此外AMPK活化通過抑制哺乳動物雷帕霉素標靶 蛋白復合體-1誘導自體吞噬作用。由于AMPK抑制哺乳動物雷帕霉素標靶蛋白復合體-1， Ulkl上第757絲胺酸磷酸化減少，其后第317及777絲胺酸被AMPK磷酸化，Ulkl被AMPK 憐Ife化后隨的啟動自體吞喔作用。
[0007] 綜上所述，AMPK被認為對許多人類疾病或病理狀況，包括發炎性疾病、傷口愈合、 神經退化、癌癥、氧化壓力及心血管疾病為一很好的治療標的。事實上，AMPK活化劑已被應 用于至少24類疾病的臨床試驗，包括：細菌及真菌疾病、行為及心理失調、血液及淋巴疾 病、癌癥、腫瘤、消化系統疾病、耳鼻喉疾病、眼疾、腺體及賀爾蒙相關疾病、心血管疾病、免 疫系統疾病、嘴巴及牙齒疾病、肌肉、骨胳、軟骨疾病、神經系統疾病、營養及代謝性疾病、呼 吸道疾病、皮膚及結締組織疾病、傷口愈合等。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種新穎AMPK活化劑-腺嘌呤及使用該化合物于預防或治療疾病。
[0009] 本發明提供一種用于活化AMPK的化合物，其為腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受的 鹽。
[0010] 本發明提供上述化合物作為制備治療可被AMPK活化劑改善的疾病或生理狀況的 藥物的應用。
[0011] 本發明提供上述化合物作為制備治療發炎性生理狀況或疾病的藥物的應用。
[0012] 本發明提供上述化合物作為制備預防或治療前期糖尿病、第二型糖尿病、代謝癥 候群的一種或其組合的生理狀況或疾病的藥物的應用。
[0013] 本發明提供上述化合物作為制備預防或治療前期糖尿病、第二型糖尿病、代謝癥 候群的一種或其組合的生理狀況或疾病的藥物的應用。
[0014] 本發明提供上述化合物作為制備預防或治療阿茲海默癥的藥物的應用。
[0015] 本發明提供上述化合物作為制備治療可被自體吞噬作用改善的疾病或生理狀況 的藥物的應用。
[0016] 本發明提供上述化合物作為制備傷口愈合過程抑制疤痕形成的藥物的應用。
[0017] 本發明提供上述化合物作為制備加強傷口愈合的藥物的應用。
[0018] 本發明提供上述化合物作為制備哺乳動物中保護及治療受活性氧族傷害的細胞 的藥物的應用。
[0019] 本發明提供上述化合物作為制備預防或治療癌癥藥物的應用。
[0020] 根據本發明的實施例，提供一新穎AMPK活化劑-腺嘌呤，可于細胞內活化AMPK，因 此可于哺乳動物預防或治療可被AMPK改善的生理狀況或疾病。
[0021] 根據本發明的實施例，提供一通過活化AMPK降低血糖的方法，從而預防或治療疾 病包括：代謝癥候群、前期糖尿病、第二型糖尿病、胰島素抵抗，其中給予需要此治療的哺 乳動物有效劑量的腺嘌呤及/或醫藥學上可接受的鹽。
[0022] 根據本發明的實施例，提供一通過活化AMPK抗發炎的方法，從而預防或治療發炎 性狀況或疾病，其中給予需要此治療的哺乳動物有效劑量的腺嘌呤及/或醫藥學上可接受 的鹽。
[0023] 根據本發明的實施例，提供一通過活化AMPK抑制纖維母細胞生長的方法，從而于 傷口愈合期間預防疤痕組織生成。
[0024] 根據本發明的實施例，提供一加強傷口愈合的方法，其中給予需要此治療的哺乳 動物有效劑量的腺嘌呤及/或醫藥學上可接受的鹽。
[0025] 根據本發明的實施例，提供一抑制反應性氧族（ROS)生成的方法，從而保護或治 療哺乳動物的細胞遠離反應性氧族傷害，其中給予需要此治療的哺乳動物有效劑量的腺嘌 呤及/或醫藥學上可接受的鹽。
[0026] 根據本發明的實施例，提供一抑制癌細胞生長的方法，從而預防或治療癌癥，其中 給予需要此治療的哺乳動物有效劑量的腺嘌呤及/或醫藥學上可接受的鹽。
[0027] 本發明是關于腺嘌呤，此化合物適用于活化AMPK，并使用腺嘌呤于預防或治療生 理狀況或疾病，包括：前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病、代謝癥候群、肥胖、發炎、傷 口愈合、阿茲海默癥、癌癥、氧化壓力及心血管疾病。
