一種促進細胞再生的組合物及其制備方法和用途

一種促進細胞再生的組合物及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進細胞再生的組合物及其制備方法和用途。本發(fā)明的一種促進細胞再生的組合物是通過以下方法制備得到的：首先于體外培養(yǎng)人體骨髓間葉干細胞，在無血清的DMEM末代培養(yǎng)液中添加人類干細胞生長因子、白血球生長因子及蜆萃取物，使得人體骨髓間葉干細胞可分泌多種人類生長因子以形成人類生長因子組合物，最后再以油包水-水包油（Water–in-Oil-in-Water，W/O/W）的微脂體包埋技術(shù)包埋，即得。經(jīng)包埋而成的組合物可經(jīng)由表皮涂抹方式，促進表皮組織傷口愈合再生、減少疤痕產(chǎn)生，并可活化毛囊黑色素細胞及刺激毛囊細胞再生。此外亦可經(jīng)由口服方式，促進腦部受損黑質(zhì)細胞再生修護與海馬回區(qū)神經(jīng)細胞新生，以及刺激骨髓造血干細胞增生。
【專利說明】一種促進細胞再生的組合物及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種促進細胞再生的組合物及其制備方法和用途。具體而言，本發(fā)明 涉及一種含有人類生長因子及利用微脂體包埋技術(shù)包埋的促進細胞再生的組合物及其制 備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚不但具有調(diào)節(jié)人體的體溫、水分等功能，也是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線，一 旦失去表皮的保護就極容易遭受外來病原感染。而經(jīng)歷燒傷、潰瘍、發(fā)炎、放射線治療、手術(shù) 以及糖尿病的患者，長時間處于皮膚缺損及異常的情形下，容易造成感染而對身體產(chǎn)生莫 大的傷害。而人體內(nèi)部組織器官因老化、疾病所造成的凋亡、功能衰竭等，尤其是腦部退化 性疾病或急性損傷造成的腦部傷害，影響人類的健康甚巨，因此組織細胞傷口愈合及再生 修護機制是一項重要的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
[0003] 目前用于治療傷口及促進愈合的藥物多為殺菌劑、抗生素、皮質(zhì)類固醇激素等， 對于傷口愈合皆各有其缺點，且傷口愈合率差。因而發(fā)展出人工皮膚或其它皮膚替代物、 細胞治療等方法。相關(guān)研究指出，在皮膚的傷口愈合過程中，有多種生長因子扮演了重要 的角色。皮膚受傷后，血小板會釋放出其中所含的多種生長因子及細胞激素，包括表皮生 長因子（epidermal growth factor，EGF)、喊性纖維母細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍化生長因子（platelet-derived growth factor， FOGF)、人類胰島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 a (transforming growth factor-α , TGF-α )、轉(zhuǎn)化生長因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )、介白 素（interleukin，IL)、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF)、激 活素（activin)、腫瘤壞死因子a (tumour necrosis factor, TNF-α)等。這些生長因子 可吸引嗜中性白血球（neutrophil)和巨噬細胞（macrophage)朝向傷口處聚集，以清除受 傷組織、細胞并吞噬感染物，亦可活化附近的纖維母細胞及角質(zhì)細胞以及誘導(dǎo)周圍血管進 行血管新生作用。
