用干擾素治療肺病的方法

用干擾素治療肺病的方法
【專利摘要】本發明提供了一種治療肺病如特發性肺纖維變性(IPF)和哮喘的方法，包括施用治療有效量的氣霧劑化干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素γ。本發明同時也提供了一種或多種氣霧劑化干擾素的藥物組合物。
【專利說明】用干擾素治療肺病的方法
[0001]本申請是申請日為2005年9月20日的申請號為200580052105.0標題為“用干擾素治療肺病的方法”的申請的分案申請
[0002]政府支持
[0003]導致本發明的一些研究由NIH科研基金ROl HL55791，K07HL03030和MOl RR00096
提供部分支持。政府可能享有本發明的一些權利。
發明領域
[0004]本發明涉及用干擾素氣霧劑治療肺病的方法，用于氣霧劑輸送的一種或多種干擾素制劑以及確定氣霧劑沉積的方法。
[0005]背景
[0006]根據現行NAEPP/NIH指南，哮喘治療的主要方式仍然是抗炎劑，其中皮質類固醇是最有效的。但是，長期施用皮質類固醇會引起全身性的副作用。而且，一些哮喘病患者對皮質類固醇有抗性。因此，需要針對過敏性氣道疾病中炎性反應的新藥劑。
[0007]哮喘的免疫機理包括記憶性⑶4+T輔助細胞的極化參與，以及分泌二型(Th2)細胞因子(白介素(IL)-4，IL-5)的細胞的不平衡性。細胞因子干擾素-Y (IFN-Y)是幼稚(naive)⑶4+淋巴細胞分化成Thl表型所必需的。
[0008]哮喘中的氣道炎癥特征為嗜曙紅細胞和激活的⑶4+T細胞數目增多。哮喘涉及記憶性⑶4+T輔助細胞的極化參與和分泌Th2型細胞因子的細胞相對于那些分泌Thl型細胞因子的細胞的不平衡性。一些細胞因子的產生增加以及組織嗜曙紅細胞增多和IgE產生增加，所述細胞因子包括2型細胞因子`IL-4和IL-5、腫瘤壞死因子(TNF)-α和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。大部分氣道炎癥的細胞因子譜(profile)研究來自小鼠哮喘模型。動物通常用卵清蛋白的抗原致敏并攻擊后，發現產生抗原特異性IgE、氣道嗜曙紅細胞增多和針對氣霧劑抗原刺激的氣道高反應性。這些變化與Th2細胞因子增多和IFN-Y產生減少相關(Brusselle et al.,Am J Respir Cell Mol Biol，1995Mar; 12 (3): 254-259)。
[0009]Th2細胞因子IL4在氣道炎癥中扮演重要角色，它可促進由B細胞到IgE合成的同種型轉換并誘導幼稚T細胞分化成Th2淋巴細胞。IL-4敲除小鼠經氣霧劑抗原攻擊后在氣道中不能產生特異性IgE、氣道高反應性、氣道嗜曙紅細胞增多或Th2細胞因子(Brusselleet al.，Am J Respir Cell Mol Biol，1995Mar; 12 (3): 254-259)。在最初暴露于抗原而非在攻擊過程中用抗IL-4處理的野生型小鼠會抑制IL-5的產生和氣道嗜曙紅細胞增多，而在抗原攻擊過程中施用抗IL-4則不會抑制嗜曙紅細胞增多，這表明IL-4對誘導局部Th2反應是必需的(Coyle et al.，Am J Respir Cell Mol Biol 1995 Jul; 13 (I): 54-59)。
[0010]IL-10是由Thl和Th2淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞、肥大細胞、角質形成細胞和嗜曙紅細胞產生的細胞因子。IL-10通過下調不同細胞特別是單核細胞的促炎性細胞因子的合成而作為抗炎性細胞因子發揮作用。IL-10通過功能性抑制抗原呈遞細胞(APC)來下調 IL-5 的產生(Pretolani et al, Res Tmmunol 1997 Jan)。IL-10 對嗜曙紅細胞功能的直接效果也已被證實。低濃度的IL-1O在降低嗜曙紅細胞的CD4表達和加速細胞死亡方面幾乎和皮質類固醇的活性一樣。GM-CSF是一種直接參與發炎組織中嗜曙紅細胞和中性粒細胞的歸巢和激活的細胞因子。已經注意到在哮喘患者中與正常對照相比，由PBMC產生的 IL-1O 和肺泡巨卩遼細胞水平減少(Borish, L et al.，J Allergy Clin Tmmunol 1996Jun; 97 (6): 1288-1296; Koning et al.，Cytokinel997Jun; 9 (6): 427-436)。在兩個過敏性炎癥小鼠模型中，滴注IL-1O可保護致敏的小鼠使其不發生氣道嗜曙紅細胞增多和中性白細胞增多，可能是通過抑制IL-5和TNF-α實現(Zuany-Amorim et al., J Clin Investl996:2644-2651;Zuany-Amorim et al.，J Tmmunol 1996 Jul I;157 (I):377-84)。
[0011]與細胞因子產生的Th2/Thl 二分法一致，在哮喘鼠模型中觀察到IL-4和IL_5占主導的細胞因子譜和低水平的Thl細胞因子IFN-Y和IL-12 (Ohkawara et al.，AmJ Respir Cell Mol Biol 1997 May; 16 (5):510-20)。近期有動物研究著眼于以重組鼠IL-12進行治療，試圖扭轉Th2的優勢。體外數據表明，在T淋巴細胞的初次抗原刺激中，IL-12 的存在會促進 Thl 細胞的發育(Kips et al., Am J Respir Crit Care Med1996 Feb; 153 (2): 535-9) 0 Kips在體內實驗中確認了這一點:在免疫時施用IL-12，防止了產生特異性IgE、氣道嗜曙紅細胞增多和氣道高反應性。雖然在氣霧劑攻擊已經致敏的小鼠的過程中施用IL-12可防止氣道嗜曙紅細胞增多和氣道高反應性，但不能降低特異性IgE的產生，表明IL-12刺激幼稚Th細胞向Thl細胞分化，并且能夠抑制Th2細胞的發育。以IL-12抑制抗原誘導的氣道嗜曙紅細胞增多在致敏初期是IFN-Y依賴性的，但在再次攻擊時變成IFN-Y非依賴性的(Brusselle et al., Am J Respir CellMol Biol 1997 Dec; 17 (6): 767-71)。并且，在用氣源性致敏原攻擊前，將肺中的IL-12基因用痘苗病毒載體通過粘膜基因轉移到致敏的小鼠中，被證實可導致以IFN-Y依賴性方式抑制IL-4和IL-5、氣道高反應性和氣道嗜曙紅細胞增多(Hogan et al.，-Eur JImmunol1998Feb.;28(2):413-23)。
