一種仔豬紅痢c型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，將C型產氣莢膜梭菌的菌種NCTC3180接種于血平板培養基上，37℃厭氧培養36h；將培養物采用自制的產毒培養基（100毫升PBS緩沖液、2克蛋白胨、1克糊精、2克酵母提取物、1.2克L-精氨酸），在厭氧環境下振蕩培養制備類毒素，然后將其滅活、過濾加入佐劑制成。使用時，肌肉注射，母豬在分娩前一月和半月各注射一次，劑量為每次5-10毫升。本發明用于免疫妊娠后期的母豬，新生仔豬通過初乳獲得被動免疫，可以預防仔豬紅痢。還能預防綿羊猝狙，犢牛腸毒血癥，從而能夠有效地控制C型產氣莢膜梭菌病的流行。
【專利說明】一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法(-)發明領域
[0001]本發明涉及一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。
(二)發明背景
[0002]魏氏梭菌又稱產氣莢膜梭菌，根據所產毒素的不同，可分為ABCDE五型。C型菌主要是綿羊猝狙的病原，初生仔豬易感，表現為血痢和高死亡率，也能引起羔羊、犢牛、綿羊的腸毒血癥和壞死性腸炎，該菌主要產生α、β兩種外毒素。自八十年代中期，全國約二十個省市首先在豬牛羊兔群中出現猝死癥，給畜牧業生產帶來了很大損失。近年來，全國各地反芻動物壞死性腸炎及腸毒血癥的發病率還有明顯上升趨勢，成為困擾我國畜牧業發展的一大難題，嚴重地影響了畜牧業的發展。
[0003]為了控制產氣莢膜梭菌病的流行，許多學者曾研制過產氣莢膜梭菌的滅活菌苗用于預防。王克領(1998)等對兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏桿菌病三聯苗進行研究；譚詩文等(2000)曾經進行了羔羊痢疾、大腸桿菌病、羊猝狙、羊腸毒血癥四聯油佐劑滅活苗的研制。文希喆等(1985)還研制了魏氏梭菌多聯干粉滅活苗。此外還有羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯滅活疫苗，家兔產氣莢膜梭菌病A型滅活疫苗，這些疫苗對該病的流行有一定的控制作用，但也存在一些不足，如家畜接種反應較重，多聯苗的注射劑量較大，而且有些疫苗的免疫效果不確實，質量需進一步改進。
[0004]C型菌的致病機理為外界因素導致腸道內產氣莢膜梭菌大量增殖，在腸道內產生大量外毒素粘附在腸粘膜上皮上，使得腸壁通透性增加，毒素進入血液循環，引起毒血癥。Bohenel指出:“魏氏梭菌致病是由于它們形成分泌的毒素和代謝產物，無毒素產生就不會出現臨床癥狀”。根據上 述致病機理，C型產氣莢膜梭菌疫苗的預防重點應當在對外毒素研究的基礎上，研制類毒素疫苗。
(三)
【發明內容】
[0005]為了解決上述問題，本發明提供了一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。
[0006]一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，包括如下步驟:
[0007]將C型產氣莢膜梭菌的菌種接種于血平板培養基上，37°C厭氧培養36h復蘇；取復蘇后的一個單菌落接種于硫乙醇酸鹽流體培養基FT，37°C厭氧培養12h增菌；將增菌培養物按照接種量5% (體積比)接種于產毒培養基，40°C厭氧振蕩培養5h ;培養液離心,取上清，蔡氏濾器過濾除菌，得到外毒素溶液；在外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，37°C，滅活8天，期間每隔5-6h振搖一次得到滅活好的類毒素溶液；將白油與span-80以體積比32:3混勻后，再加入白油與span-80混合液質量比2%的硬脂酸鋁，高壓滅菌得到油相；在滅活好的類毒素溶液中加入體積比2%的Tween-80混合得到水相；將油相與水相以體積比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混勻后，制成C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗；[0008]所述血平板培養基成分為:100毫升蒸餾水、I克葡萄糖、3.8克豆瓊脂粉和5毫升綿羊血；所述產毒培養基成分為:100毫升PBS緩沖液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物和1.2克L-精氨酸；所述PBS緩沖液的成分為:100毫升去離子水、0.8克氯化鈉、0.02克氯化鉀、0.358克十二水合磷酸氫二鈉和0.027克磷酸二氫鉀。
[0009]使用時，肌肉注射，母豬在分娩前一月和半月各注射一次，劑量為每次5-10毫升。
[0010]有益效果
[0011]本研究開發制備了效價高、免疫力強、治療效果好，無毒副作用的綿羊猝狙、仔豬紅痢、犢牛腸毒血癥的C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗，用于免疫妊娠后期的母豬，新生仔豬通過初乳獲得被動免疫，可以預防仔豬紅痢。還能預防綿羊猝狙，犢牛腸毒血癥，從而能夠有效地控制C型產氣莢膜梭菌病的流行。
(四)【具體實施方式】
[0012]實施例1仔豬紅 痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備