[0004] 另一方面，傷口部位的纖維母細胞會在某些生長因子，特別是I3DGF及TGF-β的影 響下，轉(zhuǎn)型為肌纖維母細胞。這些肌纖維母細胞會大量表達α肌動蛋白（α-actin)以利收 縮傷口，并合成膠原蛋白纖維。這些沉積于傷口處的膠原蛋白纖維的排列方式受到肌纖維 母細胞收縮的影響而與原本正常組織的膠原蛋白纖維列方式不同，因而形成疤痕組織。在 受傷后第四星期開始一直到約六個月間，疤痕組織中的膠原蛋白會重新排列，而使得疤痕 組織的外形及機能接近原先的正常組織。近來有研究指出，TGF-β于傷口愈合的調(diào)節(jié)上， 不僅對巨噬細胞與纖維細胞有趨化性，并可刺激第I型及第II型膠原蛋白的mRNA的轉(zhuǎn)錄 作用，以促進傷口中膠原蛋白的聚積，以提高傷口的愈合率。故TGF-β經(jīng)證實可產(chǎn)生無疤 的上皮再生作用，并加速愈合因放射線照射所形成的皮膚傷口。研究指出，在哺乳動物的胚 胎時期可分泌大量TGF-β，然而，成體哺乳動物的表皮于受傷時，所分泌的TGF-β的含量 卻非常少，是以出生后的傷口，易有肌纖維細胞收縮而造成的疤痕。
[0005] 由于生長因子對于傷口的再生修復(fù)機制扮演了重要的角色，各種如G-CSF、EGF、 bFGF、IGF-I、PDGF-BB及VEGF生長因子皆已廣泛運用于醫(yī)藥及美容保養(yǎng)產(chǎn)業(yè)。而針對G-CSF 而言，早已在醫(yī)療上治療骨髓移植用途多年，而目前在臨床上也有注射到栓塞型中風(fēng)病人 身上，可以幫助腦部瘀血區(qū)域的復(fù)原。此病人若接受一般復(fù)健治療半年到一年，能恢復(fù)部分 肌力，但不一定能站得起來，但是在中風(fēng)3天內(nèi)連續(xù)5天注射G-CSF后，3個月內(nèi)可站可走， 甚至有人能跑能跳，恢復(fù)相當(dāng)迅速。因為G-CSF將骨髓中的干細胞逼到周邊血管，中風(fēng)處會 有蛋白質(zhì)表達，吸引干細胞到患處修補，分化成腦神經(jīng)、血管等細胞，因此有助中風(fēng)患者迅 速恢復(fù)。此外，G-CSF可保護神經(jīng)，使腦神經(jīng)不致因中風(fēng)缺血而壞死，并有抗發(fā)炎作用，可抑 制中風(fēng)處的發(fā)炎組織及細胞。但G-CSF注射治療僅對栓塞型腦中風(fēng)有效，出血型中風(fēng)仍以 血塊清除手術(shù)為主。而目前的科學(xué)報告中證實，SCF與G-CSF組合應(yīng)用于阿茲海默癥與栓 塞型腦中風(fēng)動物實驗，效果遠較單獨使用G-CSF為更好。因此多種生長因子復(fù)方做為不同 用途的醫(yī)藥應(yīng)用，將會具有其市場價值。
[0006] 然而，目前在利用基因工程以大量制備上述生長因子時，需將表達上述人類生長 因子的基因個別插入載體內(nèi)以大量繁殖，并進一步純化其表達的人類生長因子。雖然此種 方法可降低成本，但其缺點在于純化后的蛋白質(zhì)的純度不一，且可能含有內(nèi)毒素或其他不 良的蛋白質(zhì)，而影響療效或并發(fā)過敏反應(yīng)；此外，一個質(zhì)體要同時插入三種以上的生長因子 蛋白質(zhì)基因，且皆有表達活性，難度非常高，若欲同時操作多個選殖質(zhì)體既費時又費工；再 者，以原核生物或真菌類來表達人類生長因子蛋白質(zhì)時，大部分所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的活性會 降低。
[0007] 另一方面，干細胞治療則是利用人類成體干細胞，例如位于骨髓、表皮、腸道等部 位的干細胞來治療各種疾病。由人類骨髓分離的間葉干細胞（human mesenchymal stem cell，hMSC)是一種成體干細胞，其具有多種分化潛能，在不同的培養(yǎng)環(huán)境下可分化成骨骼、 軟骨、肌肉、皮膚等組織，又有易于分離、培養(yǎng)與體外增生速度快的特性，已有多項研究證實 其可強化組織細胞的再生愈合機制。然而，以干細胞注射或手術(shù)移植入人體，需要長期的臨 床試驗以評估異體干細胞移植是否產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。再者，干細胞治療耗費的醫(yī)療資源 以及金錢亦高于一般療法。
[0008] 因此，需要提出一種方法，可以結(jié)合基因工程以及干細胞療法的優(yōu)點并改進其缺 點。亦即，需要一種方法可同時提供三種以上由人類細胞表達的生長因子蛋白質(zhì)，同時可通 過一般外用或口服的途徑施用該生長因子，以促進組織細胞的再生修護。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 鑒于上述問題，本發(fā)明提出了一種含有人類生長因子，并利用微脂體包埋技術(shù)包 埋的促進細胞再生的組合物及其制備方法。
