褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開褪黑素的新用途，填補現有技術空白。褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用、褪黑素在制備治療關節疾病藥物中的應用、褪黑素在制備治療軟骨疾病藥物中的應用。本發明通過引用兩個代表性的促炎細胞因子，包括IL-1β和TNF-α，創建兩種體外關節炎細胞模型，研究確定褪黑素促進間充質干細胞體外成軟骨分化及機制，為進一步將褪黑素用于制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物、制備治療關節疾病藥物以及制備治療疾病藥物奠定了基礎。
【專利說明】褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，具體涉及褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，包括胚胎干細胞、間充質干細胞和多能誘導干細胞，可以進一步分化為各種不同的組織，構成各種復雜的機體器官，已被廣泛地應用于再生醫學與組織工程領域。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在發育、生長、組織器官自體再生、維持體內微環境平衡等方面發揮著重要的作用，由于其具有容易提取、較強的自我更新能力和多向分化能力、較強的免疫抑制效果等特點，已經廣泛應用于再生醫用、基因治療、組織工程、細胞因子替代療法等領域。
[0003]關節軟骨因其特殊無血管結構導致在軟骨受損或疾病后很難進行自身修復，進而容易進一步引發關節炎疾病。在超過50歲以上人群中，關節炎在導致長期殘疾的疾病中僅次于心血管疾病排名第二，關節炎致殘比例在人群中約占2%-6%。根據1994年統計，在美國，關節炎的消耗為5億美元，其中一半以上消耗緣于工作能力喪失。關節炎較其他疾病更易于影響老年患者的行走、上下樓梯和其他下肢功能。因此，關節炎是導致50歲以上人群功能殘疾、造成經濟損失和影響社會發展的主要疾病之一。關節炎包括骨關節炎(OA)及風濕性關節炎(RA)，骨關節炎主要為未及時處理外傷導致骨關節降解或功能喪失；風濕性關節炎是一類異常的滑膜增生和軟骨的破壞自生免疫疾病。盡管這兩類關節炎疾病起因不同，但是在關節炎癥病變中有著相似的破壞性蛋白酶和炎癥介質生成。
[0004]促炎細胞因子，如IL-1 β和TNF-α，主要由巨噬細胞及關節炎與風濕性關節炎病變滑膜成纖維細胞產生，進而引起軟骨的局部炎癥反應。大量研究在軟骨破壞級聯反應中，滑膜組織和滑膜組織液中IL-1 β和TNF-α的濃度上升。同時，TNF-α誘導細胞高表達半胱天冬酶8促進細胞凋亡。此外，IL-1 β和TNF-α抑制軟骨基質合成(如蛋白聚糖和II型膠原)，從而進一步導致軟骨破壞。
[0005]關節炎的炎癥反應能引起細胞內活性氧(ROS)過度生成，ROS是關節疾病發病機理重要調節者，并且能夠降低關節軟骨的基質成分。大量研究表明，在發炎軟骨細胞內的高水平的ROS不僅導致細胞死亡和DNA氧化，同時也能通過激活金屬蛋白激酶(MMPs)破壞軟骨細胞外基質，從而使軟骨損壞更嚴重。
[0006]褪黑素(melatonin，MT)是松果體產生的一種吲哚胺類激素，褪黑激素的生物合成受光周期的制約，在剛出生的嬰兒體內也能檢出很少量的褪黑激素，直到三月齡時分泌量才增加，并呈現較明顯的晝夜節律現象，3~5歲幼兒的夜間褪黑激素分泌量最高，青春期分泌量略有下降，以后隨著年齡增大而逐漸下降，到青春期末反而低于幼兒期。多項研究表明，褪黑素可以促進睡眠，調節免疫作用以及抗衰老抗腫瘤等多項功能。
[0007]褪黑素已 被證明通過減少活性氧保護神經系統且能阻止過氧化氫引起的骨髓間充干細胞凋亡。然而，對于在關節疾病炎癥微環境中，褪黑素促進間充質干細胞成軟骨分化的潛在保護作用及機制的報道非常少。
【發明內容】
[0008]本發明的發明目的在于公開褪黑素的新用途，填補現有技術空白。
[0009]褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用。
[0010]優選的，所述間充質干細胞為滑膜間充質干細胞。
[0011]褪黑素在制備治療關節疾病藥物中的應用。
[0012]所述關節疾病為關節炎癥。[0013]所述關節炎癥包括類風濕關節炎(RA)和骨性關節炎(OA)等。
