一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體及其制備方法，包括相偶聯的針對病毒核心蛋白的抗體和蛋白轉導域，兩者偶聯后構成穿膜抗體。本發明提供的膜抗體在蛋白轉導域的作用下，被賦予細胞膜穿透能力，不但可以進入感染了病毒的靶細胞和靶器官，而且可在細胞內靶向病毒核心蛋白，通過抗原抗體高識別力、高親和力的結合，阻斷病毒的包裝和復制，達到治療病毒感染的目的。
【專利說明】-種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體及其制備方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬于抗病毒治療【技術領域】，涉及一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體及其制 備方法。 【背景技術】
[0002] 慢性病毒如HBV、HIV、HCV等感染嚴重危害人類健康，已成為國家重點防治的疾 病，病毒感染的治療難題迫在眉睫。病毒寄生在宿主細胞內以復制的方式進行增殖。無論 是體液免疫還是細胞免疫，免疫作用機制是在細胞外液和細胞膜表面完成的。通過增強病 毒外膜抗原的免疫原性和突破宿主的免疫耐受來治療和預防此類疾病的效果非常有限。如 何設計細胞內阻斷病毒組裝和復制的抗病毒免疫學方法成為亟待解決的問題。
[0003] 既往抗病毒感染的研究取得很大進展，但仍不理想。抗病毒藥物如細胞因子(干擾 素和胸腺肽等)，缺乏特異性，半衰期短，有效率僅為10%?30% ;核(苷)酸類似物、病毒復制 酶的抑制劑、雞尾酒療法大都對活躍復制的病毒有抑制作用，卻不能清除潛伏狀態或非復 制期的病毒，長期使用毒副作用大，易耐藥、易復發。治療性疫苗如蛋白質疫苗和DNA疫苗 治療機制未完全明確、高效誘導免疫反應的疫苗難以設計，佐劑的選擇、抗病毒藥物聯合使 用，疫苗安全性問題，以及過量誘導免疫應答造成的危害仍在試探與研究。
[0004] 生物治療的新理論、新方法如依賴核酸的基因治療：RNAi技術、核酶、siRNA、 microRNA、核酸適配子、肽核酸技術等，在體外細胞內的研究顯示能夠有效地抑制病毒的復 制，但寡聚核酸合成困難、易被降解、導入困難、非特異性等缺點卻難以克服。依賴蛋白質的 基因治療，如胞內抗體、肽類適配子技術、抗病毒蛋白的轉基因治療等是在病毒蛋白的翻譯 水平抑制病毒的復制。但該技術遇到的挑戰是如何篩選和長期穩定表達針對病毒復制和轉 化蛋白具有中和作用的細胞內抗體，并在細胞內還原條件下形成正確的結構。
[0005] 基因治療的載體作為外來抗原可激活機體的免疫應答使載體失活，載體導入也可 能會對人體造成嚴重的后果，細胞內真核表達抗體，會形成永久的基因改變。因此在整體水 平采用基因治療的安全性評估成為最棘手的問題。因此，免疫治療應該成為清除病毒最主 要的機制。既往清除病毒的免疫機制是針對病毒的外衣殼蛋白質抗原，刺激機體產生中和 性抗體和細胞毒性T細胞的結果。但HCV和HIV等由于病毒外衣殼蛋白質的免疫原性低和 免疫表位的結構域多變異等原因，難以制備具有中和作用的抗體發揮免疫預防和免疫治療 的作用。目前依然不能成功建立清除病毒的免疫學治療方法。
[0006] 此類病毒的核心蛋白在病毒的生活周期中發揮著重要的作用，是病毒復制和包裝 的不可獲缺的重要組成部分，也是病毒細胞免疫的重要調控元件，并且核心蛋白具有變異 性小，免疫原性強的特點，病毒感染后能夠持久產生高效價抗體。
【發明內容】
[0007] 本發明解決的問題在于提供一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體及其制備方法，該 方法適于不同的慢性病毒感染的治療，比如HIV、HCV、HCMV、HPV、EB、HSV等等。
[0008] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0009] -種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，包括相偶聯的針對病毒核心蛋 白的抗體和蛋白轉導域，兩者偶聯后構成穿膜抗體。
[0010] 所述的針對病毒核心蛋白的抗體為單克隆抗體，所述的蛋白轉導域為TAT、ant、 HSV VP22、PDX1、P印-1 或 TransportanlO 的穿膜肽；
[〇〇11] 所述的針對病毒核心蛋白的抗體與蛋白轉導域通過EDC偶聯。
[0012] 所述的針對病毒核心蛋白的抗體為針對HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的抗 體，所述的蛋白轉導域為SEQ. ID. NO. 1所示的穿膜肽。
[0013] 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體抑制細胞病毒復制，并抑制細胞內、外病毒 的表達。