[0010] 因此，本發(fā)明一方面提供一種用于制備人類生長因子的組合物，其包含 人類干細胞生長因子（stem cell factor, SCF)、白血球生長因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)以及蜆萃取物，其中，優(yōu)選的，該人類干細胞生長因 子、白血球生長因子及蜆萃取物的濃度皆為5?100ng/ml。 toon] 所述的"蜆萃取物"又叫"蜆精粉"，可購買自市場，同時也可通過以下方法制備得 至IJ :將吐沙后的生蜆放入沸水中煮10-60分鐘，隨后將蜆肉經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉末進行 萃取。將蜆凍干粉末溶于其約10倍體積的乙醇中攪拌萃取，之后離心取出上清液，過濾后 減壓濃縮得到一干燥物，最后將該干燥物溶于70%乙醇溶液即得。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于制備人類生長因子的方法。首先，在初代培養(yǎng)液 中進行人體骨髓間葉干細胞的初代培養(yǎng)。接著，去除初代培養(yǎng)液中的懸浮細胞并選擇貼 壁細胞，并以繼代培養(yǎng)液進行繼代培養(yǎng)。其后，選擇貼壁細胞并以前述組合物制備的末代 培養(yǎng)液進行末代培養(yǎng)，上述末代培養(yǎng)液是一種無血清DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液，并且添加微生物基因工程產(chǎn)制的人類干細胞生長因子（SCF)、白血球生長 因子（G-CSF)以及蜆萃取物，使得人體骨髓間葉干細胞可表達多種人類生長因子組合物于 第四日的末代培養(yǎng)分泌液中，最后再以油包水-水包油（Water - in-〇il-in-Water，W/0/W) 的微脂體包埋技術(shù)包埋。
[0013] 特殊配方的末代培養(yǎng)液可使得貼壁骨髓干細胞能夠分泌多種人類生長因子至末 代培養(yǎng)分泌液中，以形成含有多種人類生長因子的溶液。亦即，上述多種人類生長因子溶液 至少包含人類骨髓干細胞所分泌的多種人類生長因子的組合物，即為本發(fā)明所稱的"人類 生長因子組合物"。上述的組合物包含至少三種以上選自下列群組的生長因子：SCF、EGF、 VEGF-D、VEGF、bFGF、中性粒細胞活化肽78(ENA-78)、生長調(diào)節(jié)致癌基因（Growth-regulated oncogene，GR0)、干擾素 γ (丨11丨61€61'〇11-丫，]^^-丫）、16?-1、血管生成素（41^;[08611；[11)、單 核球趨化性蛋白質(zhì) I (MCP-1)、FOGF-BB、胎盤生長因子（placenta growth factor, PIGF)、 TGF-βΙ、金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1; TIMP-2)、瘦體素（leptin)、血小板生長因子（thrombopoietin，Tpo)、趨化因子（RANTES)、 IL-6、IL-8等21種細胞激素。
[0014] 利用本發(fā)明實施例的制備人類生長因子的方法，可輕易得到一種人類生長因子組 合物，其中所含的人類生長因子的種類、活性、安全性皆高于利用基因工程所產(chǎn)生者。且根 據(jù)本發(fā)明實施例的方法所得到的生長因子組合物至少包含多種和細胞再生相關(guān)的生長因 子，可有效提升細胞再生的能力。
[0015] 此外，根據(jù)本發(fā)明實施例的特殊配方的末代培養(yǎng)液，不但可在人類生長因子組合 物制備過程中提供額外的養(yǎng)分給人體骨髓間葉干細胞，亦有助于提升本發(fā)明實施例的用以 促進細胞再生的組合物中所含的人類生長因子組合物促進細胞再生的能力。
