一種治療內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種治療內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法,屬于中藥制藥【技術領域】。將荊三棱干燥塊莖粉碎,加入3倍量85％的乙醇水溶液浸泡24h,然后回流提取2次,每次2h,濾過,合并提取液,濃縮。濃縮后的提取液加入其體積1.5倍量的水,分別用極性由小到大的萃取溶劑進行萃取,得到萃取液,然后經濃縮后上正相柱層析,用洗脫溶劑洗脫。收集到的洗脫液經干燥,得到荊三棱有效部位。以上收集到的萃取液中的萃取溶劑為乙酸乙酯；所述的洗脫溶劑至少包括由體積比為100：1、100：10、100：12的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑。經藥理實驗表明,本發明方法制備的荊三棱有效部位具有很好的抗內毒血癥的作用。
【專利說明】一種治療內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從中藥中提取有效部位的制備和應用領域，具體的說是涉及從荊三棱植物中得到的一種能治療內毒素血癥的有效部位及其制備方法。
【背景技術】
[0002]內毒素存在于革蘭氏陰性菌(gram-negative bacteria, G_細菌)菌體的細胞壁內，由細菌死后的細胞壁崩解時釋出，活菌亦可以發皰形式將內毒素釋出，其化學成分為脂多糖(lipopolysaccharide’LPS)，脂多糖的類脂A是LPS的“毒力中心”。少量的內毒素對促使肝臟網狀內皮系統處于激活狀態有一定意義，但是當大量的內毒素進入血循環時，會激發機體免疫細胞大量釋放多種細胞因子，破壞機體炎癥反應平衡，產生內毒素血癥，從而造成廣泛的病理反應，如全身炎癥反應綜合征(SIRS)、多器官功能不全綜合征(MODS)、多器官功能衰竭(MOF)等。近年來，許多研究表明感染性休克和繼發性多功能不全綜合征是膿毒癥患者的主要死亡原因。以往在防治與治療內毒素血癥時，往往從抑制產生內毒素的革蘭氏陰性菌的菌群增殖和減少腸道內毒素的吸收為出發點，如通過補充腸道正常菌群、保持腸粘膜的穩定性來減少腸道內毒素的產生和吸收。以上治療方法往往用到抗生素，但是大量的抗生素的應用會出現耐藥性菌，同時被殺死的革蘭氏陰性菌會突然釋放大量內毒素引起內毒素血癥的亢進或內毒素休克。因此在隨后的大量研究中，開發了一些其他藥物，如直接拮抗 內毒素的類脂A結構類似物；具有殺菌、中和內毒素、抑制免疫細胞活性作用的抗內毒素蛋白及多肽類。然而臨床研究表明，迄今為止，還沒有一種這些類型的藥物能夠顯著降低內毒素血癥患者的死亡率。針對內毒素血癥引起全身炎癥的反應，近些年學者提出了多靶點藥物可能是防治與治療內毒素血癥的一個方向。中藥具有多靶點作用，對以中醫理論表述病機為“熱毒內蘊、瘀血內阻”的內毒素血癥的防治與治療具有重要價值。
[0003]荊三棱(Scirpus yagara Ohwi)為莎草科薦草屬植物，其干燥塊莖在唐代就作為中藥三棱使用，是三棱最早使用的品種。其在我國的東北、浙江、江蘇、安徽等地區均有分布。荊三棱，性平、味苦，入肝、脾經，具有破血行氣、消積止痛功能，多用于月經不調，積聚結塊等病癥，是臨床常用的活血化瘀中藥。目前已從荊三棱塊莖中分離得到有黃酮類、苯丙素類、二苯乙烯類、4'-苯基異香豆素類、酚酸類等化合物(Kangkun, et al.Nat Prod Res Dev, 2008，20:639-640, 649 ;張鐵軍，等.現代藥物與臨床，2009,24(1):36-38;崔曉東，等.中國藥學學報，2012，47 (24):1987-1989 ；QiaoliLiang, et al.Fitoterapia, 2013, 84(1):170-173)。近些年國內外學者發現部分二苯乙烯類、4'-苯基異香豆素類和酚酸類化合物具有抗炎、抗HIV等方面的藥理作用(Li Ou, etal.Biol.Pharm.Bull, 2003, 26 (11):1511-1516 ；Gu-xunYang, et al.Planta Med, 2005, 71:569-571)。迄今，尚未見到有關荊三棱有效部位具有治療內毒素血癥的報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種抗內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法。本發明的制備方法工藝操作簡單，能夠提供性能穩定、藥理活性好的荊三棱植物有效部位。
[0005]一種治療內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法，包括以下步驟:
[0006](I)提取:取荊三棱的干燥塊莖，粉碎，用提取溶劑浸泡過夜，再用提取溶劑加熱回流提取，合并提取液，減壓濃縮至無醇味。
[0007](2)柱層析:將步驟(I)的濃縮液加1.5倍水稀釋成懸浮液，再分別用極性由小到大的萃取溶劑進行萃取，得到萃取液，萃取液經濃縮后，上正相柱層析用洗脫溶劑進行洗脫；收集洗脫液，干燥，得到荊三棱有效部位。
[0008]上述步驟(I)所述的提取溶劑為乙醇水溶液，該提取溶劑使用安全廉價；其濃度為70%-95%，該濃度范圍內的乙醇水溶液對植物組織的滲透性較好，非常適合荊三棱等塊莖類藥材的提取，從而能充分的獲取荊三棱有效部位的活性成分。