[0014]褪黑素在制備治療軟骨疾病藥物中的應用。
[0015]所述軟骨疾病為軟骨缺損或軟骨創傷。
[0016]本發明通過引用兩個代表性的促炎細胞因子，包括IL-1 β和TNF-α，創建兩種體外關節炎細胞模型，研究確定褪黑素促進間充質干細胞體外成軟骨分化及機制，為進一步將褪黑素用于制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物、制備治療關節疾病藥物以及制備治療軟骨疾病藥物奠定了基礎。
[0017]本發明的檢測內容包括:(1)流式細胞儀檢測間充質干細胞胞內活性氧(ROS)；
(2)超氧化物歧化酶活性(SOD)檢測；(3)DNA檢測細胞增殖；(4)阿爾新藍(Alcian blue)軟骨基質染色；(5)實時熒光定量RT-PCR在mRNA水平檢測I I型膠原及MMP-1基因表達水平。
[0018]為了證明上述應用的實用性，本發明通過如下技術方案予以證明:
(A)取用滑膜來源的間充質干細胞P4代培養于基礎培養基中，待細胞數量達95%以上換軟骨培養基，培養基中加入10ng/ml IL-1 β或10ng/ml TNF-α模擬體內炎癥微環境，加入或不加入IuM褪黑素設計實驗組，僅軟骨培養基為對照組，隔天更換一次培養基。(B)炎癥微環境下軟骨誘導，檢測間充質干細胞內ROS，SOD活性及細胞增殖；(C)炎癥微環境下軟骨誘導14天，細胞外基質糖胺聚糖染色及I I型膠原與MMP-1基因檢測，驗證褪黑素對間充質干細胞成軟骨分化促進作用。
[0019]具體分析步驟如下:
(1)流式細胞術檢測分析，IL-1β或TNF-α模擬的體內炎癥微環境，褪黑素對間充質干細胞內活性氧影響；
(2)分析IL-Ιβ或TNF-α模擬的體內炎癥微環境中，褪黑素對間充質干細胞內超氧化物歧化酶活性影響；
(3)DNA量檢測分析成軟骨誘導的炎癥微環境中，褪黑素對間充質干細胞增殖影響；
(4)炎癥微環境下成軟骨誘導14天，阿爾新藍進行細胞外基質糖胺聚糖染色，分析褪黑素對間充質干細胞在成軟骨分化影響；
(5)實時熒光定量RT-PCR分析褪黑素對間充質干細胞II型膠原及MMP-1基因表達水平的影響。
[0020]與現有技術相比，本發明的特點為:
本發明公開了褪黑素的新用途，褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用，褪黑素在制備治療關節疾病藥物中的應用以及褪黑素在制備治療軟骨缺損或軟骨創傷藥物中的應用。通過引用兩個代表性的促關節炎證因子，包括IL-1 β和TNF-α，模擬體內炎癥微環境，在人來源的間充質干細胞體外成軟骨分化培養中添加或不添加褪黑素進行比較。結果表明:炎癥微環境中加入褪黑素能不同程度的促進MSCs軟骨分化，減輕炎癥反應，降低胞內ROS及促進軟骨外基質糖胺聚糖及膠原的產生，從而確定了褪黑素可用于制備治療關節炎癥、軟骨缺損、軟骨創傷等臨床有效藥物，特別是制備預防和治療OA和RA等關節疾病的藥物。
[0021]本研究確定褪黑素促進間充質干細胞體外成軟骨分化及機制，為進一步將褪黑素用于制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物、制備治療關節疾病藥物以及制備治療軟骨疾病藥物奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為IL-1 β或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞內活性氧影響；
圖2為IL-Ιβ或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞內超氧化物歧化酶活性影響；
圖3為IL-1 β或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞增殖影響；
圖4為IL-Ιβ或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞體外成軟骨分化外基質阿爾新藍染色分析(標尺:100um)；
圖5為IL-1 β或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞體外成軟骨分化11型膠原表達影響；