[0016] 又一方面，本發(fā)明提供一種用以促進細胞再生的組合物，上述組合物至少包含本 發(fā)明的人類生長因子組合物、營養(yǎng)成分、乳化劑溶液、油相液體，以及增加安定性與耐胃酸 的膠體。上述營養(yǎng)成分包含根據(jù)本發(fā)明實施例制備人類生長因子組合物時，所用的營養(yǎng)液 的一部份。上述乳化劑溶液以及油相液體可將人類骨髓干細胞制造的復(fù)合組合物以油包 水-水包油（Water - in-〇il-in-Water，W/0/W)的方式包埋成一種安定性高的微脂體包埋 物。不僅以表皮涂抹方式，利用磷脂層膜易滲透吸收的特性，將抗皺的賦活因子運送至肌膚 底層釋放，從肌膚表皮層穩(wěn)固干細胞環(huán)境，達到防護干細胞增植的功效，有效抗皺與避免老 化，促進細胞再生；亦可以口服方式，通過消化道到血液循環(huán)中，仍然具有修護表皮外傷的 生物活性。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該促進細胞再生的組合物所包埋成的微脂體包埋物可 應(yīng)用于實驗動物的人造傷口。涂抹于人造傷口上，可觀察到該組合物可促進傷口愈合，減緩 傷口發(fā)炎及感染的機率，并減少疤痕的產(chǎn)生。此外，該組合物涂抹于受試者的皮膚上，可觀 察到皺紋明顯減少，青春痘數(shù)量變少，并減緩痘疤的產(chǎn)生，因此可知該組合物可運用于制備 促進傷口愈合，減緩傷口發(fā)炎及感染的醫(yī)藥組合物或輔助物。
[0018] 本發(fā)明的一具體實施例為灰發(fā)動物的應(yīng)用，使用本發(fā)明的灰發(fā)動物模式，仿真人 類因老化而造成毛囊黑色素細胞死亡，所造成的白發(fā)征狀。涂抹本發(fā)明的促進細胞再生的 組合物，可明顯觀察到實驗動物的白發(fā)征狀明顯改善，說明此組合物可應(yīng)用于制備活化毛 囊黑色素細胞，改善因衰老而造成的白發(fā)的醫(yī)藥組合物或輔助物。
[0019] 本發(fā)明的一具體實施例為禿發(fā)動物的應(yīng)用，使用本發(fā)明的禿發(fā)動物模式，仿真人 類的禿發(fā)模式。涂抹本發(fā)明的促進細胞再生的組合物，可明顯觀察到實驗動物的禿發(fā)征 狀明顯改善，而應(yīng)用于受試者的頭皮上，可明顯觀察到受試者的發(fā)量明顯增加，毛囊密度提 高，發(fā)色變深等現(xiàn)象，說明本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于制備刺激毛囊生長，活化毛囊黑色素細 胞的醫(yī)藥組合物或輔助物。
[0020] 本發(fā)明的一具體實施例為延緩腦部神經(jīng)退化的應(yīng)用，帕金森是目前老齡常見的 神經(jīng)退化性疾病之一，因此本發(fā)明以帕金森動物試驗為例，通過神經(jīng)毒物1-甲基-4-酚 基 -1，2, 3, 6-四氫噪呤（l-methyl-4-phenyl-l，2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP)造成小 鼠產(chǎn)生帕金森氏癥的動物征狀，再給予小鼠口服本發(fā)明的促進細胞再生的組合物。由結(jié)果 顯示，帕金森氏癥模式小鼠口服本發(fā)明的組合物后，可明顯減緩大腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)細 胞的退化，增加腦內(nèi)多巴胺的分泌，并促進大腦海馬回神經(jīng)細胞的增生，說明本發(fā)明的組合 物可應(yīng)用于制備延緩腦部退化性神經(jīng)疾病的醫(yī)藥組合物或輔助物。
[0021] 本發(fā)明的一具體實施例為促進血液造血干細胞的應(yīng)用，給予受試者口服本發(fā)明的 促進細胞再生的組合物后，可明顯增加血液中造血干細胞數(shù)量，說明本發(fā)明的組合物可應(yīng) 用于制備促進血液造血干細胞的醫(yī)藥組合物或輔助物。
[0022] 本發(fā)明的該等及其他方面，可通過以下的較佳具體實施例的描述以及圖式，得以 更為明晰；即便其中可能會有變化或修飾，但皆不背離本發(fā)明所揭露的新穎觀念的精神及 范疇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 出于闡釋本發(fā)明的目的，在圖式中顯示當(dāng)前較佳的實施例。然而，應(yīng)理解的是，本 發(fā)明不限于圖式中的較佳實施例。
