龍血竭在制藥中的用途
【專利摘要】本發明涉及龍血竭在制藥中的新用途，屬于中藥領域。所述用途為龍血竭在制備促進神經干細胞增殖、分化和促進成體海馬神經細胞分化的藥物中的用途；以及龍血竭在制備預防或治療抑郁癥的藥物中的用途。為了實現所述用途，龍血竭可經胃腸道或不經胃腸道途徑施用，采用口服、皮下、肌肉內、靜脈內、透皮、鼻內或直腸內給藥。龍血竭與醫學上可接受的藥用輔料制成藥物組合物，可制成各種類型的片劑、膠囊劑、滴丸、軟膠囊、口服溶液、丸劑、散劑、顆粒劑、錠劑、煎膏劑、糖漿劑、流浸膏劑與浸膏劑、注射劑以及臨床上適宜的其它劑型，制劑中含有必要的附加劑，附加劑為填充劑、潤濕劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑或pH調節劑。
【專利說明】龍血竭在制藥中的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及龍血竭在制藥中的新用途，尤其涉及龍血竭在制備促進神經干細胞增殖、分化和成體海馬神經細胞分化的藥物中的用途，以及在制備預防或治療抑郁癥的藥物中的用途，屬于中藥領域。
【背景技術】
[0002]抑郁癥是指一種強烈的悲傷、憂郁或絕望的狀態，伴隨著興趣缺乏、睡眠紊亂、食欲和性欲減退、自我評價過低、內疚和認知障礙，嚴重者可出現自殺念頭和行為。多數病例有反復發作的傾向，每次發作大多數可以緩解，部分可有殘留癥狀或轉為慢性。隨著人們生活節奏加快，競爭壓力加大，其發病率日益增加，據世界衛生組織推測截止到2020年抑郁癥將成為導致勞動能力喪失和新生兒死亡的主要原因之一。抑郁癥輕則影響工作和學習，重則使病人喪失勞動能力，直至發生自殺等惡性事件。目前，抑郁癥的發病機理尚未完全闡明，主要觀點認為是腦內單胺類神經遞質代謝失常。
[0003]目前抑郁癥的治療主要 依靠藥物，主要有單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁藥、選擇性去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑、選擇性五羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑、NE能和5-HT能抗抑郁劑等，使用抗抑郁藥并不能改善抑郁癥患者的所有癥狀，且只對70%?80%的患者有效，抑郁癥的治療往往需要給藥2?6周后才能顯示臨床療效。一般認為抗抑郁藥物是通過調節中樞神經遞質來治療抑郁癥的，但是經典的中樞神經遞質假說卻不能解釋抗抑郁藥物的治療延遲現象。許多研究證明，抑郁癥可能由于成熟海馬神經元再生下降從而引起海馬結構可塑性改變導致，抗抑郁藥可以是通過保護海馬細胞神經元細胞受損、促進海馬前體細胞的增殖以達到抗抑郁效應，這從細胞水平詮釋了抑郁癥的發病機制。因此，各種應激因素引起海馬神經元再生降低可能是抑郁癥的一個重要特征。
[0004]神經發生包括神經干細胞的增殖、遷移和分化等過程。研究發現，神經發生不僅存在于胚胎期，也持續存在于成年哺乳動物成長期，成年哺乳動物的神經發生主要在前腦的兩個高密度的細胞分化區，即海馬結構齒狀回的顆粒下層(SGZ)和側腦室的室管膜下區(SVZ)o神經元分為主神經元和非主神經元,主神經元在海馬是錐體細胞,在齒狀回是顆粒細胞。當海馬發生神經發生時，祖細胞在海馬齒狀回的顆粒細胞下層生成，新生的細胞移行一段距離至顆粒細胞層，分化成顆粒細胞，成熟的神經元在分子層及多形層產生樹突、軸突，形成突觸聯系，成為新的神經元，最終整合至海馬功能的神經環路中，參與海馬的各種功能活動，但是海馬齒狀回神經干細胞的增殖隨年齡增長而減少。另外，體育鍛煉以及豐富的學習環境等因素可以增加新生神經元的數量，但壓力和抑郁等情況就會抑制新生神經元的生長。海馬是大腦中的重要腦區，不僅與陳述性記憶有關，而且還涉及認知功能和位置導航，特別CA3區被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系尤為密切。正因為成年海馬齒狀回存在神經發生，新生的神經元成熟后可以參與海馬結構的學習和記憶，使得促神經發生的研究對治療抑郁癥具有十分重要的意義。
