一種放療增敏劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種放療增敏劑及其制備方法，能夠改善實體瘤的放射抗拒問題，本放療增敏劑包括50％-80％的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、5％-8％的HIF-1α-siRNA、12％-45％的透明質酸，其中所述的透明質酸分子量可以為11000、6600、800中任意一種，首先通過乳液溶劑揮發法制備PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒，然后滴加HIF-1α-siRNA，最后用HA進行包裹，制備工藝簡單易行。
【專利說明】一種放療增敏劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種放療增敏劑及其制備方法，尤其涉及一種能夠改善實體瘤的放射抗拒問題的藥物制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]放射治療是惡性腫瘤治療的重要手段之一。影響放療療效的因素很多，如腫瘤細胞對射線的敏感性、細胞周期、腫瘤干細胞的存在等。而在臨床實踐中發現，腫瘤細胞的乏氧是放射抗拒、導致臨床療效欠佳的最主要原因，常規放射劑量不能有效殺死這部分細胞，成為腫瘤復發和轉移的根源。現有的放療增敏藥物不能直接到達乏氧細胞處，即使到達了也很快被清除，在腫瘤細胞處不能維持足夠的濃度和較長的時間，因而療效不顯著。
[0003]中草藥貫葉連翹中最具生物活性的物質金絲桃素是一個疏水的小分子非卟啉壞死親和劑，具有壞死親和性。這種化合物能夠特異性的積聚在壞死區域或者缺血區域。目前，金絲桃素的研究主要是作為壞死親和造影劑。鑒于此，我們利用金絲桃素的壞死親和性，使放療增敏藥物向壞死組織聚集并維持穩定，同時不增加周圍正常組織細胞的放射損傷風險。
[0004]體內遞送SiRNA至靶組織是一個復雜的過程，因為體內遞送的主要目的是向靶細胞內遞送有活性的SiRNA，提高SiRNA的穩定性以適應全身給藥后細胞內外環境的差異是體內遞送過程中最有挑戰性的問題。siRNA載體修飾主要目標是提高體內生物穩定性，基本概念是限制底物與酶的相互作用，通常的做法是對核苷酸進行化學修飾:核苷酸的糖環、堿基和磷酸骨架都可以成為修飾位點。但是，已有的修飾方法對siRNA的穩定性的改進十分有限。故以傳統非病毒載體連接的siRNA還不能滿足臨床安全性和長效性的需要；而化學修飾的siRNA多采用親脂性化學基團或融合蛋白等修飾siRNA，具有某些優點，如提高siRNA的穩定性和RNA干擾活性、能抵抗核酸酶的降解作用、利于被細胞攝取、不具有病毒載體潛在的風險性等，而逐漸弓I起人們的重視。
[0005]透明質酸(HA)是一種在細胞外基質、結締組織和高等動物的器官中廣泛分布的天然蛋白多糖。廣泛存在于細胞外間質，其平均相對分子質量(Mw) —般都大于1Χ106<Χ?44是一種分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質性粘附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的粘附，異質性粘附在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用。CD44可與硫酸軟骨素、纖維素、糖原以及層黏蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白等黏附，但卻是細胞表面最重要的透明質酸受體。CD44作為一種細胞表面的細胞外基質分子，通過與細胞、細胞粘附因子及與細胞因子的相互作用，調控著細胞的多種生物學行為，包括細胞增殖、分化、ECM的分泌和積聚等，在疾病的發生發展過程中起重要的作用。惡性腫瘤細胞與正常細胞相比，CD44與HA表達均明顯上調，HA與⑶44靶向性結合，調節多種生物行為，包括細胞粘附、遷移、增殖、分化以及侵襲轉移等，利用HA與CD44特異性結合的特點可以介導抗腫瘤藥物與惡性腫瘤細胞的特異性結合，并促進藥物在腫瘤細胞內的濃聚和釋放。
[0006]一個理想的放射增敏劑必須具備以下特點:①不易和其他物質起反應、性質穩定；②有效劑量沒有毒性或毒性較低；③易溶于水，便于給藥針對腫瘤細胞，特別是腫瘤乏氧細胞有較強的放射增敏作用有較長的生物半衰期，并在體內能保持其藥物特性，足以滲入整個腫瘤；⑥在常規分次放療中，較低的藥物劑量即可有放射增敏作用。目前習慣將放療增敏劑分類為:①硝基咪唑類②環氧化酶-2抑制劑③HIF-1抑制劑④黃金為基礎的納米。因此，迫切需要找到一種能夠滿足上述條件的在實體瘤缺血壞死組織附近的乏氧腫瘤細胞中發揮放療增敏作用，同時避免增加周圍正常組織細胞的放射損傷風險的藥物，這正是本專利需要迫切解決的問題。