[0028] 本發明發現，腺嘌呤為一新穎的AMPK活化劑，并具有各種生物性功能。近年來， AMPK活化已被證實有助于疾病的預防及治療，如前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病、 代謝癥候群、肥胖、發炎、傷口愈合、阿茲海默癥、癌癥、氧化壓力、心血管疾病以及促進傷口 愈合。本發明認為，此效果可歸因于AMPK活化所導致但不限于降低環氧化酶-2表現量、抑 制應性氧族（ROS)的生產及葡萄糖攝取活性的增加。
[0029] 預期適應癥 基于本發明的研究成果（見實施例），腺嘌呤可通過活化AMPK作為使用于各種生理狀 況或疾病的治療劑。以下提供預期適應癥的示例性引導及證據。
[0030] 腺嘌呤于高血糖、前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病的治療 最近已有報告指出AMPK活化劑包括metformin，A769662，AICAR于糖尿病或肥胖小 鼠模式降低血漿葡萄糖濃度。于本發明中，1 μ M飛00 μ M的腺嘌呤顯著增加肌肉細胞C2C12 的葡萄糖攝取（表2)。更進一步以高脂肪飼料喂養小鼠作為第二型糖尿病動物模型評估腺 嘌呤對血漿葡萄糖濃度調節效果。與控制組的高脂肪飼料喂養小鼠比較，給予腺嘌呤顯著 減少高脂肪飼料喂養小鼠的血漿葡萄糖30%以上，并減少血漿三酸甘油酯35%以上，15%以 上的體重減少（實施例3)。這里使用的術語「高血糖」是指一生理狀況，其特征為血糖高 于126毫克/分升。這里使用的術語「前期糖尿病」是指一生理狀況，其特征為空腹血糖高 于100毫克/分升但低于140毫克/分升。這里使用的術語「胰島素抵抗」是指一生理狀 況，其中全身或組織包括肝臟、骨胳肌、脂肪組織無法對胰島素反應。這里使用的術語「第二 型糖尿病」亦指非胰島素依賴型糖尿病或成人發病型糖尿病。是指代謝失調引起的胰島素 生產不足或胰島素抵抗，其特征通常為空腹血糖高于140毫克/分升。根據此實施例，腺嘌 呤被證實加速葡萄糖攝取，因此可作為與高血糖有關的生理狀況或疾病的有效治療方式。
[0031] 腺嘌呤于發炎性疾病的治療 各種AMPK活化劑已被證實于生物體內具抗發炎功能。舉例而言， 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR)于小鼠模式已被證實可緩 解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯鈉所引起的急性及復發性結腸炎，AICAR治療顯著 降低疾病小鼠的體重減少并減緩發炎反應。此外AICAR對于人類多發性硬化癥動物模式 (EAE)有明顯的治療效果，亦降低以脂多醣誘導小鼠肺損傷的嚴重程度。于本發明中，腺嘌 呤于體外試驗中抑制脂多醣誘導的發炎反應：于脂多醣刺激下，經腺嘌呤處理的巨噬細胞 的發炎性細胞激素分泌量，包括腫瘤壞死因子α (TNF-α)、介白素_1β (IL-Ιβ)及介白 素-6 (IL-6)，與控制組相比有顯著性減少。腺嘌呤亦減少人類巨噬細胞因脂多醣誘導表現 的環氧化酶-2表現量（實施例4)。于三硝基苯磺酸誘導的發炎性腸病（IBD)小鼠模式中， 給予腺嘌呤治療組別的結腸發炎性細胞激素，包括腫瘤壞死因子（TNF)、干擾素 γ (INFy) 及介白素（IL-17)均較控制組小鼠顯著減少，且挽救體重損失（實施例5)。
[0032] 這里使用的術語「發炎性細胞激素」是指促進系統性發炎反應的細胞激素。這里 使用的術語「發炎性疾病」是指與發炎相關的疾病，包括但不限制于僵直性脊椎炎、關節炎 (骨關節炎、風濕性關節炎、干癬性關節炎）、氣喘、動脈粥樣硬化、克隆氏癥、結腸炎、皮膚 炎、大腸憩室炎、纖維肌痛癥、肝炎、激躁性結腸癥、系統性紅斑性狼瘡、腎炎、阿茲海默癥、 帕金森式癥、潰瘍性大腸炎等。近年來，許多報告已證實AMPK是環氧化酶-2上游調控者，可 抑制環氧化酶-2的蛋白質表現。與先前研究相符，發明人發現一新穎AMPK活化劑，腺嘌呤， 可有效抑制環氧化酶-2的蛋白質表現，由此可知腺嘌呤可抑制環氧化酶_2介導的發炎。根 據本發明，腺嘌呤被發現可抑制發炎，因此可作為發炎相關的生理狀況或疾病的治療。