[0005]龍血竭為劍葉龍血樹(Dracaena cochinchinensis S.C.Chen)的紅色樹脂,是一味名貴藥材，至今已有1500多年的藥用歷史。龍血竭的主要化學成分為揮發油、黃酮、酚類、強心苷以及多糖等。大量的藥理研究表明，龍血竭具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗血小板聚集等多種生物活性。目前有關于龍血竭的功能主治主要包括活血化瘀、消炎止痛、生肌斂瘡以及降血糖等，在治療缺血性心臟病、血瘀證、出血性疾病、外傷出血、婦科出血和糖尿病等方面有很好的療效。但目前尚無龍血竭在促進神經系統發育方面及其作為促進神經干細胞增殖、分化以及成體海馬神經細胞分化的藥物用途，以及作為預防和治療抑郁癥方面的藥物的相關報道。
【發明內容】
[0006]針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種龍血竭在制藥中的新用途。
[0007]實際上，本發明目的之一在于提供一種龍血竭在制備促進神經干細胞增殖、促進神經干細胞分化和促進成體海馬神經細胞分化的藥物中的用途；本發明目的之二在于提供一種龍血竭在制備預防或治療抑郁癥的藥物中的用途。
[0008]所述龍血竭為是指龍血竭原料藥，可以從劍葉龍血樹(Dracaenacochinchinensis
S.C.Chen)的紅色樹脂龍血竭中獲得，使用任何本領域中熟知的技術生產，可由市售購得。
[0009]所述龍血竭可用于使其發揮作用的各種給藥途徑，包括經胃腸道或不經胃腸道途徑施用。例如可用于口服、皮下、肌肉內、靜脈內、透皮、鼻內、直腸內等方式施用。制藥領域的普通技術人員可以根據針對疾病狀況所選的龍血竭的特性、疾病的狀態和其他相關情況，選擇施用的適當形式和方式。
[0010]所述龍血竭可以單獨或與可藥用載體或賦形劑組合的藥物組合形式施用，它們的比例和特性由其溶解性和化學 特性、所選的給藥途徑和標準的制藥實際來決定。
[0011]所述的藥物組合物包含所述龍血竭和藥學上可接受的輔料，所述藥學上可接受的輔料含有必要的附加劑，選自填充劑、潤濕劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑或pH調節劑其中的一種或幾種的組合。所述的藥物組合物可制成片劑、膠囊劑、滴丸、軟膠囊和口服溶液等。(一)片劑中含有必要的填充劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑，填充劑可選自淀粉、糊精、糖粉、乳糖、氧化鎂、碳酸鎂或甘露醇等其中的一種或幾種的組合，粘合劑為水、乙醇、淀粉漿、糖漿或纖維素衍生物等，崩解劑常用的有干燥淀粉、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基纖維素等，潤滑劑常用的有硬脂酸鎂、滑石粉、硬脂酸、硼酸和苯甲酸鈉等；片劑中龍血竭和輔料(即填充劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑)的質量比為2:8?8:2 ;片劑制備首先選用處方量的龍血竭和附加劑，混合均勻后制軟材，過篩制粒，壓片。(二)膠囊劑制備是將所述龍血竭粉碎成為細粉，干燥混勻后直接填充或加入一定填充輔料制成顆粒后填充。填充輔料包括稀釋劑、潤滑劑和崩解劑等，一般可選蔗糖、乳糖、微晶纖維素、改性淀粉、二氧化硅、硬脂酸鎂、滑石粉等。(三)滴丸的制備采用滴制法，將所述龍血竭與基質混勻加熱溶化后，或者將龍血竭加入溶劑溶解后與基質混勻加熱溶化后，滴入不相混溶的冷卻液中，收縮冷凝成丸。其中龍血竭與基質的質量比為1:9?4:6。其中常用基質選自聚乙二醇4000(或6000)、硬脂酸鈉、甘油明膠、蜂蠟、硬脂酸、單硬脂酸甘油脂、淀粉、木糖醇及植物油等。(四)軟膠囊劑是將所述龍血竭溶解、混懸或乳化在溶劑中，使其成為均勻一致的溶液后作為內容物填充在膠囊中，或者采用壓制法制備；軟膠囊的囊材組成主要是:膠料(一般為明膠、阿拉伯膠)、增塑劑(常用甘油、山梨醇)、附加劑(對羥基苯甲酸甲酯、色素等)及水；軟膠囊中龍血竭所占的質量百分數為20 %?60 %。(五)口服溶液是將所述龍血竭的水溶液濃縮成適量濃度后，加入矯味劑、防腐劑等附加劑，攪勻后，經過過濾、滅菌、灌裝即得。制成的制劑每日服用劑量為0.1g?10g，每日服用次數為I?5次。