【發明內容】
[0007]本發明為了解決現有技術中的不足而提供一種在實體瘤缺血壞死組織附近的乏氧腫瘤細胞中發揮放療增敏作用的制劑，同時避免增加周圍正常組織細胞的放射損傷風險的藥物。
[0008]為達到上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0009]一種放療增敏劑，包括:50% -80%的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、5% -8%的HIF-1 a -siRNA、12% -45 %的透明質酸，其中所述的透明質酸分子量可以為11000、6600、800中任意一種。其制備過程包括以下步驟:
[0010](I)通過乳液溶劑揮發法制備PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒，旋轉蒸發儀下制作PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒，將金絲桃素包裹在PLGA-PEI納米膠粒中。
[0011](2)將HIF-1 a -siRNA緩慢滴加到所述的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒中制備不同N/P比的PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA的復合物，優選的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒與HIF-1 a -siRNA比例為5_40:1，更優選的PLGA-PEI與HIF-1 a -siRNA比例為10:
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[0012](3)在PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物內緩慢滴加HA，使HA在PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物外圍形成包衣。
[0013]制備成的HA包裹的PLGA-PEI/金絲桃素/HIF_1 a -siRNA納米混合物通過凍干機凍干24-48h，成粉末狀，使用前復溶。也可以直接制備成生理鹽水溶液進行使用及儲存。
[0014]有益效果:
[0015]本發明所述的放療增敏劑與現有的放療增敏劑相比，具有如下優點:不易和其他物質起反應，性質穩定，對腫瘤細胞有放射增敏作用，而對正常細胞不增敏，能夠有效改善腫瘤區的乏氧細胞缺氧狀態，降低腫瘤細胞放射敏感性；在有效劑量下沒有毒性或者毒性較低；易溶于水，便于給藥；有較長的生物半衰期，并在體內能保持其藥物特性，足以滲透整個腫瘤；使用劑量小。
【具體實施方式】
[0016]下面【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明，在未特殊說明情況下本發明涉及到的組分比例均為質量分數，本發明中涉及到的一些試劑及藥品具體規格如下:
[0017]PLGA (LA:GA=50:50, Mw=1000) 濟南岱罡生物工程有限公司
[0018]PEI (Mw= 1800)美國 Sigma-AIdrich
[0019]泊洛沙姆188德國BASF公司
[0020]二氯甲烷(分析純) 江蘇強盛功能化學股份有限公司
[0021]丙酮(分析純)天津市富宇精細化工有限公司
[0022]吐溫-80南京威爾化工有限公司
[0023]甲醇山東禹王實業有限公司氯
[0024]HIF-1 a -siRNA上海吉瑪制藥技術有限公司
[0025]氯仿上海凌峰化學試劑有限公司
[0026]超聲細胞粉碎儀型號SCIENTZ-1ID寧波新芝生物科技有限公司
[0027]旋轉蒸發儀型號RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠
[0028]實施例1
[0029]一種放療增敏劑，包括:80 %的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、8 %的HIF-1a-siRNA、12%的透明質酸，其中所述的透明質酸分子量為11000。其制備過程包括以下步驟:
[0030]1.稱取泊洛沙姆188 0.2g，溶于1mL去離子水中，待溶解。
[0031]2.PE1-丙酮儲備液:稱分子量為25000聚醚酰亞胺(PEI)0.2g、吐溫800.05g、丙酮少許、超聲溶解后倒入1mL容量瓶內，再滴加丙酮定容。
[0032]3.稱分子量為 10000 的 PLGA0.2g、吐溫 80 0.lg,PE1-丙酮儲液 lmL、丙酮 6.5mL、二氯甲烷2.5mL，超聲溶解。
[0033]4.將金絲桃素溶解在乙醇溶劑中制備成2.5mg/mL的溶液。
[0034]5.取40 μ L步驟4配制的金絲桃素溶液與1mL步驟I制備的泊洛沙姆188溶液、步驟3制備的溶液混合后置于超聲細胞粉碎儀中，設置參數為:電伏桿03、功率75 %、超聲15min后取出。
[0035]6.將步驟5的溶液移入茄形瓶，開啟旋轉蒸發儀將有機溶劑全部蒸發。
[0036]7.用0.45 μ m水膜過濾，即得PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒。
[0037]8.將 HIF-1 a -siRNA 與 0.75 % (W/V)的生理鹽水配制成 0.77mg/mL 的HIF-1 a -siRNA生理鹽水溶液。
[0038]9.在磁力攪拌下將步驟8配置的溶液按照PEI =SiRNA比例為10:1 (即N:P摩爾比)緩慢逐漸滴加于PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒中。
[0039]10.在磁力攪拌下將HA與0.75% (W/V)的生理鹽水配制成10mg/mL的HA生理鹽水溶液，緩慢滴加到步驟9得到的溶液中，形成HA包衣的共載HIF-1 a -siRNA和金絲桃素的PLGA-PEI納米膠粒，其中HA按照PEI:siRNA:C00H摩爾比為10:1:2進行滴加。將制備成的HA包裹的PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物通過凍干機凍干24_48h，成粉末狀，使用前復溶。
[0040]實施例2
[0041]一種放療增敏劑，包括:50 %的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、5 %的HIF-1 a -siRNA、45%的透明質酸，其中所述的透明質酸分子量為6600。其制備過程包括以下步驟:
[0042]1.稱取聚乙烯吡咯烷酮(PVA)0.2g，在磁力攪拌下逐量加入1mL生理鹽水中，得到成澄清的PVA溶液。
[0043]2.PE1-丙酮儲備液:稱分子量為25000聚醚酰亞胺(PEI)0.2g、吐溫800.05g、丙酮少許、超聲溶解后倒入1mL容量瓶內，再滴加丙酮定容。
[0044]3.稱分子量為 10000 的 PLGA0.2g、吐溫 80 0.lg,PE1-丙酮儲液 lmL、丙酮 6.5mL、二氯甲烷2.5mL，超聲溶解。
[0045]4.將金絲桃素溶解在乙醇溶劑中制備成2.5mg/mL的溶液。
[0046]5.取40 μ L步驟4配制的金絲桃素溶液與1mL步驟I制備的泊洛沙姆188溶液、步驟3制備的溶液混合后置于超聲細胞粉碎儀中，設置參數為:電伏桿03、功率75 %、超聲15min后取出。
[0047]6.將步驟5的溶液移入茄形瓶，開啟旋轉蒸發儀將有機溶劑全部蒸發。
[0048]7.用0.45 μ m水膜過濾，即得PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒。
[0049]8.將 HIF-1 a -siRNA 與 0.75 % (W/V)的生理鹽水配制成 0.77mg/mL 的HIF-1 a -siRNA生理鹽水溶液。
[0050]9.在磁力攪拌下將步驟8配置的溶液按照PEI =SiRNA比例為10:1 (即N:Ρ摩爾比)緩慢逐漸滴加于PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒中。
[0051]10.在磁力攪拌下將HA與0.75% (W/V)的生理鹽水配制成10mg/mL的HA生理鹽水溶液，緩慢滴加到步驟9得到的溶液中，形成HA包衣的共載HIF-1 a -siRNA和金絲桃素的PLGA-PEI納米膠粒，其中HA按照PEI:siRNA =COOH摩爾比為10:1:24進行滴加。將制備成的HA包裹的PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物配置成生理鹽水溶液進行使用和儲存。