[0012]增加的IFN-Y水平可推動免疫反應轉向Thl表型并且可能對哮喘有益。人類臨床相關性聚焦在血清或刺激后的PBMC中的細胞因子水平。大多數利用受激的PBMC所作的細胞因子的測定是在兒童中進行的。這些研究證實哮喘癥兒童具有IL-4和IL-5產生增多和IFN-Y產生減少的傾向。此外，其它人證實特應性和/或過敏嚴重程度和IFN-Y釋放之間成逆相關(Imada et al., (1995) Immunology85 (3):373-80 ;Corrigan et al.,(1990)Am Rev Respir Disl41(4)Ptl:970-7 ；Leonard et al., (1997)Am J Respir CellMol Bioll7(3):368-75 ；Kang et al.,(1997)J Interferon Cytokine Resl7(8):481_7)。哮喘病患者BAL液中的細胞因子水平顯示出低水平的IFN-Y (Kang et al.，(1997) JInterferon Cytokine Resl7(8):481-7)。
[0013]人的rIFN-gamma的臨床試驗非常少。到1999年，IFN-Y被指明可用于治療慢性肉芽腫性疾病，其中長期治療(平均持續2.5年)可改善皮膚損傷，具有最小程度的副反應(發燒，腹瀉，流感類似癥狀)(N Engl J Med324(8):509-16;Bemiller et al.(1995)BloodCells Mol Dis21 (3):239-47;Weening et al.，(1995)Eur J Pediatrl54(4):295-8)。Boguniewicz用漸強劑量的氣霧劑化rIFN- Y (最大劑量500mcg，總實驗劑量2400mcg)治療5個輕度特應性哮喘患者,用藥超過20天(Boguniewicz et al., (1995) J Allergy ClinImmunol95 (I) Ptl:133-5)。所有病人耐受霧狀r IFN-Y，但是在包含峰流量的所測終點沒有顯著變化。[0014]我們向5個具有持續性抗酸桿菌(AFB)涂片及培養陽性多藥抗藥性結核病(TB)患者施用霧狀 r IFN- Y (Condos et al.，(1997) Lancet349 (9064): 1513-5)。病人接受氣霧劑r IFN-Y，500mcg，一周3次，共4周(總試驗劑量6000mcg)。治療很好的實現了耐受，副反應極少。4周結束時，5個病人中的4個呈現痰AFB涂片陰性并且到達陽性培養的時間增加，表明治療后機體負荷減少。有趣的是，在這些報道的和其它的病人中，治療后I小時后進行的PEFR改善了 6% (η=IO )。
[0015]特發性間質性肺炎按照組織學被分為七類。這包括普通的間質性肺炎(UIP)，非特異性間質性肺炎(NSIP)，彌漫性肺泡損傷(DAD)，機化性肺炎(OP)，脫屑性間質性肺炎(DIP)，呼吸性細支氣管炎(RB)，和淋巴細胞間質性肺炎(LIP) ο參見，例如Nicholson,Histopathology,2002，41，381-391;White，J Pathol2003,201，343-354。
[0016]術語“特發性肺纖維變性(IPF) ”同義于“隱原性纖維性肺泡炎(CFA) ”，是一個臨床術語，指特發性間質性肺炎的一個主要亞組，它描述了一種疾病，其特征為特發性進行性間質性疾病，呼吸困難出現之后平均存活時間為3-6年。特發性肺纖維變性的診斷是通過鑒定肺組織活檢樣本上的普通間質性肺炎(ΠΡ)進行的。組織學模式的特征為不均勻性，包括斑隙性慢性發炎(肺泡炎)，進行性損傷(增殖性肌纖維母細胞和成纖維細胞的小聚集物，術語稱為纖維形成病灶)以及纖維化(密集的膠原和蜂窩狀改變)(參見，例如.King etal.,2000, Am J of Resp.and Critical Care Med.，164，1025-1032)。對間質性肺炎另一個亞組的治療不能表明可以成功治愈特發性間質性纖維化。
[0017]皮質類固醇和細胞毒素劑是治療的主要方式，只有10-30%的患者表現出初始瞬時反應，表明需要長期治療(Mapel et al.(1996)Chestl 10:1058-1067;Raghu etal.(1991)Am.Rev.Respir.Dis.144:291-296)。由于特發性肺纖維變性的預后很差，需要新的治療方法。
[0018]干擾素是由免疫系統細胞產生的天然蛋白質家族。已經鑒定出3類干擾素，α、β和Y。每類有不同的效應，雖然他們的活性有重疊。總起來說，干擾素指導免疫系統攻擊病毒、細菌、腫瘤和其它可能入侵身體的外源物質。一旦干擾素檢測到并攻擊外源物質，會通過減速、阻斷或者改變其生長或功能來改變它。
[0019]干擾素-Y是多效性細胞因子，具有特異性免疫調節作用，例如激活巨噬細胞、加強氧自由基的釋放、殺死微生物、加強MHC II類分子的表達、抗病毒作用、誘導可誘導一氧化氮合酶基因及NO的釋放、募集和激活免疫效應細胞的趨化因子、下調轉鐵蛋白受體以限制微生物對鐵的獲取(細胞內病原存活所需)等。缺乏干擾素-Y或其受體的基因工程化小鼠對分枝桿菌感染極其易感。