[0024] 圖1顯示人類生長因子抗體微陣圖，其中（A)為人類生長因子抗體微陣芯片所列 舉的人類生長因子種類；(B)為在含有干細胞生長因子（SCF)及白血球生長因子（G-CSF)的 末代培養(yǎng)液中所分泌的人類生長因子；（C)為在含有干細胞生長因子（SCF)、白血球生長因 子（G-CSF)及蜆萃取物的末代培養(yǎng)液中所分泌的人類生長因子。
[0025] 圖2顯示在ELISA試驗中利用標(biāo)準(zhǔn)品求得本發(fā)明的生長因子的濃度，其中（A)顯 示干細胞生長因子的濃度及（B)顯示血管內(nèi)皮生長因子的濃度。
[0026] 圖3提供本發(fā)明制備的微脂體的結(jié)構(gòu)示意圖，其中（A)顯示光學(xué)顯微鏡下的微脂 體結(jié)構(gòu)；(B)顯示熒光顯微鏡下的微脂體結(jié)構(gòu)；及（C)顯示微脂體制備時與油相及水相液體 的相關(guān)不意圖。
[0027] 圖4顯示口服包埋白血球生長因子（G-SCF)的微脂體對增加血液中白血球數(shù)目的 效果。
[0028] 圖5顯示小鼠皮膚傷口愈合的情形，其中使用本發(fā)明所提供的促進細胞再生的組 合物時，㈧為第〇日的傷口影像，⑶為第3日的傷口影像；未使用本發(fā)明所提供的促進 細胞再生的組合物時，（C)為第0日的傷口影像，（D)為第3日的傷口影像。
[0029] 圖6顯示小鼠傷口愈合率的比較圖。
[0030] 圖7顯示小鼠毛囊黑色素細胞活化的情形，其中（A)、（C)、（E)分別為陽性對照組 在第9、14、21天的情形，及出）、（0)、的分別為試驗組在第9、14、21天的情形。
[0031] 圖8顯示小鼠毛囊細胞增生的情形，其中（A)、（C)、（E)、（G)分別為陽性對照組在 第0、7、14、21天的情形，及⑶、（D)、（F)、（H)分別為試驗組在第0、7、14、21天的情形。
[0032] 圖9顯示皮膚傷口愈合與淡化細紋的情形，其中（A)、（C)、（E)、（G)為涂抹本發(fā)明 所提供的促進細胞再生的組合物前的皮膚狀況，及（B)、（D)、（F)、（H)為涂抹30日后的皮 膚狀況。
[0033] 圖10顯示人體頭部毛囊細胞增生及活化黑色素細胞的情形，其中（A)、（C)、（E)為 涂抹本發(fā)明所提供的促進細胞再生的組合物前的頭發(fā)狀況，及（B)、（D)、（F)為涂抹后的頭 發(fā)狀況。
[0034] 圖11顯示小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)細胞退化的情形，其中㈧為正常小鼠；(B)為 施以MPTP注射的小鼠；及（C)為施以MPTP注射且給予本發(fā)明所提供的促進細胞再生的組 合物治療的小鼠。
[0035] 圖12顯示小鼠海馬回區(qū)新生神經(jīng)細胞增生的情形，其中㈧為正常小鼠；(B)為 施以MPTP注射的小鼠；及（C)為施以MPTP注射且給予本發(fā)明所提供的促進細胞再生的組 合物治療的小鼠。
[0036] 圖13顯示慢性帕金森小鼠腦部多巴胺濃度的比較圖。
[0037] 圖14顯示急性帕金森小鼠腦部多巴胺濃度的比較圖。
[0038] 圖15顯示利用流式細胞儀分析服用本發(fā)明所提供的促進細胞再生的組合物，影 響人類血液中造血干細胞增生的情形，其中（A)、（C)、（E)服用前的情形，及（B)、（D)、（F) 為服用后的情形。

【具體實施方式】
[0039] 在下列具體實施例中，本發(fā)明將被更特定地描述。值得注意的是，下列所述本發(fā)明 的具體實施例僅是用于說明，并非為詳列或限縮本發(fā)明范圍至所揭露的特定形式。
[0040] 實施例（一）
[0041] 制備人類生長因子的方法
[0042] 該方法包含下列步驟：
[0043] (a)在初代培養(yǎng)液中進行人體骨髓間葉干細胞的初代培養(yǎng)；
[0044] (b)去除初代培養(yǎng)液中的懸浮細胞并選擇貼壁細胞，并以繼代培養(yǎng)液進行繼代培 養(yǎng)；以及
[0045] (C)選擇繼代培養(yǎng)液中的貼壁細胞，并以末代培養(yǎng)液進行末代培養(yǎng)。上述末代培養(yǎng) 液為無血清培養(yǎng)液且含有人類生長因子和/或蜆萃取物，以使得貼壁細胞能夠分泌多種生 長因子至末代培養(yǎng)液中，以形成人類生長因子溶液。