[0033] 腺嘌呤于傷口愈合及疤痕形成 AMPK被認為可促進細胞能動性并加強傷口愈合。一 AMPK活化劑，白藜蘆醇，已被證實 可加強手術傷口的愈合。除了傷口愈合外，在愈合過程中減少疤痕的形成一直為現代醫學 的首選目標。新生兒傷口愈合不同于成人的傷口愈合，不會伴隨疤痕的形成，此間差異在于 環氧化酶-2的活化。于成人的傷口愈合過程，環氧化酶_2活性會經由TGF-beta被提升， 因而導致傷口處前列腺素生產的增加。前列腺素已被證實可促進纖維母細胞增生及膠原蛋 白的形成，此兩種因素可導致疤痕形成。因此，抑制環氧化酶-2的活性被認為可有效預防 疤痕形成。于本發明中，腺嘌呤抑制纖維母細胞生長（實施例8)并降低環氧化酶-2的蛋 白質表現。于動物模式中，于傷口處直接施用腺嘌呤不僅可加強傷口愈合并可減少疤痕生 成（實施例9)。依據上述資料，局部施用腺嘌呤可有效加強傷口愈合并防止疤痕形成。 [0034] 神經退化 許多細胞機制的缺陷已被證實與神經退化性疾病有關，包括發炎、細胞內運輸、自體吞 噬等。自體吞噬的功能在于移除細胞內失去功能的胞器或蛋白質團塊，并且對細胞內平衡 扮演重要角色。許多神經退化性疾病的發病機制涉及細胞內或細胞外蛋白質團塊的沉積， 而移除這些蛋白質團塊已顯示可改善此類疾病的進展。此外，自體吞噬途徑受損或移除負 責自體吞噬的蛋白質已被證實導致神經退化。AMPK活化已證實可促進自體吞噬路徑。因此， 通過活化AMPK以促進自體吞噬路徑可作為預防或控制神經退化性疾病的有效策略。AMPK 活化劑已被證實可經由自體吞噬路徑減少類淀粉沉積。每日給予AMPK活化劑-白藜蘆醇 可增加阿茲海默癥小鼠的壽命。另一 AMPK活化劑-姜黃素亦被證實可作為阿茲海默癥治 療的潛在藥物。于本發明中，發明人發現腺嘌呤于神經細胞NeUr〇-2A中顯著加強自體吞噬 活性并降低A累積，此外腺嘌呤改善阿茲海默癥疾病小鼠的認知功能（實施例6、7)。根據 上述發現，腺嘌呤可作為神經退化性疾病的治療使用。
[0035] 這里使用的術語「神經退化」是指神經元結構或功能逐漸喪失的情況。神經退化 性疾病是為神經退化的結果，包括但不限制于阿茲海默癥、帕金森氏癥、漢丁頓舞蹈癥、肌 萎縮性脊髓側索硬化癥、脊髓小腦萎縮癥、脊髓性肌肉萎縮癥等。
[0036] 反應性氧族相關疾病 生物組織中，反應性氧族包括超氧化物自由基、羥基自由基及過氧化氫不斷的被產 生，且過量的反應性氧族與許多疾病有關，包括但不限制于：神經組織肌肉無力伴隨運動 失調與色素沉積性視網膜炎（NARP)、MELAS癥候群、肌抽躍癲癇合并紅色襤褸肌纖維癥 (MERRF)、Leber遺傳性視神經萎縮癥（LHON)、KSS癥候群、阿茲海默癥、帕金森氏癥、漢丁 頓舞蹈癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、弗里德賴希氏共濟失調（FA)及老化。許多研究報告 證實AMPK活化劑如AICAR，于高葡萄糖、棕梠酸或白蛋白誘導狀況下，可減少反應性氧族產 生。于本發明中，腺嘌呤降低HUVEC細胞中反應性氧族的生產（表6)，因此腺嘌呤可作為反 應性氧族相關的生理狀況或疾病的治療使用。
[0037] 癌癥 AMPK活化抑制環氧化酶-2與哺乳動物雷帕霉素標靶蛋白途徑，此二路徑為癌細胞 生長的重要機制。基于環氧化酶-2與哺乳動物雷帕霉素標靶蛋白對癌癥的重要性，活化 AMPK以達抑制環氧化酶-2與哺乳動物雷帕霉素標靶蛋白途徑被認為是合理的癌癥治療 策略。事實上，許多研究報告證實AMPK活化劑中斷癌癥發展，舉例而言，phenformin及 metformin于異體移植的癌癥小鼠模式被發現抑制乳癌腫瘤發展及生長。于本發明中，腺嘌 呤抑制人類肝癌細胞H印G2、人類乳腺癌細胞MCF7及結腸癌細胞HT29的細胞生長（實施 例11)。腺嘌呤對H印G2、MCF7、HT29的50%生長抑制濃度分別為544. 1，537. 5 and 531. 9 μΜ。于!fep G2移植小鼠模式，長期給予腺嘌呤顯著延遲腫瘤生長。根據本發明，以腺嘌呤 活化AMPK的治療方式，可預防或控制癌癥的形成或發展。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的 理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