[0020]重組IFN- Y在1980年代通過肌內和皮下途徑施用于正常的志愿者和癌癥患者。有單核細胞的激活的證據，例如氧化劑釋放。JafTe等人報道了向20個正常的志愿者施用rIFN Y (參見，Jaffe et al.,J Clin Invest.88，297-302 (1991))。首先，他們通過皮下施用rIFN-gamma250μ g，觀察到在4小時出現血清水平峰值，24小時出現最小值。
[0021]幾個臨床試驗受到資助以研究IFN-Y對傳染性疾病的作用。MDR-TB臨床試驗，題目為 “A Phase II/III Study of the Safty and Efficacy of Inhaled AerosolizedRecombinant Interferon-yIb in Patients with Pulmonary Multiple Drug ResistantTuberculosis (MDR-TB)Who have Failed an Appropriate Three Month Treatment，，,在不同地區(Cape Town、Port Elizabeth、Durban、Mexico)招募了 80 個 MDR-TB 患者，隨機接受氣霧劑rIFN-gamma (500μ g MWF)或安慰劑，在第二線治療以外至少6個月。這個臨床試驗提前被結束了，因為痰涂片、M tb培養或胸X光片變化都缺乏有效性。
[0022]Ziesche等向9/18個特發性肺纖維變性(IPF)患者皮下給予rIFN-Y，劑量為200mg，一周三次，同時口服強的松。參見 Ziesche et al.，(1999) N.Eng.J.Med.，341，1264-1269)。接下來發表了以干擾素Y -1b治療IPF的3期臨床試驗的結果。雖然這是第一個具有足夠量樣本容量的IPF臨床試驗，是隨機的、預期的、雙盲的、安慰劑-對照研究，但沒有發現對生理功能標記物例如最大肺活量有顯著作用。但是，安慰劑組發生了較多死亡，接受干擾素Y-1b治療的一個亞組的病人其存活率顯著改善，而且最大肺活量值是正常預測值的55%或更高，對一氧化碳的肺擴散容量值是正常預測值的35%或更高。那個研究中疾病進展和存活率不相符的原因有待探討。一個可能性是當其使IPF患者的臨床過程復雜化時，干擾素Y-1b治療改善了宿主對感染的抵御并減少了下呼吸道感染的嚴重性。這個可能性被Strieter等的發現所支持，其發現在接受干擾素Y-1b治療的個體的血漿和支氣管肺泡灌洗(BAL)液中，與接受安慰劑的相比，可被干擾素誘導的具有抗微生物特性的CXC趨化因子1-TAC/CXCL11被顯著上調，而促纖維化細胞因子大體上并沒有被持續6個月治療期的干擾素Y-1b治療顯著改變(參見Strieter et al., Am J Respir Crit CareMed.(2004)。解釋這個黯淡結果的一個可能是以現行劑量策略向肺間質所施用的藥物水平不足。
[0023]發明簡述
[0024]在一方面，本發明特點為一種在患肺病個體中治療肺病的方法，包括施以治療有效量的氣霧劑干擾素。在很多實施方案中，肺病是阻塞性肺病。在一些實施方案中，肺病是哮喘或特發性肺纖維變性。在一個實施方案中，肺病的征狀改善可通過預測最大肺活量值(FVC)比治療前至少高大約10%，優選至少高大約20%或至少大約25%甚至33%來測量。干擾素可以是干擾素-α、干擾素-β或干擾素-Y。
[0025]在另一實施方案中，患肺病例如IPF或哮喘的個體對一種或多種皮質類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。而且，在對免疫抑制治療具有最低限度反應的病人中，其肺功能測試有中度但不顯著的改善，本發明的進一步的方面以氣霧劑化干擾素合并治療這些病人，同時保留一或多種其它治療方案的治療，包括但不限于以一或多種免疫抑制劑或抗炎劑治療。
[0026]在更具體的實施方案中，氣霧劑化干擾素以大約250μ g至750 μ g范圍的劑量通過噴霧器施用，每周三次。在另一個實施方案中，通過噴霧器施用SOOyg的劑量，優選每周三次。按照噴霧器的效率可施用更低的劑量。
[0027]如果需要以干擾素-Y治療和其它治療形式組合治療IPF患者，氣霧劑化干擾素-Y要被滴定以保證這些患者不會得到非所需的效應。此外，當考慮組合治療時，其他藥劑可通過被認為是最有效的方式施用。這可能包括靜脈內、肌內、皮下或可與IFN-Y合并以氣霧劑施用。
[0028]在另一方面，本發明的特點是一種精確地確定一種通過氣霧劑施用的藥劑在上呼吸道沉積的方法。在本發明的這個方面的一個實施方案中，通過氣霧劑施用的藥劑是干擾素例如干擾素-α、 干擾素_β或干擾素-Y。這項技術是獨特的，可應用于向所有類型的肺病患者施用干擾素例如干擾素-α、干擾素-β或IFN- Y。
[0029]其它目標和優點會通過閱讀接下來的詳細描述并結合以下示例性附圖而變得明朗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1描述了一種典型的潮式呼吸模式。
[0031]圖2描述了慢速深吸氣方法與潮式呼吸相比特點為吸氣流降低和吸氣時間大幅延長。
[0032]圖3代表用慢速深度呼吸模式吸入4.5 μ m的氣霧劑的人類個體的沉積模式。圖像表明氣霧劑的上氣道最小限度(小于10%)的沉積，以胃中少量的活性闡明。沉積圖像代表了以慢速深度模式(吸氣時間大約8秒)呼吸3次后，放射性標記的氣霧劑沉積在人類個體的肺外周。
[0033]圖4是同一個體以潮式呼吸20次吸入1.5 μ m顆粒(現行標準吸入模式)的說明性掃描。圖像分析表明包含使用大顆粒、慢吸氣和延長的吸氣時間的慢速深呼吸方法每次呼吸在肺中沉積氣霧劑顆粒效率高51倍。
[0034]圖5描述了一個患IPF的病人的沉積掃描，其已通過噴霧器接受每周3次共12周的500 μ g IFN-Y治療。治療后進行成像。感興趣區域以輪廓標出。sU/L是肺上部沉積的放射活性相對于肺下部沉積的分布，以氙作標準化。圖中水平線代表肺上象限和下象限的分界線。sC/P指如下所述的特定的中心相對于外周的比率。a/Xe指氣霧劑相對于氙的比率。
[0035]圖6代表氣霧劑治療前后從BAL中所測的TGF- β水平。