[0014] 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體為HBcMAb-TAT PTD，能夠抑制細胞內、夕卜 HBsAg、HBeAg及細胞內HBcAg的表達，且存在劑量依賴關系。
[0015] 一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體的構建方法，包括以下步驟：
[0016] 分別將針對病毒核心蛋白的抗體、蛋白轉導域溶解后，加入到EDC溶液中，室溫下 充分反應；
[0017] 反應完成后加入飽和硫酸銨進行沉淀，4°C放置過夜，離心去上清，PBS緩沖液溶解 沉淀；將溶解產物放置于透析袋中，加入PBS緩沖液透析，3?4h更換一次透析液；更換3? 4次，直至透析完全；將透析的產物全部收回，得到靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體。
[0018] 所述的針對病毒核心蛋白的抗體為HBcMAb，蛋白轉導域為TAT。
[〇〇19] 所制備的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體的轉染方法，包括以下操作：
[0020] 靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體與宿主細胞共孵育，然后加入含10%FBS和1%雙抗 的DMEM高糖培養基，37°C，5%C0 2培養箱中培養2h ;用抗TAT-FITC熒光抗體的免疫熒光法 檢測穿膜抗體穿膜效應，篩選有細胞內有熒光的細胞作為轉染成功的細胞。
[0021] 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體在制備抗病毒感染的藥物中的應用。
[0022] 所述的藥物為抑制病毒在細胞內外增殖和病毒DNA復制的藥物。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0024] 本發明提出以病毒核心蛋白作為抗病毒治療的新靶點，使用化學偶聯的方法α匕 如采用EDC)將病毒的核心抗體與蛋白質轉導結構域（PTD)進行偶聯，制備成具有抗病毒作 用的穿膜抗體。該穿膜抗體在蛋白轉導域的作用下，被賦予細胞膜穿透能力，不但可以進入 感染了病毒的靶細胞和靶器官，而且可在細胞內靶向病毒核心蛋白，通過抗原抗體高識別 力、高親和力的結合，阻斷病毒的包裝和復制，達到治療病毒感染的目的。
[0025] 本發明是使用蛋白質轉導機制改造目前僅作為感染指標的病毒核心抗體，制備成 具有穿膜功能的治療性抗體，達到抗病毒作用的目的，這是對感染免疫學理論的創新，同時 該抗體可進入細胞內抑制病毒組裝和復制，使用了細胞內免疫機理，又是對系統抗感染免 疫機理的創新探索。
[0026] 具體的本發明以HBV為研究對象，建立抗HBV感染的穿膜抗體細胞內抗病毒的免 疫學治療新方法，結果表明HBcMAb-TAT穿膜抗體在Η印G2. 2. 15細胞培養液體中抗病毒結 果，細胞培養上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA結果均顯現出明顯的劑量依賴關系，與陰性對照相 t匕，隨著加入穿膜抗體濃度的增加，對ifepG2. 2. 15細胞病毒復制和蛋白表達不斷降低，且 降低的程度逐漸加大，即抑制作用不斷加大。BSA-TAT對照組和HBcAg對照組則未見到抑制 病毒復制和蛋白表達的作用。與陰性對照比，可見HBV DNA的抑制率和HBsAg、HBeAg抑制 率均隨加入的穿膜抗體的濃度呈遞增趨勢。結果表明HBcMAb-TAT PTD體外細胞水平具有 明顯的抗病毒作用。
[0027] HBcMAb-TAT穿膜抗體在Η印G2. 2. 15細胞裂解液體中抗病毒結果，細胞培養裂解 液中HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBV DNA結果均顯現出明顯的劑量依賴關系，與陰性對照相比， 隨著加入穿膜抗體濃度的增加，對Η印G2. 2. 15細胞內HBV DNA和HBsAg、HBeAg的表達不 斷降低，且降低的程度隨加入的穿膜抗體的量逐漸加大，即抑制作用不斷加大。HBcAg則尤 其明顯，20. 0 μ g/mL和40. 0 μ g/mL組HBeAg的量幾乎無法檢測到。而BSA-TAT對照組和 HBcAg對照組則沒有作用。細胞裂解液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg和HBcAg的抑制率均隨加 入的穿膜抗體的濃度呈遞增趨勢。結果表明HBcMAb-TAT PTD體外細胞水平具有明顯的抑 制HBsAg、HBeAg和HBcAg表達和HBV DNA復制的作用。
