一種去氧鬼臼毒素作為胰島素樣生長因子受體拮抗劑用途

一種去氧鬼臼毒素作為胰島素樣生長因子受體拮抗劑用途
【專利摘要】本發明發現了一種去氧鬼臼毒素作為胰島素樣生長因子受體酪氨酸激酶拮抗劑的用途，包括以下步驟：以384低體積白色板為反應容器，反應體系中每孔加入2μL酶溶液，2μL底物溶液，4μL緩沖液(或4μL化合物溶液)，2μLATP溶液，共10μL反應體系，在室溫條件下反應指定時間。終止反應時再加入5μL抗體，5μL異藻藍蛋白，室溫孵育1小時后用Envision進行檢測。模型建好后對化合物進行初篩，對初篩活性較好的進行復篩，采用Prism5.0(Graphpad Software，USA)統計分析軟件計算活性化合物IC50。本發明的優點主要有：1)通過測定得到的熒光比值計算出化合物對激酶的抑制率，從而判斷化合物對激酶的抑制作用強弱；2)熒光檢測值靈敏度更高，提高檢測結果精確度；3)分析結果穩定可靠，重現性好。
【專利說明】一種去氧鬼臼毒素作為胰島素樣生長因子受體拮抗劑用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種去氧鬼白毒素類用于胰島素樣生長因子受體抑制劑的用途。

【背景技術】
[0002] 去氧鬼臼毒素是從中藥桃兒七Sinopodophyllum emodi (Wall.)中提取純化而 得的化合物，研究表明其具有明確的對腫瘤細胞體外抗增殖作用（Planta Medica，1993， 59(3) :246-249.)、環氧酶、脂氧酶抑制作用（Biol. Pharm. Bull，2004, 27 (6) :786-788.)和 小鼠醋酸扭體鎮痛作用（Pharm Biol. 2013 ;51 (5) :566-72.)。
[0003] 膜島素樣生長因子受體（insulin-like growth factor I receptor，IGF1R)屬 于受體型酪氨酸激酶（PTK)，參與調節細胞存活、增殖、凋亡、遷移等多個過程，并且在腫瘤 新生和惡性轉化以及腫瘤治療的耐藥性方面發揮著重要的作用。IGFlR廣泛分布于人體 組織細胞膜上，為胰島素受體家族的一員。是由2個α亞基和2個β亞基組成的四聚體 結構（α 2, β 2)，α亞單位為胞外配基結合部位，β亞單位跨膜分布，有胞膜外區域、跨膜 區域和含有酪氨酸激酶活性的胞內區域。β亞單位的不同區域可介導IGFIR不同的生物 學活性，促進細胞集落的形成，使細胞獲得轉化功能、抗細胞凋亡及促有絲分裂等生物學功 能。有臨床前研究表明，IGFlR抑制劑與化療藥物聯用可增加腫瘤細胞對治療的敏感性，如 IGFlR小分子抑制劑NVP-AEW541與化療藥物長春新堿，放線菌素D，異環磷酰胺合用時，能 夠增加狗在體腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。因此，IGFlR成為重要抗腫瘤治療靶點。本 實驗運用均相時間分辨熒光技術，對待測樣品抑制胰島素樣生長因子受體活性的情況進行 高通量篩選，選擇活性較好的先導化合物進入分子靶向抗腫瘤藥物深入開發，待測樣品購 置美國ChemDiv公司高通量篩選化合物庫。


【發明內容】

[0004] 為了開發胰島素樣生長因子受體拮抗劑從而為抗腫瘤的治療尋找新的候選藥物， 本發明在采用胰島素樣生長因子受體抑制劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋找先導化 合物，發現了一類胰島素樣生長因子受體抑制劑，為新型的抗腫瘤分子靶向藥物開發提供 先導化合物。本發明可為此類臨床抗腫瘤治療藥物的開發提供先導化合物，為新型抗腫瘤 分子靶向藥物開發提供線索和實驗依據。
[0005] 本發明的技術方案為：采用均相時間分辨熒光方法建立體外胰島素樣生長因子受 體拮抗劑高通量篩選模型，初篩，復篩發現了一種具有抗腫瘤活性的候選藥物。具體步驟如 下：
[0006] 步驟一：建立胰島素樣生長因子受體抑制劑高通量篩選模型。
[0007] 步驟二：陽性藥測試和模型穩定性驗證。
[0008] 步驟三：建立高通量篩選實驗方案并開展相關待測樣品活性篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0009] 圖I :IGF1R激酶濃度梯度優化實驗.n=3厶士s
[0010] 圖2 :1GF1R激酶反應時間優化實驗.n=3, X 土s
[0011] 圖3 :1GF1R激酶底物濃度優化實驗.η=3, ? 土s
[0012] 圖4 :1GF1R激酶ATP濃度優化實驗· n=3, I 土S
[0013] 圖5 :陽性藥十字孢堿量效曲線.n=3, jc ±s
[0014] 圖6 :去氧鬼日毒素抑制曲線.n=3, X 土s

【具體實施方式】
[0015] 以下結合【專利附圖】

【附圖說明】本發明的【具體實施方式】：
[0016] 1檢測方法
[0017] 本實驗采用均相時間分辨熒光方法對反應體系進行檢測，該方法分為兩個步驟： 一是酶促反應，即當加入ATP后啟動反應，激酶使底物發生磷酸化反應，將磷酸根連接在有 生物素標記的底物上；二是終止及檢測過程，在這個過程中EDTA終止了反應的進行，有銪 元素標記抗磷酸化酪氨酸抗體靠近底物的磷酸根上，標記XL665的異藻藍蛋白結合在底物 的生物素標記上，兩個熒光基團在互相靠近的過程中發生能量共振轉移并在665nm處產生 突光，游離的TK antibody (標記銪離子）在620nm處發生突光，此信號可作為背景信號，而 游離的SA-XL665只產生短暫的熒光，通過延后檢測時間（加入終止劑后1小時再進行檢 測）可將其忽略。胰島素樣生長因子高通量篩選模型的優化實驗中，酶濃度優化實驗結果 見圖1，酶反應時間優化實驗結果見圖2,底物濃度優化時間結果見圖3, ATP濃度優化實驗 結果見圖4,陽性化合物進行質控實驗結果見圖5。
[0018] 2模型建立及化合物篩選
[0019] 以384低體積白色板為反應容器，反應體系中每孔加入2 μ L酶溶液，2 μ L底物溶 液，4 μ L緩沖液（或4 μ L化合物溶液），2 μ LATP溶液，共10 μ L反應體系，在室溫條件下 反應指定時間。終止反應時再加入5 μ L抗體溶液，5 μ L異藻藍蛋白溶液，在室溫下孵育 60min。之后用Envision進行檢測。其中實驗反應中的試劑溶液使用BiomekNXP自動化加 樣儀器和Multidrop自動分液器進行加樣。模型建好后對待測小分子化合物進行了初篩， 對初篩結果活性較好的進行復篩，采用Prism5.0 (Graphpad Software，USA)統計分析軟件 計算活性化合物IC5tl，先導化合物活性結果見圖6。
[0020] 胰島素樣生長因子受體抑制劑活性篩選實驗結果
[0021] 篩選得到的IGFlR受體抑制劑其結構與IC5tl如下：
[0022]

【權利要求】
1.要求保護的式I的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備胰島素樣生長因子受 體抑制劑的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK104434909SQ201310421495
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】嚴明, 胡潔, 高鵬, 張陸勇, 吳葆金 申請人:中國藥科大學