[0036]圖7表明在一個為5個患IPF的病人進行的氣霧劑rIFN- Y的研究中，5個病人接受治療后其增加的百分率預測總肺活量。所有的病人均報告其呼吸短促有主觀性改善。在3個月治療末期，這個研究中的病人其總肺活量有統計學上顯著的增加。5個研究病人中的
2個其最大肺活量有超過200cc’ s的改善(分別為200和500cc)。
[0037]圖8表明在一個為5個患IPF的病人進行的氣霧劑rIFN- Y的研究中5個病人中的3個接受治療后其增加的百分率預測總肺活量。這些生理變化伴隨著從這些病人的支氣管肺泡灌洗(BAL)液(從肺內皮層洗出的液體)中回收的活性TGF-β水平的降低。
[0038]圖9A和9B表明接受氣霧劑rIFN- Y治療IPF的5個病人中TGF-β在其總蛋白中所占比例減少。TGF-β是肺纖維化中主要調控物之一。它的激活導致膠原產生。其水平降低應該引起較少的膠原沉積和較少的肺纖維化。
[0039]圖10表明干擾素-Y氣霧劑治療前后，在肺結核和特發性肺纖維變性病人肺部所測的干擾素-Y的量。
[0040]圖11代表哮喘病人接受氣霧劑IFN- Y治`療后其峰流量值的百分率變化。所有接受氣霧劑IFN-Y治療的病人都用肺量測定法評估可逆性氣道疾病。在每個氣霧劑治療中，病人在治療前后進行峰流量的監控。
[0041]圖12提供了圖2中所指的所測峰流量的百分比變化的總結。在氣霧劑干擾素Y治療后平均峰流量增加，在一些病人中有顯著增加。特別注意到，在所有的干擾素Y治療后峰流量測量值降低的病人中，沒有發現咳嗽或其它抱怨。這些數據表明氣霧劑干擾素Y在氣道疾病患者中是安全并是良好耐受的。
[0042]發明詳述
[0043]在描述本發明的方法和治療方法學之前，應該理解本發明不限于描述的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件可變。也應理解所用術語只是為了描述特定實施方案，并不是為了限定本發明的范圍，因為本發明的范圍由所附權利要求書限定。
[0044]如本說明書和權利要求書中所用，單數形式“一”和“所述”包括復數形式，除非上下文另有明確說明。因此例如，“所述方法”包括一或多種方法和/或這里描述的和/或通過閱讀本文內容本領域技術人員顯而易見的步驟等等。
[0045]除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的意義。雖然相似或等價于這里描述的任何方法和材料均可應用于實踐或測試本發明，這里描述了優選地方法和材料。所有提到的文獻引入以作參考，來批露和描述所引文獻中的方法和/或材料。
[0046]定義
[0047]術語“改善的征狀”在特定實施方案中，評定為預測的FVC值比治療前至少改善10%。
[0048]短語“對一或多種皮質類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應”指對常規現有技術治療無反應的患者群體。
[0049]肺活量(VC)指可以進出肺的 空氣總量。
[0050]Fevl指一秒鐘用力呼氣量。
[0051]FevI/FVC率指一秒鐘用力呼氣量與最大肺活量的比值。
[0052]術語“肺病”指任何影響至少部分肺或呼吸系統的病理學。這個術語包括阻塞性和非阻塞性病癥，例如哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病、肺炎、肺結核和任何形式的纖維化，包括但不限于特發性肺纖維變性。
[0053]術語“阻塞性肺病”指任何可導致進出呼吸系統空氣流減少的肺病。氣流相對正常的減少可以總的或一段有限時間內例如FVC或FEVl進行測量。
[0054]術語“特發性肺纖維變性(IPF)”同義于“隱原性纖維化肺泡炎(CFA)”，是一個臨床術語，指特發性間質性肺炎的一個主要亞組，它描述了一種疾病，特征為特發性進行性間質性疾病，呼吸困難出現之后平均存活時間為3-6年。特發性肺纖維變性的診斷通過鑒定肺組織活檢樣本上的普通間質性肺炎(UIP)進行。組織學模式的特征為不均勻性，包括斑隙性慢性炎癥(肺泡炎)、進行性損傷(增殖性肌纖維母細胞和成纖維細胞的小聚集物，術語稱為纖維形成病灶)以及纖維化(密集的膠原和蜂窩狀改變)。
[0055]術語“哮喘”指一種包含炎癥(細胞損傷)和導向肺的氣道縮窄的普遍疾病。哮喘在兒童和成年人中發生。兒童哮喘可繼續到青春期和成年期，但是一些患哮喘的成人在其年輕時沒有哮喘。世界范圍內數以百萬的人受哮喘影響，這些年更為普遍。
[0056]“慢速深呼吸”指任何呼吸模式，其中吸氣時間比呼氣時間長。這種模式的特點為工作比(duty cycle)(吸氣時間/總呼吸時間)大于0.5。正常潮式呼吸中工作比總是小于或接近0.5。即是，吸氣時間總是小于呼氣時間。在疾病狀態下，阻塞性疾病中的工作比降低，在限制性疾病中它可能仍然小于0.5。“慢速深”呼吸其特點為Ι/E比率即吸氣時間除以呼氣時間大于I，在一些情況下，這個比率接近8或9，因此工作比為0.8或0.9。[0057]干擾素-Y的作用機理
[0058]最近在培養細胞中進行的細胞信號轉導通路研究描繪了一種暫時的針對IFN-Y應答的調節路徑(Vilcek et al.，(1994) Int Arch Allergy Immunol 104 (4):311-6; Younget al., (1995) J Leukoc Biol58 (4): 373-81)。當添加IFN-Y與其受體的細胞外結構域結合時發生第一個事件，然后導致在受體細胞內結構域預先存在的信號轉導及轉錄激活蛋白I (STAT-1)的酪氨酸磷酸化。只有酪氨酸磷酸化的STAT-1被激活，然后形成同型二聚體(或異二聚體)并與特異性DNA序列結合。 [0059]經過轉位到細胞核并結合至其很多基因的啟動子中的同族(cognate)調控元件后，STAT-1激活轉錄。STAT-1可與其它預先存在的組成型活性的轉錄因子一起作用，因此一些基因的轉錄被最大化誘導，而不需要新蛋白合成。其它基因由STAT-1和應答IFN- Y而新合成的轉錄因子調節。IRF-1基因，也編碼一個轉錄因子，也由應答IFN-Y的STAT-1調節(Pine，R.(1992)J Virol66(7):4470-8;Pine et al.， (1994)Embo J13(I):158-67;Pineet al.，(1990)Mol Cell BiollO (6): 2448-57)。應當注意，IRF-1 基因的啟動子也含有核因子K B(NF-kB)的結合位點，該因子介導腫瘤壞死因子- α (TNF-α )激活的IRF-1基因的轉錄(Harada et al.，(1994)Mol Cell Bioll4 (2): 1500-9; R.Pine，未發表)。