[0028] 所述的方法也同樣適用于HCV、HIV、HCMV、EB病毒、HPV等慢性病毒感染性疾病的 治療。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1為ELISA檢測穿膜抗體的抗原識別功能；
[0030] 圖2為免疫熒光檢測穿膜抗體與Η印G2. 2. 15細胞共孵育的穿膜效應；
[0031] 圖3為HBcMAb-TAT PTD對Η印G2. 2. 15細胞的膜通透性的影響；
[0032] 圖4為細胞培養液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的檢測結果及劑量依賴關系；其中 (i)、各實驗組之間的檢測結果，（ii)、HBcMAb-TAT PTD各劑量組之間的量效關系曲線，A為 HBsAg檢測結果，B為HBeAg檢測結果，C為HBV DNA檢測結果；
[0033] 圖5為細胞裂解液中HBSAg、HBeAg、HBCAg及HBV DNA檢測結果及量效關系；（i)、 各實驗組之間的檢測結果；（ii)、HBcMAb-TAT PTD各劑量組之間的量效關系曲線；A為 HBsAg檢測結果，B為HBeAg檢測結果，C為HBcAg檢測結果，D為HBV DNA檢測結果；
[0034] 圖 6 為 HBcMAb-TAT PTD 對 Η印G2. 2. 15 細胞 HBsAg、HBeAg、HBcAg 分泌表達及 HBV DNA復制的抑制率；其中A為細胞裂解液各項指標的抑制率，B為細胞上清液各項指標的抑 制率。 【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0036] 本發明提出以病毒核心蛋白作為抗病毒治療的新靶點，使用化學偶聯的方法，將 病毒的核心抗體與蛋白質轉導結構域（PTD)進行偶聯，制備成具有抗病毒作用的穿膜抗體。 通過賦予該抗體細胞膜穿透能力，使其進入感染了病毒的靶細胞和靶器官，在細胞內識別 病毒核心蛋白，通過抗原抗體高識別力、高親和力的結合，阻斷病毒的包裝和復制，達到治 療病毒感染的目的。下面以HBV為研究對象，建立抗HBV感染的穿膜抗體細胞內抗病毒的 免疫學治療新方法，并結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明 的解釋而不是限定。
[0037] 本發明所提出的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，包括相偶聯的針對病毒核心蛋白 的抗體和蛋白轉導域，兩者偶聯后構成穿膜抗體。
[0038] 具體的，所述的針對病毒核心蛋白的抗體為單克隆抗體，所述的蛋白轉導域為 TAT、ant、HSV VP22、PDX1、P印-1 或 TransportanlO 的穿膜肽；
[0039] 所述的針對病毒核心蛋白的抗體與蛋白轉導域通過EDC偶聯。
[0040] 而所述的針對病毒核心蛋白的抗體為針對HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的 抗體。
[0041] 實施例1: EDC偶聯HBcMAb和TAT，制備HBcMAb-TAT PTD穿膜抗體
[0042] 具體選擇HBV的核心抗體作為對象，HIV-TAT蛋白作為蛋白轉導域，用EDC[l_Ethy 1-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide Hydrochloride]將兩種蛋白進行縮合偶聯， 使之成為改構的新型物質即穿膜抗體，該物質不但具有原抗體的生物學活性，即抗體活性， 可與相對應的抗體高效的結合，同時又具有蛋白轉導的功能，可以進入細胞中，發揮特殊的 生物學功效。
[0043] 按照EDC的連接效能，具體連接步驟如下：
[0044] 將HBcAb單克隆抗體2mg加入200 μ 1去離子H20,充分溶解，濃度為10mg/ml。同 時稱量TAT(序列為：YGRKKRRQRRR，也即如SEQ. ID. NO. 1所示)2mg加入500 μ 1交聯緩沖液， 充分溶解。稱量EDC1 lmg，將溶解的HBcAb單克隆抗體和ΤΑΤ依次加入盛有EDC的ΕΡ管中， 用200 μ 1去離子H20將盛有HBcAb單克隆抗體的EP管洗凈殘留，加入盛有EDC的EP管中。 配置好的EDC偶聯溶液共計體積900 μ 1。室溫放置2h，充分反應，并間隔半小時混勻一次。 反應完成后加入飽和硫酸銨1000 μ 1，逐滴加入，使其沉淀。4°C放置過夜。混勻沉淀產物， 分裝在兩只1. 5ML EP管中，用100μ 1硫酸銨洗凈反應瓶。12000rpm離心10分鐘，去上清。 PBS緩沖液溶解沉淀，盡量使用最小體積的PBS溶解沉淀物。將溶解產物放置于透析袋中， 用100 μ 1 PBS洗滌離心管裝入透析袋。兩端用夾子夾好。檢查有沒有滲漏現象，將透析袋 放入燒杯中，加入PBS緩沖液300ml透析，3-4h更換一次透析液。更換3-4次，直至透析完 全。將透析的產物全部收回，并用100 μ 1 PBS將透析袋洗凈。最終體積為2000 μ 1。
