一種魔芋多肽提取物、制備方法及其用途
【專利摘要】本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及一種從魔芋飛粉中提取魔芋多肽提取物的方法，及其由此方法獲得的魔芋多肽提取物和該魔芋多肽提取物的用途。為了提高魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量，本發明優化提取工藝，采用復合酶酶解魔芋飛粉蛋白提取液，最終獲得的魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量高達85～97%，并且魔芋多肽的分子量在350～3500Da，另外本發明還提供了魔芋多肽提取物在制備治療糖尿病及糖尿病并發癥的用途，以及含有魔芋多肽提取物的降糖藥物組合物，總之，本發明的魔芋多肽提取物及其藥物組合物具有很好的醫藥前景。
【專利說明】—種魔芋多肽提取物、制備方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及一種從魔芋飛粉中提取魔芋多肽提取物的方法，及其由此方法獲得的魔芋多肽提取物和該魔芋多肽提取物的用途。
【背景技術】
[0002]糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組由環境和遺傳因素共同作用引起的綜合征，其基本病理特點為胰島素分泌絕對或相對不足，或外周組織對胰島素不敏感，引起以糖代謝紊亂為主，包括脂肪、蛋白質代謝紊亂的一種全身性疾病。糖尿病控制與并發癥的臨床試驗(DCCT)、英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)等多項循證醫學研究已使人們對強化血糖控制的意義達成共識，血糖達標不僅可以預防或延緩糖尿病慢性并發癥的發生，提高患者的生活質量，而且會大大降低糖尿病相關的醫療費用。然而現實中糖尿病患者的血糖達標率較低。注射胰島素是治療糖尿病的方法之一，但是臨床治療中發現，胰島素注射本身也存在如下問題:(I)只能降 低注射期間的血糖，不能完全按血糖變化曲線控制血糖；(2)容易產生低血糖；(3)胰島素的吸收穩定性差，吸收差異達52%; (4)不能有效控制并發癥。口服降糖藥治療糖尿病是一種長期的治療和維持過程，但是單純依靠口服降糖已經無法達到強化治療的目標，主要由于長期口服降糖藥物產生的耐藥性和副反應造成的。因此，尋求更為有效的降糖藥物是迫切的。
[0003]糖化血紅蛋白是血液葡萄糖等己糖分子通過非酶作用，經細胞膜與紅細胞內血紅蛋白P鏈纈氨酸結合形成的產物，其中糖化血紅蛋白(ffiAlc)約占70%，其高低與血糖濃度和持續時間成正比，廣泛用于糖尿病控制程度的判斷和估計血管合并癥的危險。近年來，由于HbAlc檢測方法的改進及標準化的推行，高壓液相層析法由于其穩定性好而在臨床檢測中逐漸得到應用，美同臨床化學協會糖化血紅蛋白標準化分會和IFCC HbAlc標準化工作組建議糖化血紅蛋白其作為檢測糖化血紅蛋白的“金標準”。
[0004]魔芋飛粉是在魔芋精粉加工過程中產生的重量輕、顆粒小的粉末，占魔芋精粉的30%?40%，年產量約為1500?2000噸，多以低價飼料或作為干燥劑出售，利用價值低。目前研究發現，魔芋飛粉含粗蛋白質22.98 %，粗纖維3.23 %，是一個含高蛋白、低纖維重要資源，也是生產活性多肽的良好原料。
[0005]目前，采用魔芋飛粉提取魔芋多肽的方法有酸水解法、堿水解法以及簡單的一步酶解方法。但在堿水解過程中，多數氨基酸受到不同程度的破壞，并且產生消旋現象，所以在生產中基本不采用此法。酸水解一般是用鹽酸在沸騰的條件下水解，然后冷卻水解物。其優點是水解效率高，不引起氨基酸的消旋作用，得到的是L-氨基酸，但是部分氨基酸會完全被破壞，且由于鹽酸腐蝕性強，要求水解設備必須有很強的抗腐蝕性能，所以酸水解法在生產中的應用受到了很大的限制。酶水解所需的條件則較溫和，不產生消旋作用，也不破壞氨基酸，且水解時間短，產物顏色淺，容易控制水解的程度。但目前采用酶解制備魔芋蛋白多肽過程中較多采用單一酶系，且存在選用的水解酶不合理，造成魔芋蛋白水解不徹底，生產周期嚴重延長的現象。[0006]徐懷德等在《酶解魔芋飛粉蛋白制備ACE抑制肽》(食品科學，2010年第31卷第I期第157?160頁)一文公開了一種從魔芋飛粉提取制備魔芋多肽粉及其作為ACE抑制劑的技術方案，酶解過程為一步酶解過程，且選用堿性蛋白酶，大部分多肽的分子量在2500道爾頓以下，均為20個以下氨基酸組成的多肽鏈。經過檢測，該制備獲得的魔芋多肽粉中多肽的含量較低，僅達到52.67%。
[0007]趙姍姍等在《酶解魔芋飛粉制備高F值多肽最佳工藝條件的研究》(生物技術，2006年，第16卷第3期第67?69頁)一文中公開了一種從酶解魔芋飛粉制備高F值寡肽的方法，該方法中以魔芋飛粉為原料，采用Tris-HCl浸提法提取蛋白質，然后經過第一步酶解和第二步酶解，將芳香族氨基酸水解下來，最后用凝膠層析進行分離，即得到高F值寡肽制品，且第一步酶解用酶為堿性蛋白酶，第二次酶解用酶為鏈酶蛋白酶。由此可見，該工藝最后是采用凝膠層析進行分離獲得高F值寡肽制品。
[0008]劉紅等在《魔芋葡甘聚糖對四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖的防治作用》(中國藥理學通報，2002年，第18卷第I期第54?56頁)一文公開了魔芋葡甘聚糖具有治療糖尿病的活性。目前沒有魔芋飛粉可以治療糖尿病的報道，也沒有關于魔芋多肽提取物具有治療糖尿病功能的相關報道。
【發明內容】
[0009]本發明的第一個目的在于為了提高魔芋多肽提取物中魔芋活性多肽的含量，對從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物的方法進行優化，為此，本發明提供了一種從魔芋飛粉中提取魔芋多肽提取物 的方法，它包含如下步驟:
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節含有魔芋飛粉的水溶液的pH值至8.5?9.5，浸提時間為20?lOOmin，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.0?8.0、溫度至50°C?60°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為2.5?4.5小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶至少選自堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的兩種，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50?200。
[0010](3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至7.0?9.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為2.0?4.0小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶至少選自堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一種，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:100?400。
[0011](4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為40°C?50°C，pH為7.0?9.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0012]經過檢測，上述方法獲得的魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量在85%?97%之間，魔芋多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0013]為了進一步提高魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量，本發明還對上述制備方法各個步驟工藝進行了優化。
[0014]首先，考慮到含有魔芋飛粉的水溶液中魔芋飛粉的濃度和溶液的pH對于魔芋飛粉蛋白的提取率具有重要影響，因此，本發明分別對含有魔芋飛粉的水溶液的pH、浸提時間和魔芋飛粉與純水的質量比進行了優選。優選地，上述步驟(I)中用NaOH溶液調節含魔芋飛粉的水溶液的PH值至9.0，浸提時間為50min，魔芋飛粉與純水的質量比為1:50。上述提取條件可以改變蛋白質分子表面的帶電情況，增加蛋白質的水溶性，同時可以防止蛋白質的脫氨、脫羧等有害物質的產生。經過檢測，從魔芋飛粉中提取的魔芋飛粉蛋白收率為90%。
[0015]其次，考慮到酶法水解常用的酶有很多種，不同蛋白酶作用于蛋白質肽鏈上的位點不同，造成了水解程度和多肽的組成不同。因此，本發明分別對第一次酶解反應、第二次酶解反應的水解酶的種類、用量和酶解條件進行了優化。
[0016]對于第一次酶解反應而言，具體優化如下:作為本發明的一個優選實施例，優選地，上述步驟(2)中的pH為7.5、溫度至55°C，酶解時間為3小時。
[0017]作為本發明的一個優選實施例，優選地，上述第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，進一步優選地，第一酶解反應中，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100，更進一步優選地，其中堿性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50，其中中性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50。
[0018]對于第二次酶解反應而言，具體優化如下:作為本發明的一個優選實施例，優選地，上述步驟(3)中的pH為8.0、酶解時間為3小時。
[0019]作為本發明的一個優選實施例，優選地，上述第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶。
[0020]最后，考慮到魔芋蛋白水解物中可能含有未被消化的蛋白質，纖維素，無機鹽及色素等雜質，本發明采用膜分離技術進行除雜、濃縮。根據計算我們選擇350Da和3500Da的濾膜將魔芋多肽提取物中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，分子量大于3500Da的魔芋多肽成分將再次經過第一次酶解反應、第二次酶解反應和超濾純化，最終獲得分子量為350Da?3500Da的魔芋多肽。因此，發明對超濾純化工藝進行了優化，魔芋水解多肽超濾純化的最佳工藝條件為:pH值為8.0，溫度為45°C，壓力為0.08MPa。
[0021]由于超濾的過程不需要添加化學萃取成份，不但可以分離出各種雜質，還可以對樣品進行濃縮，保證高質量魔芋多肽的產生。在魔芋多肽提取物中，魔芋蛋白水解多肽的最終含量為97%。
[0022]綜合上述優選條件，本發明提供了一種最優的從魔芋飛粉制備魔芋多肽提取物的方法，其包括如下步驟:
它包含如下步驟:
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100，其中堿性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50，中性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50。