[0046] 在上述步驟中，是將健康人體骨髓間葉干細胞(購自The National Disease Research Interchange，NDRI，USA)以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液（Dulbecco，s modified eagle medium，購自 Gibico，Cat.No. 12100-061)作為初代培養(yǎng)液，進行初代培 養(yǎng)3日。接著去除初代培養(yǎng)液中的懸浮細胞并選擇貼壁細胞，再以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液作為繼代培養(yǎng)液，進行繼代培養(yǎng)3日。繼代培養(yǎng)之后，以末代培養(yǎng)液進行末代培養(yǎng)3 日，上述末代培養(yǎng)液為一種無血清培養(yǎng)液，且含有約5?100ng/ml SCF及G-CSF，和/或蜆 萃取物5?100ng/ml。
[0047] 蜆萃取物的制備方式為：將吐沙后的生蜆放入沸水中煮10-60分鐘，隨后將蜆肉 經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉末進行萃取。將蜆凍干粉末溶于其約10倍體積的乙醇中攪拌萃取， 之后離心取出上清液，過濾后減壓濃縮得到一干燥物，最后將該干燥物溶于70%乙醇溶液 即得。
[0048] 在末代培養(yǎng)步驟中，末代培養(yǎng)液中的貼壁細胞可分泌復(fù)數(shù)種人類生長因子至末代 培養(yǎng)液中，以形成一種人類生長因子組合物。該人類生長因子組合物至少包含三種下列生 長因子：SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GR0、IFN-γ、IGF-UAngiogenin (血管生成 素）、MCP-l、PDGF-BB、PIGF、TGF-Pl、HMP-l、HMP-2、kptin、Tpo、RANTES、IL-6#&IL-8。
[0049] 繼代培養(yǎng)步驟可視需求重復(fù)至多20次。且可在繼代培養(yǎng)步驟后將經(jīng)培養(yǎng)的人體 骨髓間葉干細胞冷凍保存，且此一冷凍保存的人體骨髓間葉干細胞經(jīng)解凍后可再度進行繼 代培養(yǎng)，但解凍后的人體骨髓間葉干細胞的繼代培養(yǎng)次數(shù)最多只可重復(fù)3次。
[0050] 在本發(fā)明的一具體實施例中，可于末代培養(yǎng)液中加入營養(yǎng)液，上述營養(yǎng)液包含至 少一種氨基酸和/或至少一種維生素。上述的氨基酸可為丙氨酸、精氨酸、天門冬酰氨酸、 天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、麩氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、白氨酸、離氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸，且所選的每種氨基酸的濃 度約為5?100mg/L。上述的維生素可為維生素 A、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B5、維生素 B6、維生素 B12、維生素 C、維生素 D2、維生素 E、維生素 H、維生素 K3、氯化膽堿、葉 酸、或肌醇，且所選的每種維生素的濃度約為0. 1?l〇mg/L。
[0051] 在本發(fā)明一實施例中，將利用本發(fā)明實施例制備的人類生長因子組合物進行透 析，以進一步純化該人類生長因子組合物。根據(jù)本發(fā)明的一具體實施例，利用一 3. 5KD的透 析膜（購自 Pierce，SnakeSkinTMPleated Dialysis Tubing，3,500MWC0)來進行上述人類 生長因子組合物的透析，透析可持續(xù)進行約3?5日。通過透析步驟，可實質(zhì)上移除人類生 長因子溶液中分子量小于3, 500道爾頓（Dalton，D)的物質(zhì)，因而達到純化人類生長因子溶 液的目的。