[0060]一旦IRF-1蛋白被合成，它即激活一組臨時下游基因的轉錄。IRF-1被示出可調節IFN-Y誘導的涉及抗原加工和呈遞的重要基因的表達，所述基因包括TAP-1、LMP-2 和 HLA-A 及 HLA-B I 類主要組織相容性抗原(Johnson et al.，(1994)Mol CellBioll4(2):1322-32;White et al.，(1996)Immunity5(4):365-76)。
[0061]IRF-1被磷酸化，對其磷酸化程度的操作影響其DNA結合活性(Pine et al.，(1990)Mol Cell Biol10 (6):2448-57;Nunokawa et al., (1994)Biochem Biophys ResCommun200 (2):802-7)。但是，沒有清楚證據表明IRF-1的磷酸化是體內調節的。STAT-1活性依賴于酪氨酸磷酸化，并受絲氨酸磷酸化程度的影響。但是，潛在的STAT-1的豐度也被調節。用IFN-Y過夜處理的細胞STAT-1蛋白水平增加，雖然酪氨酸磷酸化和DNA結合活性只比未刺激的細胞稍強(Pine et al.，(1994) Embo J13 (I): 158-67)。
[0062]基因表達和調節的研究能提供總體免疫狀態的其它方面的信息。特別的，細胞因子改變的功能性作用可通過測定特異性DNA結合活性來證實。例如，在T細胞中IL-12導致STAT-4的激活，然而IL-4導致STAT-6的激活，Thl和Th2反應的發生或由一個向另一個的轉換可由在一個特定時間檢測的STAT DNA結合活性譜中反映出來(Darnell (1996) RecentProg Horm Res51:391-403;Ivashkiv, L.B.(1995)Immunity3(I):1-4)。
[0063]氣霧劑化干擾素-Y治療IPF
[0064]最近，一個小隨機試驗IPF患者皮下干擾素-Y (IFN- Y )治療(Ziesche etal.(1999) N.Engl.J.Med.341:1264-1269)。IFN-Y治療前和治療中6個月所獲得的經支氣管活組織檢查樣品分析表明治療前不正常的促纖維化細胞因子轉化生長因子-β (TGF-β)和結締組織生長因子(CTGF)的增長經IFN-Y治療后顯著降低(Ziesche et al.(1999)上述)。經強的松單獨治療的病人其TGF- β和CTGF水平無變化。
[0065]干擾素的輸送
[0066]氣霧劑的輸送
[0067]在本發明一個廣泛的方面，提供了治療患肺病的個體的肺病的方法，所述肺病包括哮喘和特發性肺纖維變性(IPF)，所述方法包括施用治療上有效量的氣霧劑化干擾素例如干擾素-Y，其中所述肺病的癥狀得到改善或轉佳。改善的癥狀可以是相對于治療前預測的FVC值至少增加10%。在一個優選的實施方案中，氣霧劑化IFN-Y可用來治療患哮喘或IPF的個體，其中所述個體對一或多種皮質類固醇、環磷酰胺和硫唑嘌呤治療無反應。此外，氣霧劑化干擾素例如IFN-Y的施用在患肺纖維化的患者中經過計算并優化。這樣的施用可使患者在肺功能測試中得到改善。
[0068]干擾素例如IFN-Y可通過幾個不同的途徑施用，包括靜脈內、肌內、皮下、鼻內或通過氣霧劑。但是，當單獨治療一個肺部過程時，直接將藥物輸送到肺可避免其暴露于其它器官系統。通過氣霧劑有效施用SOOygIFN-Y，每周三次，共兩周，經支氣管肺泡灌洗(BAL)分析證實，施藥后可在正常病人中引起IFN-Y水平增高。同樣地，大約500微克的干擾素_β，每周三次以及大約0.25毫克的干擾素- α ,每周三次,被認為是有效的。
[0069]本發明的目標是通過肺部施藥途徑輸送干擾素例如干擾素-Y。干擾素例如IFN-Y在吸氣時被輸送到哺乳動物的肺部，然后橫越肺上皮層進入血流(關于這點的其它報告包括Adjei et al.,PHARMACEUTICAL RESEARCH,VOL.7,N0.6,pp.565-569(1990) ;Adjeiet al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144(1990);Braquet et al.,Journal of Cardiovascular Pharmacology, Vol.13, suppl.5,s.143-146(1989);Hubbardet al.，Annals of Internal Medicine, Vol.1ll, N0.3, pp.206-212(1989);Smith etal., J.Clin.1nvest., Vol.84,pp.1145-1146(1989);Oswein et al.,^Aerosolization ofProteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone,Colorado,March, 1990; and Platz et al.,美國專利號 5，284，656)。考慮到用于實踐本發明的是一大類用于肺部輸送治療性產品的器械設備，包括但不限于噴霧器、定量吸入器和干粉吸入器，所有這些都為本領域技術人員所熟悉。