[0052]實施例3
[0053]一種放療增敏劑，包括:80 %的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、8 %的HIF-1 a -siRNA、33%的透明質酸，其中所述的透明質酸分子量為800。其制備過程包括以下步驟:
[0054]1.稱取泊洛沙姆188 0.2g，溶于1mL去離子水中，待溶解。
[0055]2.PE1-丙酮儲備液:稱分子量為25000聚醚酰亞胺(PEI)0.2g、吐溫800.05g、丙酮少許、超聲溶解后倒入1mL容量瓶內，再滴加丙酮定容。
[0056]3.稱分子量為 10000 的 PLGA0.2g、吐溫 80 0.lg,PE1-丙酮儲液 lmL、丙酮 6.5mL、二氯甲烷2.5mL，超聲溶解。
[0057]4.將金絲桃素溶解在乙醇溶劑中制備成2.5mg/mL的溶液。
[0058]5.取40 μ L步驟4配制的金絲桃素溶液與1mL步驟I制備的泊洛沙姆188溶液、步驟3制備的溶液混合后置于超聲細胞粉碎儀中，設置參數為:電伏桿03、功率75 %、超聲15min后取出。
[0059]6.將步驟5的溶液移入茄形瓶，開啟旋轉蒸發儀將有機溶劑全部蒸發。
[0060]7.用0.45 μ m水膜過濾，即得PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒。
[0061]8.將 HIF-1 a -siRNA 與 0.75 % (W/V)的生理鹽水配制成 0.77mg/mL 的HIF-1 a -siRNA生理鹽水溶液。
[0062]9.在磁力攪拌下將步驟8配置的溶液按照PEI =SiRNA比例為10:1 (即N:Ρ摩爾比)緩慢逐漸滴加于PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒中。
[0063]10.在磁力攪拌下將HA與0.75% (W/V)的生理鹽水配制成10mg/mL的HA生理鹽水溶液，緩慢滴加到步驟9得到的溶液中，形成HA包衣的共載HIF-1 a -siRNA和金絲桃素的PLGA-PEI納米膠粒，其中HA按照PEI: siRNA:COOH摩爾比為10:1:18進行滴加。制備成的HA包裹的PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物通過凍干機凍干24_48h，成粉末狀，使用前復溶。
[0064]雖然說明書中對本發明的實施方式進行了說明，但這些實施方式只是作為提示，不應限定本發明的保護范圍。在不脫離本發明宗旨的范圍內進行各種省略、置換和變更均應包含在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種放療增敏劑，其特征在于，包括:50% -80%的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒、5% -8%^ HIF-1 a -siRNAU2% -45%的透明質酸。
2.根據權利要求1所述放療增敏劑，其特征在于:所述的透明質酸分子量為11000、6600、800中任意一種。
3.根據權利要求1或2所述的放療增敏劑，其特征在于:放療增敏劑被制作成水溶劑或凍干粉。
4.一種制備權利要求1或2中放療增敏劑的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)乳化溶劑揮發法制作PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒，將金絲桃素包裹在PLGA-PEI納米膠粒中； (2)將步驟I制備的PLGA-PEI/金絲桃素納米膠粒與HIF-1a -siRNA混合，靜置、孵育15-20分鐘； (3)在PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1a -siRNA納米混合物內按比例緩慢滴加透明質酸，使HA在PLGA-PEI/金絲桃素/HIF-1 a -siRNA納米混合物外圍形成包衣。
5.根據權利要求4所述的制備放療增敏劑的方法，其特征在于:所述的乳化劑為聚乙烯吡咯烷酮、波洛沙姆、低分子量的聚氧乙烯、聚乙二醇等或其任意組合。
【文檔編號】A61K31/7052GK104415348SQ201310377038
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】汪步海, 張立英, 張俊玲, 王曉磊 申請人:汪步海