[0023](3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ;
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0024]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在97%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0025]本發明的第二個目的是提供一種按照上述方法從魔芋飛粉獲得的魔芋多肽提取物，在魔芋多肽提取物中含有魔芋多肽97%，總酸1.2%，全糖(以葡萄糖計)1.1%，銨鹽0.7%，并且魔芋多肽的分子量在350?3500道爾頓之間。
[0026]本發明的第三個目的在于提供從魔芋多肽提取物在制備治療糖尿病及其糖尿病并發癥的藥物中的用途。
[0027]糖化血紅蛋白對糖尿病患者來說是一項非常重要的監測指標，它的高低直接決定將來各種嚴重影響糖尿病患者生活質量的慢性并發癥的發生和發展。糖尿病患者定期監測糖化血紅蛋白具有非常重要的 意義，有助于幫助患者改善血糖控制水平，促進患者的血糖達標，并減少并發癥的發病率，從根本上改善糖尿病患者的生活質量。本研究采用魔芋多肽提取物喂養糖尿病大鼠，并與模型組、吡格列酮組、魔芋葡甘聚糖組、魔芋飛粉組相比，結果發現，本發明的魔芋多肽提取物在降低糖化血紅蛋白水平方面具有顯著的優勢，并預示著本發明提供的魔芋多肽提取物對于糖尿病和糖尿病并發癥具有很好的治療作用。所述的糖尿病并發癥包括，糖尿病并發癥動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變、非酒精性脂肪肝和糖尿病腎病等。
[0028]血清高敏C反應蛋白(CRP)是炎癥標志物，在發熱性疾病、各種炎癥狀態和創傷時，血清CRP水平會明顯增高。長期以來，臨床常以健康群體CRP的95%參考值上限判斷患者有無明顯的感染性炎癥。但是，高靈敏度CRP (Hs-CRP)檢測方法的開發和應用研究結果表明，原先認為是正常的血清CRP水平的高低卻同未來的心血管病的發生密切相關。大量研究資料表明，動脈粥樣化的血栓形成除了是脂肪堆積過程外，也是一個慢性炎癥過程，而CRP是動脈粥樣化的血栓形成疾病的介導和標志物。CRP對心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥和行經皮血管成形術患者，具有預測心肌缺血復發危險和死亡危險的作用。本發明通過試驗研究表明了本發明的魔芋多肽提取物可以顯著降低了糖尿病患者血清CRP，這預示著將顯著減弱糖尿病患者與炎癥相關的并發癥反應。這進一步說明，本發明的魔芋多肽提取物可以用于治療和/或預防諸如糖尿病并發癥動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變、非酒精性脂肪肝和糖尿病腎病。
[0029]本發明尤其關注了魔芋多肽提取物對糖尿病腎病的治療效果。具體地，首先發明人通過對SD大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)來完成糖尿病腎病(DN)的造模。對造模成功的大鼠給予本發明的魔芋多肽提取物，連續給藥4個月后測尿微量白蛋白。結果發現，經過長期灌胃給藥魔芋多肽提取物，在對DN大鼠尿微量白蛋白(MA)的影響方面，本發明的魔芋多肽提取物與模型組相比具有顯著性差異。這也說明魔芋多肽提取物可以用于治療糖尿病腎病。
[0030]與此同時，本發明還提供了一種治療和/或預防糖尿病、糖尿病并發癥尤其是動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變、非酒精性脂肪肝、糖尿病腎病的方法，即給與本發明的魔芋多肽提取物IOmg?3000mg/d，優選地，給與本發明的魔芋多肽提取物60?1200mg/d。其中給藥頻次對與本領域的技術人員來說是可以依據病情、年齡等各種因素綜合考慮后確定的。
[0031]魔芋多肽提取物作為糖尿病及其并發癥的治療藥物，與其他抗糖尿病藥物相比，具有如下技術優勢:首先，適用面廣。適用于各類型的糖尿病人、糖耐量異常或血糖偏高者，對肥胖、遺傳等原因的血糖增高者，服用后可防患于未然。其次，不會引起低血糖反應。魔芋多肽主要是改善、修復自身胰島素活性，與細胞受體產生親和力，這種促進仍在機作整體調控之中。最后，毒副作用非常小。一般情況下降糖是通過外源性藥物刺激3細胞釋放胰島素，這樣就使胰島素無法長期承受這樣的超負荷刺激，也刺激了肝、腎代謝功能，無異于殺雞取卵。具有降血糖功能的魔芋多肽是盡量給機體提供輔助手段，讓機體自身提高調節血糖的能力，其調節機理和植物中提取的特點決定了其服用的安全性。
[0032]本發明的第四個目的是提供一種含有上述魔芋多肽提取物的藥物制劑，所述的藥物制劑為臨床上常用的藥物劑型。作為藥物制劑而言，可以將本發明的魔芋多肽提取物配制成各種形式，如片劑、膠囊 劑、口服液和注射劑，對于片劑，將多肽提取物與藥學上認可的適用載體混合，所述的藥學上認可的載體也稱為賦形劑，須具有足夠的純度和可以接受的低毒性，比如微晶纖維素、淀粉等。
[0033]本發明的第五個目的在于提供包含上述魔芋多肽提取物的藥物組合物及其它們作為治療糖尿病或糖尿病并發癥的用途。
[0034]在本發明提供的魔芋多肽提取物及其用于治療糖尿病及其并發癥的基礎上，本發明提供了含有魔芋多肽提取物的藥物組合物，所述的藥物組合物還含有如下活性組分:至少一種胰島素增敏劑或至少一種胰島素促分泌劑，作為本發明藥物組合物的一個優選實施例，本發明的藥物組合物還含有吡格列酮；作為本發明藥物組合物的另一個優選實施例，本發明的藥物組合物還含有格列美脲。本發明的藥物組合物與單獨給予魔芋多肽提取物或吡格列酮(或格列美脲)相比，在降低糖化血紅蛋白和尿微量白蛋白方面，取得了預料不到的協同作用。