[0009]上述步驟(I)每次加入相當于藥材的3-4倍重量的提取溶劑，在90°C-100°C加熱回流提取，每次提取時間為2-3h，提取2-3次。
[0010]上述步驟⑵所述的萃取溶劑至少包括乙酸乙酯。
[0011]上述步驟(2)所述的正相柱層析為硅膠柱層析，硅膠目數為100-200目，洗脫溶劑至少包括由體積比為100 =UlOO =IOUOO:12的石油醚與乙酸乙酯組成的洗脫溶劑。
`[0012]洗脫溶劑有比較嚴格的要求，并對體積比也有所限制，該洗脫溶劑洗脫能力中等，從而能夠集中得到性能穩定、藥理活性好的荊三棱有效部位。當選擇的洗脫溶劑極性太大，能夠得到過多與所要藥理活性無關的物質`，從而整體的降低有效部位物質濃度，反之洗脫溶劑極性太小，就不能充分得到所要的有效部位。
[0013]每次加入相當于藥材的3-4倍重量的提取溶劑，在90°C-100°C加熱提取，每次提取的時間為2-3小時，提取2-3次。在這樣的提取條件下，不但節省了藥材和提取溶劑的使用量，而且能充分將藥材中有效部位提取，提高了提取率。
[0014]所用的洗脫溶劑包括由體積比為100 =OUOO =UlOO:2,100:4、100:6、100:8、100 =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑，并按極性由小到大依次進行梯度洗脫。通過薄層色譜(TLC)檢視荊三棱有效部位位于由體積比為100:1的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑及由體積比為100 =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑洗脫后的洗脫液中，合并以上三部分洗脫液。
[0015]所述的制備方法制備的荊三棱有效部位，含有4,-苯基異香豆素類、二苯乙烯類，酚酸類的化合物。
[0016]本發明中的荊三棱有效部位可制成藥劑學上任何可接受的制劑，例如制成口服給藥制劑:片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液等；制備成直腸給藥制劑:栓劑等；制備成皮膚給藥制劑:膏劑、乳劑、貼劑等；制備成注射給藥制劑:肌肉注射劑、靜脈注射劑
坐寸ο
[0017]本發明中的荊三棱有效部位在藥劑學上可以接受的載體包括但不限于:賦形劑，如淀粉及其衍生物、糊精等；崩解劑，如羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑，如硬脂酸鎂等；包糖衣材料，如蔗糖、滑石粉、明膠、色素等；其他如緩沖液、鹽水等。
[0018]所述的制備方法制備的荊三棱有效部位在內毒素血癥小鼠的實驗研究中表明本發明的荊二棱有效部位具有抗內毒素血癥功效。在內毒素血癥小鼠的實驗研究中，40只小鼠隨機分成4組，每組10只，分別為對照組、模型組、給藥低劑量組、給藥高劑量組，以各組小鼠成活率為指標，在造模后觀察各組小鼠7天，最后對照組小鼠的成活率為100%，模型組為0%，給藥低劑量組為60%，給藥高劑量組為70%。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下優點:本發明提供的荊三棱有效部位，生理活性強，具有質量可控、劑量小、使用方便等優點，有別于傳統中藥的粗、大、黑的落后面貌。
[0020]本發明所用的荊三棱在我國東北、內蒙古、浙江、江蘇等地都有分布，其自然資源豐富，價廉易得；薦草屬植物是草本植物，再生能力強，即使進行規模化生產也不會造成資源枯竭，對環境影響也較小；本發明提供的荊三棱有效部位的制備方法操作簡單，生產成本低，適用于工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]見說明書附圖:荊三棱有效部位高效液相色譜圖【具體實施方式】
[0022]以下通過具體實施例對本發明的內容作進一步詳細的說明，但這些實施例絕不應該被理解為對本發明的限制。本領域的技術人員在不脫離本發明上述思想情況下，對本發明實施所做的任何變動，均包含在本發明之內。
[0023]實施例1抗內毒素血癥有效部位的制備
[0024](I)提取:取荊三棱干燥塊莖20kg，粉碎，用3倍量85%的乙醇水溶液浸泡I天后，在90°C加熱回流提取，每次提取時間為2h，總共提取2次，合并2次提取液。
[0025](2)柱層析:將步驟(I)得到的提取液減壓濃縮至無醇味，濃縮液加1.5倍水稀釋成懸浮液，再分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯部位萃取液合并濃縮得浸膏90.5g。將乙酸乙酯部位浸膏進行正相硅膠(100-200目)柱層析，然后分別使用多個不同的洗脫溶劑進行洗脫，各個洗脫溶劑都是由石油醚與乙酸乙酯組成，且各個洗脫溶劑中石油醚和乙酸乙酯的體積比分別為 100:0，100:1，100:2，100:4，100:6，100:8，100:10，100:12，并按極性從小到大依次進行梯度洗脫。薄層色譜(TLC)檢視荊三棱有效部位黃綠色斑點與暗斑分別集中于石油醚和乙酸乙酯體積比為100:1的洗脫溶劑的洗脫液以及石油醚和乙酸乙酯的體積比為100 =IOUOO:12的洗脫溶劑的洗脫液，收集三部分洗脫液，用旋轉蒸發儀在60°C減壓濃縮30min，即得荊三棱有效部位14.0g。