[0039] 實施例1 AMPK活性分析 于小鼠肌肉細胞C2C12、小鼠纖維母細胞3T3、人類肝癌細胞H印G2、人類乳腺癌細 胞MCF7及人類結腸癌細胞HT29人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC、人類急性單核白血球細 胞株THP1、人類巨噬細胞U937、小鼠微神經膠細胞BV-2、神經母細胞瘤細胞Neur 〇2A及 毛乳突細胞Dermal Papilla進行腺噪呤對AMPK磷酸化影響的分析。細胞以Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)含 10% 胎牛血清（FBS)，4mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate 及 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA)于37 ° C、5% CO2環境下培養。3X IO5細胞接種于6-well盤，24小時后以指 定化合物處理細胞30分鐘，接著溶解細胞并以西方墨點法進行分析。等量蛋白質以十二烷 基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，接著轉印至聚偏氟乙烯膜。轉印后的聚偏氟乙烯 膜浸泡至溶于PBS緩沖液的3%牛血清白蛋白60分鐘后，分別加入抗磷酸化AMPK (Thr 172) 抗體（1:2000，Cell signaling)、抗AMPK抗體（1:2000，Cell signaling)，于4。C 作 用。16小時后加入對應的二抗于室溫下反應1小時。具免疫反應帶以冷光受質偵測，并以 底片紀錄信號。所得的信號掃描后以TotalLab Quant軟件（TotalLab)進行分析。
[0040] 腺嘌呤對AMPK活化的影響統整于表1。于所有測試細胞中，腺嘌呤均顯著活化 AMPK。
[0041] 表（1)
【權利要求】
1. 一種用于活化AMPK的化合物，其特征在于，其為腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受的 鹽。
2. 權利要求1所述化合物作為制備治療可被AMPK活化劑改善的疾病或生理狀況的藥 物的應用。
3. 權利要求1所述化合物作為制備治療發炎性生理狀況或疾病的藥物的應用。
4. 權利要求1所述化合物作為制備預防或治療前期糖尿病、第二型糖尿病、代謝癥候 群的一種或其組合的生理狀況或疾病的藥物的應用。
5. 權利要求1所述化合物作為制備預防或治療前期糖尿病、第二型糖尿病、代謝癥候 群的一種或其組合的生理狀況或疾病的藥物的應用。
6. 權利要求1所述化合物作為制備預防或治療阿茲海默癥的藥物的應用。
7. 權利要求1所述化合物作為制備治療可被自體吞噬作用改善的疾病或生理狀況的 藥物的應用。
8. 權利要求1所述化合物作為制備傷口愈合過程抑制疤痕形成的藥物的應用。
9. 權利要求1所述化合物作為制備加強傷口愈合的藥物的應用。
10. 權利要求1所述化合物作為制備哺乳動物中保護及治療受活性氧族傷害的細胞的 藥物的應用。
11. 權利要求1所述化合物作為制備預防或治療癌癥藥物的應用。
【文檔編號】A61P17/02GK104510736SQ201310444518
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】邱壬乙, 陳翰民, 郭正宜, 林俊材, 黃純芳 申請人:華安醫學股份有限公司