[0070]一些商售的適合實踐本發明的設備的具體例子有Mallinckrodt, Inc., St.Louis,Missouri 生產的 Ultravent 噴霧器；由 Marquest Medical Products, Englewood, Colorado生產的 Acorn II 噴霧器；由 Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina 生產的 Ventolin 定量吸入器；及由 Fisons Corp., Bedford, Massachusetts 生產的 Spinhaler干粉吸入器；由 Allegiance, McGraw Park, IL 生產的 MistyNeb ；由 Trudell MedicalInternational, Canada 生產的 AeroEclipse0
[0071 ] 所有這些設備需要使用適合蛋白分散的制劑。通常，每種制劑特異適用于所用的設備類型，可能除了治療中所用的常規稀釋劑、佐劑和/或載體外還使用合適的推進劑材料。并且也考慮脂質體、微囊或微球包括復合體或其它類型的載體。化學修飾的蛋白也可制備在不同制劑中，這依賴于化學修飾的類型或所用設備的類型。
[0072]不管是噴嘴式還是超聲波式，適合噴霧器使用的制劑典型地包含溶解在水中的蛋白，其濃度為以大約每毫升溶液中有0.1至25mg的生物活性蛋白。所述制劑還可包括緩沖劑或簡單的糖(例如，為了蛋白質穩定和調節滲透壓)。噴霧器制劑還可含有表面活性劑，以減少或防止形成氣霧劑時溶液的原子化引起的蛋白質表面誘發聚合。
[0073]適合定量吸入器使用的制劑通常可以包含良好分散開的粉末，其含有在表面活性劑幫助下懸浮在推進劑中懸浮的蛋白。推進劑可以是任何用于此目的常規材料，例如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇及1，1，1，2_四氟乙烷或其組合。合適的表面活性劑包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可用做表面活性劑。
[0074]適合從干粉吸入器中分散的制劑可包含良好分散開的干燥粉末，其含有蛋白并可能包括膨脹劑，例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇，含量為可以促進粉末從所述設備中分散，例如重量占制劑的50%-90%。蛋白最好是以顆粒形式制備，平均顆粒大小小于IOym (微米)，最優選0.5至5 μ m,以最有效的輸送到遠側的肺。
[0075]氣霧劑輸送的目標是顯著增加治療性藥劑例如干擾素包括IFN- Y向人深肺的輸送。一個特別優選的慢呼吸和深吸氣的方法與標準(潮式呼吸)相比可以增加肺外周的沉積效率，直至大約50倍。
[0076]與潮式呼吸(圖1)相比，使用慢速深吸氣方法的特定呼吸模式顯示出吸氣流降低，吸氣時間大幅延長。這種模式示于圖2。慢吸氣允許氣霧劑顆粒繞過上氣道從而使他們可在肺部沉積。延長的吸氣時間可使氣霧劑在肺外周合適的沉淀下來。延長的吸氣時間和更好的沉淀在剩余顆粒被呼出之前促進“吸氣沉積”。在這種情形下，可能有接近100%的吸入顆粒在呼出前沉積下來。這個過程可通過使用相對較大的顆粒(例如大約4.5μπι)而進一步加強，所述大顆粒通常會在口咽處沉積。慢速深呼吸的延長的吸氣特別適合輸送藥物到病人的肺部:他們的外周氣道病理學導致常規的小氣霧劑沉積減少以及避免口咽沉積。可通過這種方法治療的肺外周疾病包括例如特發性肺纖維變性和肺氣腫。這兩種實體均導致氣室增大，從而導致潮式呼吸中最小限度的沉積。
[0077]這種吸氣和沉積的技術可以加強藥物的外周輸送，目的是通過肺毛細血管促進全身性吸收進入全身循環。圖3代表了一個人類個體中的沉積模式，其以慢速深呼吸模式吸入4.5μπι的氣霧劑。圖像表明氣霧劑在上氣道的最小限度(小于10%)的沉積，以胃中少量的活性闡明。沉積圖像代表了放射性標記的氣霧劑沉積在以慢速深模式(吸氣時間大約8秒)呼吸3次后的人類個體肺外周。圖4是同一個體以潮式呼吸20次吸入1.5 μ m顆粒(現行標準吸入模式)的說明性掃描。圖像分析表明包含使用大顆粒、慢吸氣和延長吸氣時間的慢速深呼吸方法的每次呼吸在肺中氣霧劑顆粒的沉積效率高51倍。
`[0078]生產可以實現慢速深度操作的設備是復雜的，但可以實現這一功能的設備原型正在研制并已經應用(Profile Therapeutics Inc., 28State Street, Ste.1100, Boston,MA02109,為總部在英國的Profile Therapeutics的子公司)。
[0079]肺薄壁組織疾病導致肺外周的幾何變化，會使吸入顆粒物的沉積最小化。與全身性輸送相同藥物相比，直接將治療劑輸送到病變位置(肺外周)更加有效。慢速深度吸入干擾素例如IFN-Y氣霧劑的方法特別適用于治療肺纖維化患者肺泡中的疾病。
[0080]人類沉積研究表明，慢速深度吸氣方法大約比氣霧劑輸送的常規系統效率高50倍。這種呼吸模式允許臨床試驗設計為測試氣霧劑治療肺病的效力，所述肺病例如是阻塞性肺病，包括例如特發性肺纖維變性或哮喘，所述治療通過使用一種藥劑例如干擾素包括例如IFN-Y的已有制劑以寬范圍的劑量將這種藥劑運用至肺外周。肺部沉積的數量可通過呼吸模式控制，因為事實上沒有氣霧劑被呼出。
[0081]鼻部輸送
[0082]鼻部輸送蛋白同時亦是一個考慮。鼻部輸送可在鼻部施以治療產品后使蛋白直接進入血流，沒有必要使產品在肺部沉積。適合鼻部輸送的制劑包括那些帶有葡聚糖或環狀糊精的制劑。
[0083]劑量
[0084]應該了解，隨著進一步研究的展開，關于治療各種患者中各種病變的合適的劑量水平的信息將會出現，本領域技術人員考慮受體的治療情況、年齡和一般健康狀況之后，可以決定合適的劑量。大體上，注射或者輸注的干擾素-Y劑量為250 yg生物活性蛋白(只計算蛋白本身質量，不算化學修飾)至750 yg (同上計算)，每周三次。更優選地，劑量可以是500 μ g，每周三次。大體上，注射或者輸注干擾素-α劑量是250-750微克，每周施用I至5次，優選地大約500微克每周施用三次。對于干擾素-β，劑量大體上是0.10至lmg，每周I至3次，優選地是大約0.25mg，每周三次。劑量可變，依賴于蛋白的循環半衰期，以及所用的制劑。