[0012]目前，尚未見本發明所述龍血竭的毒性相關報道，所述龍血竭可以長期服用用于預防或治療給藥。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1中實驗組和對照組中神經干細胞球平均直徑比較數據曲線。
[0014]圖2為實施例1中實驗組和對照組中神經干細胞球分化比較圖。
[0015]圖3為實施例1中實驗組和對照組中神經干細胞中NGF和BDNF的表達量變化比較。
[0016]圖4為實施例2中短期實驗組和短期對照組中大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況比較圖。
[0017]圖5為實施例2中長期實驗組和長期對照組中大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況比較圖。
[0018]圖6為實施例3中短期實驗組和短期對照組中大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況比較。
.[0019]圖7為實施例3中長期實驗組和長期對照組中大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況比較圖。
[0020]圖8為實施例4中正常對照組、模型組和實驗組中大鼠海馬齒狀回區神經細胞再生情況比較圖。
【具體實施方式】
[0021]為了充分說明本發明的特性以及實施本發明的方式，下面給出實施例。
[0022]以下所有實施例中龍血竭均為云南西雙版納雨林制藥有限責任公司生產，批準文號:國藥準字Z53021662。
[0023]實施例1龍血竭具有誘導神經干細胞增殖、分化的作用
[0024]神經干細胞是神經系統形成和發育的源泉，它可以分化成神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞，因此，本實施例研究龍血竭對神經干細胞增殖、分化的影響。
[0025]實驗材料
[0026]DMEM/F12培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；EGF(上皮生長因子)、bFGF(成纖維細胞生長因子)、B27(無血清培養基添加因子)購自美國invitrogen公司；青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自北京拜爾迪公司；胰蛋白酶購自美國Promega公司；神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)抗體購自美國Cell signaling公司；其他常規試劑購自北京化學試劑公司。
[0027]實驗方法
[0028]選取SD (Sprague-Dawley)大鼠的神經干細胞(neural stem cell, NSCs)為實驗對象，考察低濃度龍血竭對NSCs增殖、分化的影響。[0029]NSCs的獲取方法如下:將新生I天的SD大鼠的乳鼠埋入冰中冷凍至身體僵硬后進行解剖，分離海馬組織，剝離血管后放入預冷(4°C)的D-Hank’ s溶液中，所述D-Hank’ s溶液配方如下:每升三蒸水中含有氯化鈉Sg、磷酸二氫鈉0.102g、氯化鉀0.4g、磷酸二氫鉀