[0035]為此，為了進一步優選糖尿病及其糖尿病并發癥的治療方案，本發明提供了另外一種治療糖尿病及其并發癥的方法，即給予本發明的藥物組合物治療。其中，所述的糖尿病并發癥為動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變、非酒精性脂肪肝和糖尿病腎病。對于糖尿病及其并發癥的一個治療方案，同時給予魔芋多肽和吡格列酮(或格列美脲)，魔芋多肽與吡格列酮(或格列美脲)的重量比可以是藥學上能夠接受的任意比例。優選地，魔芋多肽與吡格列酮(或格列美脲)的重量比為:(10?3000): (3?120)，進一步優選地，魔芋多肽與吡格列酮(或格列美脲)的重量比為(60?1200): (5?40);所述的重量比是在活性組分的有效劑量的比值。例如，藥物組合物中吡格列酮的有效劑量為3?120mg/d，魔芋多肽提取物的有效劑量為10?3000mg/d。
[0036]更優選地，可以給予糖尿病患者一種藥物劑型進行治療，通常，通過常規制劑技術制成含有魔芋多肽提取物和吡格列酮(或格列美脲)的固體口服制劑，包括普通片、分散片、緩釋片、膠囊或注射劑。
[0037]總之，本發明與現有技術相比，具有如下突出的技術優勢:
(I)該工藝有效地利用了通常的魔芋精粉加工過程的廢棄物魔芋飛粉，制備得到了有重大的藥物價值的魔芋多肽提取物，具有十分重要的生產意義和經濟價值。
[0038](2)本發明采用酶解法制備生物活性肽，并仿效人體消化道內的正常消化條件將魔芋蛋白切割成特定的水解片段，對水解酶的種類、用量和酶解條件進行了優化；酶解條件溫和，較無機酸、堿水解有較大的優勢，避免了水解過程中的環境污染問題。
[0039](3)本發明創造性地利用超濾手段定向收集350?3500 Da內的多肽片段，并使所得多肽組合物中該分子量范圍內的多肽純度高達97%，且工藝穩定，重現性高。
[0040](4)本發明還通過藥效實驗證明本發明所制備的魔芋多肽提取物可以顯著降低STZ誘導糖尿病大鼠的血糖、糖化血紅蛋白和尿微量白蛋白水平，表明魔芋多肽提取物對糖尿病有顯著的治療作用。并且植物多肽提取物用于糖尿病的治療時療效確切、不良反應和副作用均明顯降低，且能實現糖尿病患者的穩定降糖效果，可大大提高糖尿病患者的用藥依從性。
[0041]
【具體實施方式】
[0042]以下通過具體實施例進一步描述本發明，但本發明不僅僅限于以下實施例。在本發明的范圍內或者在不脫離本發明的內容、精神和范圍內，對本發明所述的魔芋多肽提取物、制備方法和用途僅僅進行名稱上的變更、替換，對于本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明范圍之內。
[0043]第一部分魔芋多肽提取物的制備
實施例1從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節含有魔芋飛粉的水溶液的PH值至8.5，浸提時間為lOOmin，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.0、溫度至60°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為2.5小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和胰蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50。
[0044](3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至7.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為4.0小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為木瓜蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:100。[0045](4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為40°C，pH為9.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，即得魔芋多肽提取物。經檢測分析，魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量高達85.9%。
[0046]實施例2從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節含有魔芋飛粉的水溶液的PH值至9.5，浸提時間為20min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的PH至8.0、溫度至50°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為4.5小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:150。
[0047](3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至9.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時 間為2.0小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為中性蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:400。