[0045] 并對回收的穿膜抗體進行蛋白定量(采用考馬斯亮藍G-250比色法)595nm分光光 度計比色，計算樣本蛋白含量。偶聯穿膜抗體的蛋白含量為1.45mg/ml。
[0046] 實施例2 :ELISA檢測穿膜抗體的生物學活性與最適反應稀釋度
[0047] 用100ng的HBcAg包被酶標反應板，檢測穿膜抗體的抗原抗體識別能力。
[0048] 配制HBcAb-TAT的不同稀釋度反應液：經蛋白定量的HBcMAb-TAT稀釋為10. 0、 5. 0、2· 5 μ g/ml 〇
[0049] 配制鼠抗TAT-HRP的不同稀釋度反應液，分別為1:500、1:1000、1 :2000、1:4000。
[0050] 力口 10. 0 μ g/ml HBcMAb 和 10. 0 μ g/ml TAT PTD 做對照，PBS 緩沖液為空白對照。
[0051] ELISA反應板設計：
[0052] 表1檢測HBcMAb-TAT PTD偶聯抗體生物學活性的ELISA實驗設計
[0053]
【權利要求】
1. 一種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，包括相偶聯的針對病毒核心蛋白 的抗體和蛋白轉導域，兩者偶聯后構成穿膜抗體。
2. 如權利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，所述的針對病毒 核心蛋白的抗體為單克隆抗體，所述的蛋白轉導域為TAT、ant、HSV VP22、PDX1、P印-1或 TransportanlO 的穿膜肽； 所述的針對病毒核心蛋白的抗體與蛋白轉導域通過EDC偶聯。
3. 如權利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，所述的針對病毒 核心蛋白的抗體為針對HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的抗體，所述的蛋白轉導域為 SEQ. ID. NO. 1所示的穿膜肽。
4. 如權利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，所述的靶向病毒 核心蛋白的穿膜抗體抑制細胞病毒復制，并抑制細胞內、外病毒的表達。
5. 如權利要求4所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體，其特征在于，所述的靶向病毒 核心蛋白的穿膜抗體為HBcMAb-TAT PTD，能夠抑制細胞內、外HBsAg、HBeAg及細胞內HBcAg 的表達，且存在劑量依賴關系。
6. -種靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟： 分別將針對病毒核心蛋白的抗體、蛋白轉導域溶解后，加入到EDC溶液中，室溫下充分 反應； 反應完成后加入飽和硫酸銨進行沉淀，4°C放置過夜，離心去上清，PBS緩沖液溶解沉 淀；將溶解產物放置于透析袋中，加入PBS緩沖液透析，3?4h更換一次透析液；更換3? 4次，直至透析完全；將透析的產物全部收回，得到靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體。
7. 如權利要求6所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體的構建方法，其特征在于，所述 的針對病毒核心蛋白的抗體為HBcMAb，蛋白轉導域為TAT。
8. 基于權利要求6或7所制備的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體的轉染方法，其特征在 于，包括以下操作： 靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體與宿主細胞共孵育，然后加入含10%FBS和1%雙抗的 DMEM高糖培養基，37°C，5%C02培養箱中培養2h ;用抗TAT-FITC熒光抗體的免疫熒光法檢測 穿膜抗體穿膜效應，篩選有細胞內有熒光的細胞作為轉染成功的細胞。
9. 權利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗體在制備抗病毒感染的藥物中的應 用。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的藥物為抑制病毒在細胞內外增殖和 病毒DNA復制的藥物。
【文檔編號】A61P31/18GK104059153SQ201310418409
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】王亞文, 李義平, 劉正穩, 惠凌云, 劉希, 馮艾, 王威, 張琳, 楊廣笑, 王全穎 申請人:西安交通大學醫學院第一附屬醫院