0.06g和碳酸氫鈉0.35g ;所述海馬組織用D-Hank’s溶液洗2次，用彎頭眼科手術剪將所述海馬組織剪成直徑約Imm的小塊，用胰蛋白酶在37°C消化5分鐘，用含有質量濃度10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化并使用移液槍輕吹，制成細胞懸液；所述細胞懸液經400目篩網過濾后，在3000轉離心3分鐘，去除含胰蛋白酶的上清液，加入NSCs培養基重懸細胞，所述NSCs培養基配方如下:每500ml的DMEM/F12培養基中含有10 μ g的EGF、10 μ g的bFGF、質量濃度2%的B27、500U的青霉素鈉和500U的硫酸鏈霉素，然后將重懸后的細胞種入直徑90mm培養皿中(細胞密度為2.5 X IO5個/mL，2mL),置于細胞培養箱(37°C，體積濃度5%C02)中培養，每3?4天半量換液一次，7天傳代一次，獲得到實驗用NSCs。
[0030]使用少量40%乙醇(體積濃度)溶解龍血竭制成龍血竭溶液,將所述龍血竭溶液加入NSCs培養液中，使龍血竭在培養液中的終濃度為20ng/mL。用所述含有龍血竭的培養液處理NSCs作為實驗組，檢測龍血竭對NSCs增殖、分化的影響、以及對神經生長因子(NGF )和腦源性神經營養因子(BDNF)表達的影響。并以相同試驗條件下，將與所述龍血竭溶液相同體積量的40%乙醇(體積濃度)加入NSCs培養液中，用所述含有乙醇的培養液處理NSCs作為對照組。
[0031]實驗結果與分析
[0032](I)龍血竭促進NSCs的增殖:在20ng/mL龍血竭條件下，實驗組細胞NSCs的存活率為98.2±7.1%，對照組細胞NSCs的存活率為100±4.3%，相比無顯著差別，因此可用20ng/mL的龍血竭對NSCs進行長期誘導培養。NSCs在誘導培養過程中會不斷分裂增殖，聚集形成懸浮的神經干細胞球，隨著細胞增殖，神經干細胞球的直徑會不斷的變大，通過測量神經干細胞球的直徑研究NSCs的增殖情況。在加入龍血竭誘導培養的第0、24、48、72、96、120和144小時，分別使用倒置熒光顯微鏡對神經干細胞球進行觀察和拍照，測量神經干細胞球平均直徑的變化，結果顯示，自48h后，在相同的培養時間點，實驗組的神經干細胞球的平均直徑顯著大于對照組的神經干細胞球的平均直徑，如圖1所示，說明龍血竭能
對NSCs的增殖發揮一定的增強作用。(±SD為平均值土標準差，P值是顯著性分析，經
單因素方差分析得到，下同)。
[0033](2)龍血竭促進NSCs的分化:NSCs分化的特征是不再懸浮生長，而是固定在培養皿表面，貼壁呈放射狀廣泛生長，神經干細胞球中伸出了一些類似“觸角”狀的細胞絲，即神經干細胞分化后的突觸。如圖2所示，實驗組的神經干細胞球發生分化的細胞數量，以及神經干細胞分化的程度都要遠遠高于對照組。圖2中A、B、C和D依次為在24、48、72和96小時，實驗組中神經干細胞在倒置熒光顯微鏡(Olympus 1X71)下100倍的圖片；E、F、G和H依次為在24、48、72和96小時，對照組中神經干細胞在倒置熒光顯微鏡下100倍的圖片。
[0034](3)龍血竭增加NGF和BDNF的表達:NGF具有支持多種神經元發育、存活、調節神經表型、促進其生長、分化及維持其功能的作用，在神經元發育、軸突生長、遞質合成以及細胞凋亡中均起著重要作用。NGF可以促進發育中的交感/感覺神經元的分化和成熟，維持成熟的交感神經元的正常功能。同時它還可以調節神經元之間的連接，穩定突觸接觸，防止突觸可塑性變化。NGF對中樞和周圍神經的損傷也具有保護和恢復的作用，能促進神經細胞的再生。BNDF能促進感覺神經元的存活和突起生長，刺激神經元軸突分支生長并進入中樞靶位，增強突觸間遞質的釋放，加強突觸聯系。BNDF能誘導NSCs、神經元胚胎細胞分化，分化為多巴胺能神經元等，同時還可以促進神經元生長、發育，促進神經元修復和再生。實驗組處理96h后的NSCs內NGF和BDNF的表達量都極顯著高于對照組，龍血竭增加神經干細胞中NGF和BDNF的表達量(圖3)。
[0035]上述實驗結果顯示，龍血竭能夠促進體外神經干細胞增殖，促進神經干細胞分化為神經元和神經膠質細胞，提高神經生長因子和腦源性神經營養因子表達量。
[0036]實施例2龍血竭促進大鼠海馬神經細胞的生長遷移