圖6為IL-1 β或TNF-α炎 癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞體外成軟骨分化MMP-1表達影響。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。
[0024]實施例1 IL-1 β或TNF-α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞胞內活性氧、SOD活性及細胞增殖的影響
Ρ4代滑膜間充干細胞按3000cell/cm2接種12孔板培養于5% CO2的37°C細胞培養箱，隔天更換一次基礎培養基(a -MEM, 10%FBS, 100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，0.25yg/mL二性霉素B)。待細胞密度達95%后更換為軟骨培養基(DMEM/HIGH GLUCOSE,40 μ g/mL脯氨酸，100 nM地塞米松，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素，0.25 μ g/mL 二性霉素B,0.1 mM L-抗壞血酸，ITS ? Premix, 20 ng/mL TGF-β I)進行成軟骨誘導，加入 10ng/mlIL-1 β或10ng/ml TNF-α模擬體內微環境，加或不加褪黑素作為實驗組，僅軟骨培養基的為對照組，標記為=CTRL (對照組)，IL (IL-Ιβ不加褪黑素)、MT+IL (IL-Ιβ加褪黑素)、TNF (TNF-α不加褪黑素)、MT+TNF (TNF-α加褪黑素)，隔天跟換培養基。
[0025]A.1L-1 β或TNF- α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞胞內ROS影響 細胞內ROS采用2' ,V - 二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)檢測。每組細胞采用10
μ M DCFH-DA 37°C孵育IOmin后，采用BD雙波長激光流式細胞儀進行檢測細胞內的熒光強度，每個樣品收集10000個細胞。
[0026]結果如圖1所示，褪黑素處理組細胞內的活性氧明顯下降，同對照組相比，褪黑素組胞內ROS下調26.6%。同僅有IL-1 β或TNF- α組相比，MT+IL、MT+TNF組ROS分別下調14.5%, 30.3%，可見褪黑素在炎癥環境下有明顯的抗氧化作用。
[0027]B.1L-1 β或TNF- α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞SOD活性影響 實驗組孔板細胞采用0.25%胰酶收集后采用細胞裂解液裂解，12000rpm高速離心后取
上清，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白量。SOD活性采用SOD試劑盒按照說明書檢測，離心上清液與WST溶液混合37° C孵育20min后于450nm檢測吸光值。
[0028]結果如圖2所示，與CTRL組相比，MT組SOD活性提高35.0% ；IL組SOD活性比MT+IL低48.7% ;然而在TNF處理組對SOD活性影響差異性不顯著。
[0029]C.1L-1 β或TNF- α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞增殖影響
使用0.25%胰酶分別收集實驗組孔板細胞。收集細胞采用125 μ g/mL木瓜蛋白酶60°C消化4小時，木瓜蛋白酶溶解于含有10 mM L-半胱氨酸PBE緩沖液(100 mM磷酸，10 mMEDTA, pH 6.5)中。消化的細胞 DNA 量米用 Quant-1T? PicoGreen? dsDNA assay kit 照試劑說明書操作，最后多功能酶標儀檢測讀數。
[0030]結果如圖3所示，間充質干細胞向成軟骨分化過程中IL-1 β對細胞的增殖影響不大，但是與對照組相比，TNF-α組細胞增殖量下降38.7%。然而MT+TNF組同TNF組比較細胞含量提高47.7%，表明褪黑素能逆轉TNF-α抑制間充質干細胞的增殖的作用。
[0031]以上實驗表明，在IL-1 β或TNF-α炎癥微環境中，間充質干細胞內ROS上調；但是當加入褪黑素后，細胞內的ROS得到明顯下調。SOD是細胞內消除氧自由基的重要酶，在IL-1 β炎癥環境下，SOD的活性降低，而補給褪黑素后，SOD活性提高，直接表明褪黑素在炎癥環境下有明顯的抗氧化作用，可將褪黑素用于制備抗炎癥抗氧化藥物。