[0052] 由于根據(jù)本發(fā)明實施例欲制備的人類生長因子組合物中所含的人類生長因子的 分子量皆遠大于3. 5KD，例如EGF的分子量約為6KD而TGF- β 3的分子量更高達250KD，故 根據(jù)本發(fā)明實施例的方法所產(chǎn)生的人類生長因子大部分會留存于透析膜之中。最后，收集 透析膜中留存的溶液，其至少包含三種人類生長因子。此種利用本發(fā)明實施例的方法所制 備的人類生長因子組成的特征在于包含至少三種可偵測的生長因子(偵測方法將于下文 詳述），上述生長因子可以是 SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GR0、IFN-γ、IGF-1、 Angiogenin、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、TGF-β 1、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、1 印tin、Tpo、RANTES、IL-6 以及IL-8。
[0053] 實施例（二）
[0054] 人類生長因子組合物的定性分析
[0055] 以人類細胞介素抗體微陣芯片（RayBio TMHuman Cytokine Antibody Arrays) 檢測該透析液中的生長因子組成，檢測結(jié)果如圖I的人類生長因子抗體微陣圖所示。由圖 I(A)可以發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實施例制備的人類生長因子組成所含的人類生長因子種類及 其偵測極限（limit of detection, LoD)如下：EGF (偵測極限lpg/ml)、bFGF (偵測極限 10000pg/ml)、IGF-I (偵測極限 10pg/ml)、PDGF (偵測極限 1000pg/ml)、VEGF (偵測極限 100pg/ml)、TGF-β 1 (偵測極限 100pg/ml)、Angiogenin (偵測極限 10pg/ml)、IFN-γ (偵 測極限 l〇〇pg/ml)、RANTES (偵測極限 2000pg/ml)、Thrombopoietin (偵測極限 100pg/ml)、 --ΜΡ (偵測極限 lpg/ml)、GRO (偵測極限 100pg/ml)、IL-6 (偵測極限 lpg/ml)、以及 IL-8 (偵測極限lpg/ml)。
[0056] 本說明書中，"偵測極限"一詞是指利用本發(fā)明實施例的方法進行人類生長因子定 性分析時，所采用的檢測方法的最低偵測濃度。換句話說，待測樣本中所含的特定人類生長 因子的濃度，必須至少等同于或大于檢測方法所用的偵測極限，才可能被檢測出來，在此種 情形下，亦可將該特定人類生長因子稱為"可偵測的"人類生長因子。而額外添加蜆萃取物 于末代培養(yǎng)液中，可觀察到各種生長因子有顯著的增加（圖1(B)、圖I(C)及表一)。
[0057] 表一生長因子于微陣芯片中濃度的相對倍數(shù)
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備人類生長因子的組合物，其包含人類干細胞生長因子、白血球生長因 子及蜆萃取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該人類生長因子具有可偵測的濃度。
3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中該人類干細胞生長因子、白血球生長因子及蜆萃 取物的濃度皆為5?100ng/ml。
4. 一種制備人類生長因子的方法，該方法包含： 進行初代培養(yǎng)，其是在初代培養(yǎng)液中培養(yǎng)人體骨髓間葉干細胞； 取出該初代培養(yǎng)液中的貼壁細胞，并以繼代培養(yǎng)液以進行繼代培養(yǎng)；以及 取出該繼代培養(yǎng)液中的貼壁細胞，并以末代培養(yǎng)液進行末代培養(yǎng)，讓該末代培養(yǎng)液中 的貼壁細胞分泌多種生長因子至該末代培養(yǎng)液中以形成人類生長因子溶液，其中該末代培 養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液且包含如權(quán)利要求1至3項中任一所述的組合物。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中該初代培養(yǎng)液以及該繼代培養(yǎng)液為含胎牛血清的 DMHM培養(yǎng)液。