[0037]海馬齒狀回(DG)是大腦中一個在動物成年后仍存在神經發生的特殊區域，其神經發生包括神經增殖、存活和分化三方面，所述神經發生過程受到腦內信號的調控和神經發生環境的各種細胞因子的影響。DG的神經干細胞位于顆粒細胞層(GCL)內側靠近門區的一個狹長板層，又稱為亞顆粒細胞層(SGL)。DG神經發生時，新生的祖細胞在海馬齒狀回的顆粒細胞下層生成，生長遷移至顆粒細胞層，分化成顆粒細胞，成熟的神經元在分子層及多形層產生樹突、軸突，形成突觸聯系，成為新的神經元，最終整合至海馬功能的神經環路中，參與海馬的各種功能活動。本實施例在大鼠腦中觀察龍血竭對海馬神經細胞的生長遷移的影響。
[0038]實驗材料
[0039]神經前體細胞標志物Doublecortin (DCX)抗體購自美國Santa公司；其他常規試劑購自北京化學試劑公司。
[0040]實驗方法
[0041]本實驗選用SD大鼠24只，隨機分為短期實驗組、短期對照組、長期實驗組和長期對照組4組。短期(14天)/長期(28天)實驗組分別在SD大鼠飼料里添加龍血竭，龍血竭給藥量為2g/kg體重/日，短期(14天)/長期(28天)對照組SD大鼠給予未添加龍血竭的SD大鼠飼料，短期/長期實驗組給藥完成后，與對應對照組別的SD大鼠同時給以戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，取腦，冰凍切片機切片，腦切片收集于0.0lM磷酸鉀鹽緩沖生理鹽水中備用。用免疫組織化學方法通過觀察腦切片中海馬齒狀回區神經前體細胞標志物Doublecortin (DCX)陽性細胞的表達了解新生神經元遷移情況。
[0042]實驗結果與分析
[0043](I)與短期對照組相比，短期實驗組大鼠海馬齒狀回區DCX陽性細胞樹突分叉多，伸展較長、排列整齊，絕大多數伸向海馬齒狀回顆粒細胞層(GCL);而短期對照組大鼠海馬齒狀回區DCX陽性細胞樹突分叉明顯少，伸展較短，伸展部位較少，且較凌亂，海馬齒狀回顆粒細胞層DCX陽性細胞數目較少，如圖4所示，其中，A為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的短期對照組大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況，B為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的短期實驗組大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況。
[0044](2)與長期對照組相比，長期實驗組大鼠海馬齒狀回區DCX陽性細胞樹突分叉較多，伸展的較長、排列整齊，絕大多數伸向GCL;而長期對照組大鼠海馬齒狀回區DCX陽性細胞樹突分叉明顯少，伸展較短，伸展部位較少，且較凌亂，海馬齒狀回顆粒細胞層DCX陽性細胞數目較少，伸向門區的突起數目較多、如圖5所示，其中，A為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的長期對照組大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況，B為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的長期實驗組大鼠海馬齒狀回區新生神經元生長遷移情況。
[0045]與短期實驗組相比，長期實驗組大鼠海馬齒狀回區DCX陽性細胞樹突分叉更為明顯，海馬齒狀回顆粒細胞層DCX陽性細胞數目更多，如圖4和5所示。
[0046]上述實驗結果顯示，龍血竭可促進大部分新生神經細胞分化為成熟神經元，且新生神經元發生了異位遷移，說明短期、長期施用龍血竭對大鼠海馬齒狀回區神經元有促進生長遷移的作用。
[0047]實施例3龍血竭促進大鼠海馬神經細胞增殖
[0048]本實施例用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記大鼠海馬神經細胞的增殖情況，觀察龍血竭對海馬神經細胞增殖的影響。
[0049]實驗材料
[0050]BrdU抗體購自美國Santa公司。其他常規試劑購自北京化學試劑公司。
[0051]實驗方法
