Peg修飾的透明質酸膽固醇酯的制作方法

Peg修飾的透明質酸膽固醇酯的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型藥物載體PEG修飾的透明質酸膽固醇酯及其應用。它是在透明質酸(HA)骨架上引入疏水性基團膽固醇酯以及親水鏈聚乙二醇(PEG)而形成的，具有兩親性，在水中可自組裝形成聚合物膠束，包載難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物。該PEG修飾的透明質酸膽固醇酯安全性好、可生物降解、臨界膠束濃度低；載藥膠束納米粒大大提高難溶性藥物的水中溶解度，包封率高；制備工藝簡單，易于大規模生產。
【專利說明】PEG修飾的透明質酸膽固醇酯
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種PEG修飾的透明質酸膽固醇酯以及作為藥物載體的應用。
【背景技術】
[0002]現代藥物學研究表明，藥物發揮藥效作用，除了與藥物本身的化學成分、分子結構密切相關外，還與藥物的存在狀態如粒徑大小、表面電荷等有關。納米制劑技術在藥物研究中的應用正是基于它能改變藥物在制劑中的存在狀態而使藥物表現出緩控釋性、靶向性，從而提高藥物生物利用度、降低藥物的毒副作用等。納米技術用于藥物的研究是現代醫學發展的重要方向之一。
[0003]納米制劑主要分為納米載體和納米藥物兩類。其中納米載體系指溶解或分散有藥物的各種納米粒，如納米脂質體、聚合物膠束、固體脂質納米粒、納米囊、納米球等。
[0004]聚合物膠束是利用兩親性的聚合物納米材料在水中自發形成納米膠束的特性而發展起來的，它具有較低的臨界膠束濃度、較大的增溶空間，結構穩定，并且依據聚合物疏水鏈段的性質可以通過化學、物理以及靜電作用等方法包裹藥物，對聚合物膠束表面特征的設計，可賦予納米粒表面以親水性，以減少體內巨噬細胞吞噬，延長體內循環時間，增強對細胞膜的粘附能力，其中聚乙二醇(PEG)是最廣泛的表面修飾材料。
[0005]天然多糖修飾得到的接枝聚合物納米材料是目前常用的聚合物納米材料之一，具有生物降解性高、生物相容性好、免疫原性低、易于化學改性等特點，具有廣泛的應用前景。接枝聚合物膠束由骨架鏈和支鏈組成，該接枝共聚物分散在水中就會自組裝形成具有核殼結構的納米粒子，粒子內核由疏水骨架鏈組成、外殼為親水支鏈；或反過來外殼為親水性骨架鏈、內核由疏水支鏈組成。接枝共聚物的種類、構型、支鏈的長短與數量、接枝位點等，都影響接枝共聚物的性質。.
[0006]透明質酸(HA)是人等哺乳動物細胞外基質中廣泛存在的一種糖胺多糖，在維持細胞外基質結構及調節細胞內活動方面都起著重要的作用。因其具有良好的生物相容性、生物可降解性，HA很早就用于藥物載體。近年來研究發現HA與細胞表面HA受體CD44和RHAM以及其他HA結合蛋白，包括hyaladherins和蛋白多糖(proteoglycans, PG)等相互作用，調節細胞的多種生物行為，如細胞粘附、遷移、增殖和分化以及創傷愈合等。其中CD44是細胞表面最重要的HA受體，是與HA結合的主要部位。同時研究發現CD44受體在腫瘤細胞表面過量表達，HA載體通過受體介導的主動靶向作用將藥物遞送至腫瘤細胞，提高抗腫瘤活性，增加藥物對腫瘤細胞有高度親和性，因此HA接枝形成的兩親性聚合物作為新型藥物載體，能形成核殼結構的納米粒，包裹藥物，達到細胞靶向的作用，日益受到矚目。天然HA的相對分子質量分布范圍很廣，由1000到1000萬不等,其在體內的分布和作用與相對分子質量的大小相關。如高分子HA主要存在于疏松結締組織中，可維持細胞完整性和細胞外基質中水分含量，在外用制劑中應用較多；而HA寡聚糖片段可誘導受體介導的細胞內信號傳導，可作為納米粒藥物傳遞系統。一般，制備納米粒所用的HA分子量較低，通過改變接枝HA中疏水片段的種類、取代度和相對分子質量以及疏水性修飾的方式，可調控HA納米粒的形態、粒徑、載藥量、包封率、釋藥行為和靶向性等。
[0007]HA化學結構中有羧基和羥基，易于對其進行化學改性，接枝疏水鏈，制備聚合膠束。現國內外已報道HA接枝PLGA、接枝脫氧膽酸、接枝神經酰胺、接枝長烷基鏈、接枝紫杉醇等衍生物作為難溶性藥物給藥載體的應用，具有良好的應用前景。201010228961.X專利是在透明質酸骨架上接枝疏水烷基鏈和葉酸，制備了一種藥物增溶材料。
[0008]本發明是在透明質酸羥基上接枝疏水性的膽固醇酯(如膽固醇半琥珀酸酯)和在HA羧基上接枝親水性的PEG鏈，發明一種PEG修飾的透明質酸膽固醇酯。它是兩親性聚合物納米材料，引入的膽固醇酯是疏水基團，有利于形成疏水內核，同時膽固醇酯(如膽固醇半琥拍酸酯，CHS)本身具有一定的抗腫瘤活性(Zora Djuric et al, 1997 ；Katsuhiko Yamadaet al, 2003 ；Chisato Ishimaru et al,2007),是一種潛在的抗腫瘤活性藥物,且無毒、生物相容性好，引入的PEG鏈有利于改善材料表面的親水性，減少體內巨噬細胞吞噬，延長體內循環時間，增強對細胞膜的粘附能力。