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中該初代培養(yǎng)的步驟進行3日。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中該繼代培養(yǎng)的步驟進行3日。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，至少更包含重復(fù)進行該繼代培養(yǎng)的步驟，其中該重復(fù)次 數(shù)最多20次。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中該末代培養(yǎng)的步驟進行3日。
10. 如權(quán)利要求4所述的方法，更包含取出該人類生長因子溶液進行透析，以純化該人 類生長因子溶液。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中利用3500道爾頓的透析膜進行透析，且該透析步 驟進行3-5日。
12. -種人類生長因子組合物，其是利用如權(quán)利要求4至11項中任一項所述的方法 制備，其特征在于包含至少三種可偵測的生長因子，其中該生長因子是選自由SCF、EGF、 VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GRO、IFN- y、IGF-1、Angiogenin、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、 丁6卩-0 1、！1]\^-1、11]\^-2、1印衍11、了？〇、狀階^5、11-6以及比-8所組成的群組。
13. -種用以促進細胞再生的組合物，其包含：如權(quán)利要求12所述的人類生長因子組 合物；一營養(yǎng)成分，其包含至少一氨基酸和/或至少一維生素，其中該氨基酸選自由丙氨 酸、精氨酸、天門冬酰氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、麩氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨 酸、白氨酸、離氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸及纈氨酸 所組成的群組，該維生素選自由維生素 A、維生素 B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B5、維生 素 B6、維生素 B12、維生素 C、維生素 D2、維生素 E、維生素 H、維生素 K3、氯化膽堿、葉酸及肌 醇所組成的群組；一乳化劑溶液；以及一油相液體，其中該乳化劑溶液及該油相液體將該 人類生長因子組合物及該營養(yǎng)成分以油包水、水包油的方式包埋成一微脂體包埋物，其中 該微脂體包埋物是與一水溶性膠體混合，以增加該微脂體包埋物的安定性。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其是用于通過涂抹方式促進皮膚傷口愈合。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其是用于通過涂抹方式促進毛囊細胞生長。
16. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其是用于通過涂抹方式活化黑色素細胞。
17. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其是用于通過口服方式延緩腦部退化性神經(jīng)疾病。
18. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其是用于通過口服方式刺激造血干細胞。
19. 權(quán)利要求13-18任一項所述的組合物在制備治療禿頭藥物中的用途。
20. 如權(quán)利要求13-18任一項所述的組合物在制備治療灰發(fā)藥物中的用途。
【文檔編號】A61P17/14GK104436168SQ201310415430
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】林佳靜 申請人:林佳靜