[0052]本實驗選用SD大鼠24只，隨機分為短期對照組、短期實驗組、長期對照組和長期實驗組4組。短期(14天)/長期(28天)實驗組分別在SD大鼠飼料里添加龍血竭，龍血竭給藥量為2g/kg體重/日，所述短期實驗組給藥13天時和長期實驗組給藥27天時，給大鼠腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)，用于標記大鼠海馬神經細胞增殖情況，短期(14天)/長期(28天)對照組SD大鼠給予未添加龍血竭的SD大鼠飼料。短期/長期實驗組給藥完成后，與對應對照組別的SD大鼠同時給以戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，取腦，冰凍切片機切片，腦切片收集于0.0lM磷酸鉀鹽緩沖生理鹽水中備用。用免疫組織化學方法通過觀察腦切片中大鼠海馬齒狀回區BrdU陽性細胞的表達了解新生大鼠海馬神經細胞的增殖及存活情況。
[0053]實驗結果與分析
[0054](I)與短期對照組相比，短期實驗組大鼠海馬齒狀回區BrdU陽性細胞數量顯著增力口，如圖6所示，其中，A為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的短期對照組大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況，B為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的短期實驗組大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況，白色箭頭表示新生神經細胞。
[0055](2)與長期對照組相比，長期實驗組大鼠海馬齒狀回區BrdU陽性細胞數量也顯著增加，如圖7所示，其中，A為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的長期對照組大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況，B為在倒置熒光顯微鏡下放大10倍的長期實驗組大鼠海馬齒狀回區神經細胞增殖情況，白色箭頭表示神經細胞。
[0056]上述實驗結果顯示，短期、長期施用龍血竭對大鼠海馬齒狀回區神經細胞具有促增殖、促分化為神經元的作用。
[0057]實施例4龍血竭對抑郁癥大鼠模型的治療作用
[0058]目前研究認為海馬成年神經再生障礙及神經可塑性改變被認為是抑郁癥發病的關鍵環節。鑒于龍血竭具有對 神經干細胞促增殖、分化以及對成體海馬神經細胞的促分化作用，本實施例觀察龍血竭對抑郁模型大鼠的治療效果。
[0059]實驗材料
[0060]同實施例4。其他,NeuN(神經元特異性核蛋白)抗體購自美國Millipore Chemicon公司，DA(多巴胺)、5_HT(五輕色胺)購自美國Sigma公司；色譜柱為Resolve TM C18, 5 u m,
3.9mm X150mm購自美國GRACE公司；高效液相色譜庫倫電化學檢測儀(美國ESA公司)。
[0061]實驗方法
[0062]建立模型:本實驗選用成年SD雄性大鼠30只，先適應性飼養(溫度20_26°C，濕度40-70，正常鼠糧喂養)I周。實驗前用曠場(Open-field)分析實驗對每只大鼠進行行為學評分，選擇各項行為學指標得分相近的大鼠，以消除系統誤差。將實驗動物隨機分為3組:1)正常對照組一不進行應激實驗，正常喂養(同適應性飼養);2)慢性應激抑郁模型組(簡稱模型組)一給予應激刺激實驗，正常喂養，從實驗第I天至結束連續28天；3)實驗組一給予應激刺激實驗，食物給予龍血竭，給藥量為2g/kg體重/日，將龍血竭混在食物中給藥，從實驗第I天至結束連續28天。模型組和實驗組大鼠進行27d慢性不可預見性應激處理，具體處理為:禁水24h，傾斜籠子45度，強迫冰水(4°C )游泳5min，潮濕24h，晝夜顛倒24h。實驗過程中每種刺激至少給予2次，每天隨機給予I種刺激，每次應激處理均在遠離飼養間的另一實驗室進行。