[0032]實施例2 IL-1 β或TNF- α炎癥微環境中，褪黑素對滑膜間充質干細胞體外成軟骨分化的影響
細胞培養方式同實例1，Ρ4代滑膜間充干細胞按3000 cell/cm2接種12孔板培養于5%CO2的37° C細胞培養箱，待細胞密度達95%后更換為軟骨培養基，加入10ng/ml IL-1 β或10ng/ml TNF-α模擬體內微環境，實驗組標記為:CTRL (對照組)，IL (IL-1 β不加褪黑素)、MT+IL (IL-Ιβ加褪黑素)、TNF (TNF-α不加褪黑素)、MT+TNF (TNF-α加褪黑素)，隔天跟換培養基。[0033]1、成軟骨誘導14天，孔板細胞用4%多聚甲醛固定過夜，PBS清洗后采用1%，
PH = 2.5阿爾新藍(溶于3%乙酸)進行軟骨特殊基質糖胺聚糖染色I小時，PBS洗滌后采用Olympus 1X71顯微鏡光學拍照。
[0034]結果如圖4所示，從圖中可以看出在軟骨誘導環境中，炎癥因子IL-Ιβ或TNF-a對間充質干細胞分泌軟骨特殊基質糖胺聚糖有著明顯抑制效果；當加入褪黑素后，分化細胞周圍糖胺聚糖富集，染色加深，表明能褪黑素能逆轉炎癥因子抑制軟骨基質中糖胺聚糖合成的作用。
[0035]2、對在IL-1 β或TNF-a炎癥微環境中，褪黑素促進間充質干細胞成軟骨分化的分子機制
成軟骨誘導14天后，Trizol法提取總RNA，逆轉錄，用實時熒光定量定量RT-PCR鑒定成軟骨標志基因--II型膠原(COL II)。II膠原是軟骨基質中含量最多的成分，能直接反應細胞成軟骨程度，采用RT-PCR檢測COL II在mRNA水平的表達量，從分子水平解釋褪黑素對間充質干細胞成軟骨的影響。
[0036]結果如圖5所示，從圖中可以看出，在IL-Ιβ或TNF-α炎癥微環境下，COL II的表達量僅依次為對照組的18%，32.5%。然而補給褪黑素后，MT+IL組COL II表達是IL組的
5.2 倍，MT+TNF 組是 TNF 的 3.0 倍。
[0037]3、對在IL-Ιβ或TNF-a炎癥微環境中，褪黑素保護軟骨外基質降解的分子機制 為探究分子水平褪黑素對軟骨細胞外基質降解影響機制，金屬蛋白酶I用實時熒光定
量定量RT-PCR。MMP-1又名間質膠原酶，可以直接降解軟骨基質中最具特征、含量也最多的II型膠原，而且其他許多MMPs亞型對II型膠原的降解需要通過MMP-1起作用。因此MMP-1的變化最能反映出軟骨基質中II型膠原的代謝變化。
[0038]結果如圖6所示，從圖中可以看出，IL-1β組，MMP-1表達量是對照組的19.7倍；加入褪黑素后，MT+IL組MMP-1表達量比IL組下降20.2%，褪黑素的引入能明顯降低MMP-1表達，避免軟骨基質的降解。
[0039]軟骨特殊基質糖胺聚糖染色II型膠原及金屬蛋白酶I基因檢測表明，在IL-1 β或TNF-a炎癥微環境中，引入褪黑素能促進間充質干細胞成軟骨分化，促進軟骨外基質的合成，金屬蛋白酶的合成減少。
[0040]綜上實驗表明，褪黑素可用于制備良好促進間充質干細胞成軟骨分化藥物，用于制備治療關節炎藥物及用于治療軟骨疾病藥物。
【權利要求】
1.褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述褪黑素在制備促進間充質干細胞成軟骨分化藥物中的應用，其特征在于，所述間充質干細胞為滑膜間充質干細胞。
3.褪黑素在制備治療關節疾病藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述褪黑素在制備治療關節疾病藥物中的應用，其特征在于，所述關節疾病為關節炎癥。
5.根據權利要求4所述褪黑素在制備治療關節疾病藥物中應用，其特征在于，所述關節炎癥包括類風濕關節炎和骨性關節炎。
6.褪黑素在制備治療軟骨疾病藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述褪黑素在制備治療軟骨疾病藥物中的應用，其特征在于，所述軟骨疾病為軟骨缺損或軟骨創傷 。
【文檔編號】A61K31/4045GK103494808SQ201310383987
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2013年8月29日
【發明者】龔逸鴻, 何帆, 劉小珍, 蔣慶 申請人:中山大學