[0026]減重法精密稱取實施例1制備的荊三棱有效部位11.04mg,加色譜甲醇定容至IOml的容量瓶內，取少量定容后的浸膏溶液，用Waters2996HPLC分析，液相色譜條件:流速為0.5ml / min ;紫外吸收波長:300nm ;洗脫體系為甲醇-水；甲醇的質量分數為10%-100% ;洗脫時間:0-65min。其高效液相色譜圖見說明書附圖。
[0027]實施實例2荊三棱有效部位的體內抗內毒素血癥實驗
[0028]實驗材料
[0029](I)實驗用藥液的配制:分別減重法精密稱取荊三棱有效部位適量兩份，分別加適量0.5% CMC-Na溶液，配成低、高兩個濃度的藥液。
[0030](2)實驗用內毒素:大腸桿菌脂多糖(LPS，055:B5,美國Sigma公司)。
[0031](3)實驗動物:BALB / c雌性小鼠，購自于南京青龍山實驗動物中心，合格證為:SOXK(蘇)009-0001,體重范圍:18 -22g。
[0032]實驗方法
[0033]本實驗給藥方式為灌胃給藥，造模方法為腹腔注射內毒素(15mg / kg)造成內毒素血癥模型，具體實驗方法如下。精密稱取內毒素，用PBS緩沖溶液配成1.5mg / ml的溶液。將40只小鼠隨機分成4組，每組10只，第一組(對照組)，連續3d給小鼠灌胃0.5%CMC-Na溶液0.2ml/10g，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.1ml / IOg PBS緩沖溶液，6h后再給小鼠灌胃0.5 % CMC-Na溶液0.2ml / 1Og ;第二組(模型組)，連續3d給小鼠腹腔注射0.1ml / 1Og PBS緩沖溶液，ltime / d,第3d腹腔注射PBS緩沖溶液Ih后，給此組小鼠腹腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g);第三組(給藥低劑量組)，連續3d給小鼠灌胃低劑量藥液，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.lml/10g腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g),6h后再給小鼠灌胃低劑量藥液I次；第四組(給藥高劑量組)，連續3d給小鼠灌胃高劑量藥液，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.1ml / IOg腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g)，6h后再給小鼠灌胃高劑量藥液1次。
[0034]觀察指標及數據處理方法
[0035]注射LPS溶液后，以各組小鼠的存活率為指標，觀察并記錄7d，計算每組小鼠的死亡個數和存活率，實驗結果見附表一。
[0036]附表一荊三棱有效部位的體內抗內毒素實驗結果(成活率)
【權利要求】
1.一種治療內毒素血癥的中藥有效部位的制備方法，包括以下步驟: (1)提取:取荊三棱的干燥塊莖，粉碎，用乙醇水溶液浸泡，提取，得到提取液。 (2)柱層析:將步驟(I)得到的提取液濃縮，加水溶解，再分別用極性由小到大的萃取溶劑進行萃取，得到萃取液。萃取液經濃縮后上正相柱，用洗脫溶劑進行洗脫。收集洗脫液，干燥，得到荊三棱有效部位。 所述的萃取溶劑有乙酸乙酯。 所述的洗脫溶劑至少包含由體積比為100 =UlOO =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑。
2.根據權利要求1所述的荊三棱有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所用的乙醇水溶液為70 %-95 %。
3.根據權利要求1所述的荊三棱有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，每次加入相當于藥材的3-4倍重量的提取溶劑，在90°C-100°C加熱回流提取，每次提取時間為2-3h，提取2-3次。
4.根據權利要求1所述的荊三棱有效部位的制備方法，其特征在于，所述的萃取溶劑包括石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，萃取時按極性大小依次使用單一溶劑等體積進行萃取。
5.根據權利要求1所述的荊三棱有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的正相柱所用的填料為100-200目的柱層析硅膠。
6.根據權利要求1所述的荊三棱有效部位的制備方法，其特征在于，所述的洗脫溶劑至少由體積比為100:1的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑、由體積比為100:10的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑、`由體積比為100:12的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫溶劑，并按極性由小到大進行梯度洗脫。
7.根據權利要求1-6任一項所述的制備方法制備荊三棱有效部位在制備抗內毒素血癥藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK103446378SQ201310426523
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】梁僑麗, 崔曉東, 李軍, 鄒娜姝, 呂高虹, 袁冬平 申請人:南京中醫藥大學