[0063]行為學檢測:實 驗期間，在第7、14、21和28天進行糖水消耗實驗。糖水消耗實驗指在實驗中使大鼠接近清水或含有不同濃度蔗糖的糖水，測量其對每一種水的飲用情況。這個測試經常被用來衡量抑郁樣行為，因為在嚙齒動物中對糖水飲用的降低與其抑郁癥的跡象密切相關。第28天行大鼠曠場分析實驗，該行為學所用敞箱為立方形，高40cm，長、寬80cm，周壁、底面為黑色，底面由面積相等的25塊方形區域組成，用白線劃分。以大鼠穿越底面塊數為水平運動得分，以直立次數為垂直運動得分。第28天進行觀察，每只大鼠測定I次，每次測定時間為3min，計數水平活動和垂直活動得分。曠場分析實驗是評價實驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法。糖水消耗實驗和曠場分析實驗可綜合評價藥物對抑郁模型大鼠行為的治療效果。
[0064]神經生物學指標檢測:在神經細胞的增殖、分化和遷移方面，在所述給藥期的27天時，給大鼠腹腔注射5-溴脫氧尿喃唳核苷(BrdU)50mg/kg,間隔2h,連續兩次。實驗結束后，對相應組別大鼠給以戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉后，取半腦，冰凍切片機切片，腦切片收集于0.0lM磷酸鉀鹽緩沖生理鹽水中備用。用免疫組織化學方法觀察大鼠腦切片中腦海馬齒狀回區BrdU/NeuN陽性細胞的表達，了解新生神經細胞的增殖、分化及存活情況。另外的半腦在冰上分離大腦皮質，所述大腦皮質稱重后加入500 ii L 0.lmol/L的HCIO4，所述HCIO4中含預冷(4°C)的0.3mmoI/L的Na2EDTA和0.05mmoI/L的無水亞硫酸鈉，超聲勻漿，加入60ii L的DHBA (二羥基苯甲酸)0.5mg/L, 12000r/min高速離心20min，取上清，過膜(孔徑
0.22 ii m)，取10 ii L進樣高效液相色譜庫倫電化學檢測儀檢測單胺類神經遞質DA和5-HT含量，觀察大鼠腦皮層單胺類神經遞質的變化。
[0065]實驗結果與分析
[0066](I)龍血竭可以顯著的促進抑郁模型大鼠的蔗糖消耗水平
[0067]在整個實驗期間的第7、14、21和28d，大鼠的糖水消耗水平情況如表I所示，結果顯示:模型組的糖水消耗水平均顯著低于正常對照組(P〈0.05);實驗組在第14d與正常對照組相當，并在之后各時間點穩步增加；與模型組相比，實驗組在第14d呈顯著性增加(P〈0.05)，在第21和28d呈極顯著性增加(P〈0.01)。實驗結果說明龍血竭可以顯著促進抑郁大鼠的糖水消耗水平。[0068]表I各組大鼠糖水消耗量的變化d±SD，n=10)
[0069]
【權利要求】
1.一種龍血竭在制藥中的用途，其特征在于:所述龍血竭在制備促進神經干細胞增殖、促進神經干細胞分化和促進成體海馬神經細胞分化的藥物中的用途。
2.—種龍血竭在制藥中的用途，其特征在于:所述龍血竭在制備預防或治療抑郁癥的藥物中的用途。
3.根據權利要求1或2所述的一種龍血竭在制藥中的用途，其特征在于:龍血竭經胃腸道或不經胃腸道途徑施用，通過口服、皮下、肌肉內、靜脈內、透皮、鼻內或直腸內給藥。
4.根據權利要求1或2所述的一種龍血竭在制藥中的用途，其特征在于:所述龍血竭與醫學上可接受的藥用輔料制成的藥物組合物:片劑、膠囊劑、滴丸、軟膠囊、口服溶液、丸齊U、散劑、顆粒劑、錠劑、煎膏劑、糖漿劑、流浸膏劑與浸膏劑、注射劑以及臨床上適宜的其它劑型。
5.根據權利要求1或2所述的一種龍血竭在制藥中的用途，其特征在于:所述龍血竭與醫學上可接受的藥用輔料制成的制劑中含有必要的附加劑，所述附加劑為填充劑、潤濕劑、粘合劑、崩.解劑、潤滑劑或PH調節劑。
【文檔編號】A61K36/896GK103432359SQ201310379602
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】冉媛媛, 慶宏, 王冉, 賈秋添, 唐博, 李渃敏, 孫珍珍, 徐妍, 鄭達, 劉可夫, 鄧玉林 申請人:北京理工大學