[0048](4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為50°C，pH為7.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。經過檢測，上述方法獲得的魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量在92.5%。
[0049]實施例3從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100，其中堿性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50，中性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50 ；
(3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶，胰蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ;
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。[0050]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在97.2%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0051]實施例4從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100 ;
(3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為堿性蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ；
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0052]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在92.2%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0053]實施例5從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為胃蛋白酶和胰蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100 ；
(3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胃蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ;
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0054]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在96.1%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0055]實施例6從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為中性蛋白酶和胃蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:200 ；
(3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ;
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350 Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0056]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在95.4%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0057]實施例7從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物一種方法
(1)魔芋蛋白提取液的制備:
將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白；
(2)第一次酶解反應:
調節(I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100，其中堿性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:80，中性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:20 ；
(3)第二次酶解反應:
調節(2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶，胰蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ;
(4)超濾純化:
將(3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
[0058]經過檢測，上述方法獲得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在96.2%，活性多肽的分子量范圍在350?3500道爾頓之間。
[0059]需要注意的是，第一酶解蛋白酶可以有很多選擇，例如，可以是堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶三種，也可以是任意四種。在此不能將每一配比都寫入實施例，但其也在本發明保護范圍內。
[0060]第二部分本發明含有魔芋多肽提取物的藥物制劑 實施例8片劑
【權利要求】
1.一種從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物的方法，其特征在于，它包含如下步驟: 1)魔芋蛋白提取液的制備: 將魔芋飛粉加入純水中，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節含有魔芋飛粉的水溶液的pH值至8.5?9.5，浸提時間為20?lOOmin，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白； 2)第一次酶解反應: 調節步驟I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.0?8.0、溫度至50°C?60°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為2.5?4.5小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶至少選自堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的兩種；第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50?200 ; 3)第二次酶解反應: 調節步驟2)中所得的第一次酶解液的pH至7.0?9.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為2.0?4.0小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶至少選自堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一種；第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:100?400 ； 4)超濾純化: 將步驟3)所得到的第二次酶解液，在溫度為40°C?50°C，pH為7.0?9.0，選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
2.根據權利要求1所述的一種從魔芋飛粉中制備魔芋多肽提取物的方法，其特征在于，它包含如下步驟: 1)魔芋蛋白提取液的制備: 將魔芋飛粉加入純水中，魔芋飛粉與純水重量比為1:50，攪拌混勻得含有魔芋飛粉的水溶液；用NaOH溶液調節上述水溶液的pH值至9.0，浸提時間為50min，然后離心處理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飛粉蛋白； 2)第一次酶解反應: 調節步驟I)中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、溫度至55°C，加入第一酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:100，其中堿性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50，中性蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為3:50 ； 3)第二次酶解反應: 調節步驟2)中所得的第一次酶解液的pH至8.0、溫度至37°C，加入第二酶解蛋白酶，恒溫攪拌酶解，酶解時間為3小時，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶為胰蛋白酶，第二酶解蛋白酶與魔芋飛粉蛋白的重量比為1:300 ； 4)超濾純化: 將步驟3)所得到的第二次酶解液，在溫度為45°C，pH為8.0，選擇350Da和3500Da的濾膜將第二次酶解液中350Da?3500Da分子量的魔芋多肽進行分離，獲得的分離液即為魔芋多肽提取物。
3.一種用權利要求1或2所述的方法制備的魔芋多肽提取物。
4.根據權利要求3所述的魔芋多肽提取物，其特征在于，所述的魔芋多肽提取物中含有魔芋多肽97%，總酸1.2%，全糖1.1%，銨鹽0.7%，且魔芋多肽的分子量為350?3500Da。
5.根據權利要求4所述的魔芋多肽提取物在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
6.根據權利要求4所述的魔芋多肽提取物在制備治療糖尿病并發癥的藥物中的用途，所述的糖尿病并發癥為動脈粥樣硬化、糖尿病視網膜病變、非酒精性脂肪肝和糖尿病腎病。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于所述的糖尿病并發癥為糖尿病腎病。
8.包含權利要求3所述的魔芋多肽提取物的藥物制劑，其特征在于，所述的藥物制劑還含有賦形劑，并且所述的藥物制劑為片劑、膠囊劑或注射劑。
9.包含權利要求3所述的魔芋多肽提取物的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中還含有:至少一種胰島素增敏劑或至少一種胰島素促分泌劑。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所述的胰島素增敏劑為吡格列酮，所述的胰島素促分泌劑為格列美脲`。
【文檔編號】A61K36/888GK103436582SQ201310414063
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】馬杰坤 申請人:馬杰坤