[0085]同其它化合物一起施用
[0086]在本發明的另一個方面，可將干擾素和一或多種用于治療肺病的藥物組合物聯合施用。并且，抗炎劑或免疫抑制劑可共同施用，例如環磷酰胺、硫唑嘌呤或皮質類固醇。施藥可同時或連續進行。
[0087]有研究表明，皮下施用250yg IFN-Y三天后，并沒有IFN-Y的BAL水平增高或者肺泡巨噬細胞的改變，然而外周血單核細胞出現上調(Jaffe et al.(1991) J.Clin.1nvest.88:297-302)。而且，氣霧劑IFN-Y已經被用作肺結核患者的輔助治療。
[0088]在以下描述的研究中，對常規免疫抑制治療無反應的IPF患者用氣霧劑化IFN- Y治療。
[0089]本發明可通過參考以下實 施例更好的理解，實施例的目的是作為本發明的示例而不是限制本發明。
實施例
[0090]以下列出的實施例是為本領域技術人員提供如何制備和使用本發明的治療方法、化合物和藥物組合物的完整揭示和描述，不是為了限制發明人所認為的發明范圍。所用數字(例如數量、溫度等)已經盡力確保是精確的，但需要考慮一些實驗錯誤和偏差。除非另有指出，份數是重量份數，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是等于或接近大氣壓。
[0091]實施例1
[0092]病人群體
[0093]研究主體是患特發性肺纖維變性(IPF)的病人,根據American Thoracic Society標準A或B (如下)診斷。病人群體對用皮質類固醇、環磷酰胺和/或硫唑嘌呤進行的常規治療無反應或者不是這些常規治療的候選。病人群體用氣霧劑化IFN-Y治療12周。
[0094]確定手術活組織檢查表現ΠΡ，這三個條件必須滿足:
[0095]1.其它導致間質性肺病的已知原因被排除，例如某些藥物毒性、環境暴露和結締組織疾病。
[0096]2.肺功能測試異常，包括限制性(肺活量降低，經常伴隨Fevl/FVC比率升高)和/或受損的氣體交換(O2的肺泡-動脈梯度升高或CO的彌散量降低)。
[0097]3.雙側基部網狀異常伴隨最小限度的HRCT掃描磨玻璃混濁。
[0098]在沒有肺手術活組織檢查的情況下，在免疫活性成人中，可以假設診斷為IPFjn果:
[0099]I.以上三個標準都滿足。
[0100]II.經支氣管肺活檢(TBBx)或支氣管肺泡灌洗(BAL)表明無其它特征支持另外的診斷。
[0101]III.以下4個次要標準的其中3個
[0102]1.年齡 >50
[0103]2.無法解釋的運動性呼吸困難的起病隱襲
[0104]3.患病持續時間〉三個月
[0105]4.雙側基部吸氣性捻發音。
[0106]改善定義為(I)與類固醇治療前獲得的FVC相比，FVC預測值比基準值增加10%。
(2)盡管接受治療，病人的FVC比基準值增加多于10%然后回復至基準值。
[0107]適合本研究的病人如下定義:
[0108](I)按照可接受標準(參上)篩選三年內確診為IPF的病人；
[0109]⑵年齡2O-7O;
[0110](3)強的松試驗(有或無環磷酰胺/硫唑嘌呤)失敗或禁忌接受類固醇或細胞毒素劑治療的病人；
[0111](4)開始研究前接受0_15mg強的松或等價物28天而且愿意保持同樣劑量皮質類固醇的病人；
[0112](5)篩選時FVC大于或等于50%并小于或等于90%的預測基準值；
[0113](6)在室內休息狀態Pa02>60mm Hg;
[0114](7)病人能夠理解并同意簽署書面授權同意書并同意遵守所有研究中包含的步驟的要求；
[0115](8)病人符合科研性支氣管鏡檢要求并愿意接受相關程序；
[0116](9)病人能夠每周三次到Bellevue醫院的GCRC部接受藥物治療。
[0117]不適合接受本研究的病人定義如下:(I)病人不愿意或不能夠接受科研性支氣管鏡檢；(2)已知患有哮喘或嚴重COPD的病人；(3)需要接受氧氣治療以維持足夠的動脈充氧的病人；(4)對研究藥物治療或其它組成的藥物治療高反應性的病人；(5)已知患嚴重心臟病、嚴重外周血管病或癲癇病，可能因接受研究藥物治療(按照包裝說明書禁忌接受藥物治療)而加劇的病人；(6)懷孕或哺乳期婦女。育齡婦女需要妊娠試驗呈陰性并需要采取可接受的避孕方式(研究持續期間節欲是最優選的方法)；(7)有證據表明治療前一周內受到活性感染；(8)除IPF以外的任何可導致病人進入研究后I年內死亡的病癥；(9)異常血清實驗值，包括:Ca)肝功能超過特定限制:篩選時，總膽紅素大于正常上限1.5倍；丙氨酸轉氨酶大于正常上限3倍；堿性磷酸酶大于正常上限3倍；白蛋白小于3.0:(b)CBC在特定限制以外:WBC小于2500/mm3 ;血細胞比容小于30或大于59 ;血小板小于100000/mm3 ; (c)篩選時肌酸肝大于正常上限1.5倍；(10)過去六周內接受肺纖維化藥物治療，不包括皮質類固醇、環磷酰胺和/或硫唑嘌呤；(11)以往任何種類的干擾素藥物治療；(12)過去28天內用于任何指征的調查性治療。
[0118]實施例2
[0119]最初，從IPF登記處招入10個病人進入氣霧劑化干擾素-Y的標簽公開的初步研究中。這10個病人滿足適合和排除標準。收集的數據包括過去病歷，包括身高、體重和生命指征；個人過往的所有藥物史及完整的職業和吸煙歷史，體檢，EKG, CBC,電解質檢驗，肝酶和凝血譜，CXR,胸CT，PFT, ABG及孕期婦女妊娠測試。
[0120]每個病人在研究開始時完成一份肺纖維化調杳問卷，詳細詢問病人一生對煙草、環境的暴露及藥物使用情況。每個病人還會完成一份癥狀調查問卷以確定對IFN-Y的耐受性及可能的副作用。
[0121]病人會接受基準支氣管肺泡灌洗(BAL)的支氣管鏡檢來評估某些促纖維化和炎癥細胞因子的水平。步驟如下:
[0122]每個病人按照Bellevue Hospital Protocol接受支氣管鏡檢。每個檢查包括Hgb、血小板、BUN/CR、凝血檢驗、ABG (P02大于等于75mm Hg)、EKG、CXR。支氣管鏡檢禁忌包括病人不合作、近期心肌梗塞、惡性心律失常、不可矯正的低氧血癥、不穩定的支氣管哮喘、肺性高血壓、部分氣管阻塞或聲帶麻痹、出血素質及尿毒癥。病人在支氣管鏡檢前至少8小時必須ΝΡ0。設立靜脈線，實施補充供氧和持續的脈搏血氧測定及血壓監測。
[0123]病人IM前驅用藥60mg的可待因，粘性利多卡因會被應用到鼻部，使用利多卡因漱口及噴霧器(局部麻醉支氣管鏡檢)。在步驟進行中，會施用咪達唑侖和/或嗎啡以使鎮靜及減少咳嗽反射。這些藥物是支氣管鏡檢中常規應用的。支氣管鏡檢經過鼻部和聲帶，并進行支氣管內檢測。然后施用50ml分裝的無菌生理鹽水進行BAL，共300ml，緩吸以實現最大回流。
[0124]從病人獲得BAL液后，以處理所有BAL標準化步驟在GCRC中心實驗室處理。BAL液經無菌紗布過濾。用血細胞計數器進行分類總細`胞計數。以臺盼藍方法確定細胞存活。每葉BAL液制備20個細胞離心載玻片，貯存于_70°C。24小時以IO6細胞/ml的濃度收集上清液，進行細胞因子ELISA檢測。上皮細胞襯液的體積通過蛋白質方法測定。離心后，BAL液上清使用AMICON過濾方法濃縮10-50倍。細胞因子測試用商售試劑盒(R&D Systems,Minneapolis, MN)進行。所有樣品重復三次,細胞因子的量在測試最后由微量滴定板讀數器定量。按照前述方法(Raghu et al.(1989) Am.Rev.Resp.Dis.140:95-100)處理經支氣管活組織樣品以分離成纖維細胞，然后通過將3H脯氨酸摻入膠原蛋白來分析膠原產生。在GCRC中的程序結束后由臨床護士觀測4小時每個病人可能的支氣管鏡檢副作用，包括但不限于發燒、呼吸短促、咯血、氣胸。記錄合并用藥情況于病人的病歷中。
[0125]每個病人保持他們穩定的皮質類固醇或免疫抑制劑的劑量。當病人還在進行本研究時不允許進行調查性治療。臨床前大鼠研究已經表明，胃腸外IFN-Y降低了肝微粒體細胞色素P450的濃度。這可能導致已知利用這個降解途徑的藥物的代謝降低。如果一個病人正在接受任何已知的由這個途徑代謝的藥物，則需要實行合適的監控程序。
[0126]IFN-Y通過手持噴霧器施用，每周3次持續12周。在每種劑量施用前，會由施藥的醫生進行檢查。進行峰流量測量，三次中的最好結果記錄為治療前值。以常規方式準備Aeroeclipse或AerotechII噴霧器,在噴霧器中放入500 μ g的藥物。治療通過壓縮空氣(墻式或可移動式)進行，同時病人坐于固定位置，戴鼻夾，正常呼吸。治療最后，再次由進行研究的醫生對病人進行檢查并在病房觀察I個小時。施藥I個小時后，測量并記錄峰流量讀數。第一次氣霧劑治療后，每個病人需要在病房多停留4小時，再次進行肺檢查和峰流量測量。在施用IFN-Y的過程中對每個病人進行副作用監測，包括但不限于發燒、疲勞、GI異常、頭痛、咳嗽、呼吸短促、氣喘和化驗異常。
[0127]毒性以“普通毒性標準(The Common Toxicity Criteria)”定級。劑量調整相應進行。對于I級毒性，病人可根據醫生的判斷繼續治療。對于II級毒性(根據立即重復的異常實驗參數證實)，停止病人劑量直至回復小于或等于I級毒性，這時可恢復治療。如果II級或更嚴重毒性出現，病人將撤出研究。對于III級或IV級毒性，病人撤出研究。異常實驗參數需要確認。
[0128]實施例3
[0129]臨床功效
[0130]一個38歲具有慢性過敏史的海地婦女表現為I年半的進行性漸強的呼吸短促和運動性呼吸困難。這個病人的PFT表現為低彌散量為主導性的限制模式，疑似間質性肺病。她進行了胸部CT掃描，證實了她的PFT結果，顯示為胸膜下纖維化和蜂窩變化，主要在肺基部。開肺活檢表明與UIP/IPF—致的模式。
[0131]病人開始接受氣霧劑化IFN-Y。她報告呼吸困難減輕并能夠恢復工作。她已經保持三年臨床穩定(參見表1)。客觀發現列于表2。運動表現方面有改善,表現為最大耗氧量增加、每分鐘通氣量減少及氧氣去飽和度降低。她的呼吸困難分值降低(UCSD S0BQ)。她的肺功能測試在氣霧劑治療期間保持穩定。沉積圖像如圖5所示，代表54yg的IFN-Y在肺薄壁組織沉積。圖6顯示氣霧劑治療前后，從BAL測量的TGF-β水平。TGF-β的活性有顯著降低，與IFN-Y氣霧劑的效果一致。
[0132]表1治療前后PFT結果
【權利要求】
1.干擾素Y在制備用于在患有肺部疾病的個體中治療肺部疾病的氣霧劑化藥物的用途，其中所述干擾素Y能以有效治療量沉積在患有肺部疾病個體的肺外周。
2.權利要求1的用途，其中所述肺部疾病是阻塞性肺病。
3.權利要求1的用途，其中所述肺部疾病是特發性肺纖維變性。
4.治療患有肺部疾病患者的藥物組合物，包括適用吸入的載體中0.1至25mg/ml的干擾素Y。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述干擾素Y作為粉末在表面活性劑幫助下懸浮在推進劑中。
6.權利要求4的藥物組合物，其中所述推進劑選自由氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴和烴組成的群組。
7.一種設備，含有有效治療量的重組干擾素Y并能夠輸送有效治療量的氣霧劑化干擾素Y至肺外周，用于治療患有肺部疾病個體的肺部疾病。
8.權利要求7的設備能夠實現慢速深度呼吸操作。
9.權利要求7的設備基本僅在吸氣過程中輸送干擾素Y至肺部。
10.權利要求7的設備`，其中所述設備是呼吸驅動式。
【文檔編號】A61P11/00GK103550757SQ201310407122
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2005年9月20日 優先權日:2005年9月20日
【發明者】R·康多斯, G·斯馬爾多內 申請人:紐約大學, 紐約州立大學研究基金會