[0013]細菌增菌用接種環挑取三環C型產氣莢膜梭菌菌種(National Collection ofType Cultures英國微生物菌種保藏中心保藏,保藏號:NCTC3180)接種于一個血平板培養基(100毫升蒸餾水、I克葡萄糖和3.8克豆瓊脂粉滅菌后，加入5毫升綿羊血分裝到六個血平板上)上，37°C厭氧培養36h。取單個菌落接種于一個含7-8毫升硫乙醇酸鹽流體培養基(FT)(培養基成分通用)的試管內，37°C厭氧培養((88% N2,7% H2和5% CO2) ) 12h增菌。取5毫升液體培養物接種于100毫升產毒培養基(100毫升PBS緩沖液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物、1.2克L-精氨酸)中，所述PBS緩沖液的成分為:100毫升去離子水、0.8克氯化鈉、0.02克氯化鉀、0.358克十二水合磷酸氫二鈉、0.027克磷酸二氫鉀，40°C厭氧振蕩培養5h。
[0014]外毒素制取培養液4°C 10000r/min離心30min，取上清，用孔徑0.22 μ m的蔡氏濾
器過濾除菌，得到外毒素溶液。
[0015]毒素滅活在制取好的外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，然后置37°C，8天完全滅活，期間每隔5-6h振搖一次，得到滅活好的類毒素。
[0016]類毒素疫苗制備將白油與span-80以32:3的體積比混勻后，再加入白油與span-80混合液質量比2%的硬脂酸鋁，高壓滅菌，即為油相。在滅活好的類毒素溶液加入體積比2%的Tween-80混合，即為水相。油相與水相以體積比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混勻后，制成C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗。
[0017]疫苗的無菌檢驗參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》(2001年版)附錄301頁進行，無菌生長。
[0018]疫苗的安全檢驗用體重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗5毫升，觀察10日，均健活，注射部位沒有發生壞死。
[0019]疫苗效力檢驗用體重40kg以上的健康易感豬6只，其中4只豬每只肌肉注射C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗5毫升，2只不注射疫苗作為對照組；14日后，6只豬均注射10毫升本發明制備的C型產氣莢膜梭菌外毒素溶液，觀察3-5日，對照組2只豬全部死亡，免疫組豬4只均未死；繼續觀察7天，未出現綿羊猝狙、仔豬紅痢、犢牛腸毒血癥等病癥，說明該疫苗對豬的保護力達到了 100%。[0020]免疫劑量的確定選體重40kg以上的健康易感豬8只，平均分為四組，分別編號為A組、B組、C組、D組，每組分別注射C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗劑量為1ml、3ml、5ml、7ml，兩周后，8只豬均注射10毫升的C型產氣莢膜梭菌外毒素溶液，觀察3-5日，A組和B組豬均死亡，C組和D組均健康存活，因此免疫劑 量定為5毫升。
【權利要求】
1.一種仔豬紅痢C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 將C型產氣莢膜梭菌的菌種接種于血平板培養基上,37°C厭氧培養36h復蘇；取復蘇后的一個單菌落接種于硫乙醇酸鹽流體培養基FT，37°C厭氧培養12h增菌；將增菌培養物按照接種量5%體積比接種于產毒培養基，40°C厭氧振蕩培養5h;培養液離心，取上清，蔡氏濾器過濾除菌，得到外毒素溶液；在外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，37°C，滅活8天，期間每隔5-6h振搖一次得到滅活好的類毒素溶液；將白油與span-80以體積比32:3混勻后，再加入白油與span-80混合液質量比2%的硬脂酸鋁，高壓滅菌得到油相；在滅活好的類毒素溶液中加入體積比2%的Tween-80混合得到水相；將油相與水相以體積比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混勻后，制成C型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗； 所述血平板培養基成分為:100毫升蒸餾水、I克葡萄糖、3.8克豆瓊脂粉和5毫升綿羊血；所述產毒培養基成分為:100毫升PBS緩沖液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物和1.2克L-精氨酸；所述PBS緩沖液的成分為:100毫升去離子水、0.8克氯化鈉、0.02克氯化鉀、0.358克十二水合磷 酸氫二鈉和0.027克磷酸二氫鉀。
【文檔編號】A61K39/08GK103432578SQ201310416011
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】柴同杰, 樊金, 王海榮 申請人:山東農業大學