【發明內容】

[0009]本發明描述并要求一種新型PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，以及它的制備方法和應用，它是一種安全性好、可生物降解、臨界膠束濃度低的兩親性聚合物，可在水中自組裝形成聚合物膠束，作為納米藥物傳遞系統。
[0010]本發明的目的在于提供一種PEG修飾的透明質酸膽固醇酯及其制備方法。
[0011]本發明的目的在于提供PEG修飾的透明質酸膽固醇酯在藥物制劑領域的應用。
[0012]本發明涉及的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其特征是在透明質酸骨架上引入疏水性基團膽固醇酯以及親水鏈PEG，使其具有兩親性，可在水中自組裝形成聚合物膠束。
[0013]本發明所述的PEG修飾的透`明質酸膽固醇酯，是指疏水性的膽固醇酯(膽固醇半琥珀酸酯、膽固醇半戊酸酯、膽固醇半己酸酯、膽固醇半辛酸酯中的任意一種)取代透明質酸中葡萄糖醛酸-N乙酰葡萄糖胺重復單元上的羥基，親水性PEG取代透明質酸中重復單元上的羧基。
[0014]本發明所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其中接枝的疏水性基團膽固醇酯的總取代度為5%?40%，接枝的PEG的取代度為2?10%。
[0015]本發明所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其特征在于選用的HA的分子量為
5X IO3 ?5 X IO5Da,優選 5 X IO3Da0
[0016]本發明所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯的制備方法包括以下過程:
[0017]膽固醇(CHO)、脂肪烴二酸酐(丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、辛二酸酐中的任意一種，優選丁二酸酐)溶于無水吡啶，70°C磁力攪拌24h ;反應液冷卻至室溫，分別用冰稀鹽酸200mL、蒸餾水洗滌，沉淀，抽濾；粗產品依次用水/無水乙醇混合液(1/1，V/V)、無水乙醇重結晶，得膽固醇半脂肪酸酯；
[0018]透明質酸鈉(HA-Na)溶于甲酰胺中，50°C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取一定量膽固醇半脂肪酸酯溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)，加定量的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DDC)、4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴下反應2h，將其逐滴加入HA-Na中，充氮保護，40°C磁力攪拌24h ;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得透明質酸膽固醇酯；[0019]透明質酸膽固醇酯溶于pH6.8的PBS中，室溫磁力攪拌2h，分別加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)U-羥基-苯并-三氮唑(HOBt，溶于2mL甲醇滴入)、和單甲氧基聚乙二醇胺(PEG-NH2)，室溫磁力攪拌24h ;反應液經甲醇/水(I: 1，V/V)透析ld，蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得PEG修飾的透明質酸膽固醇酯。
[0020]本發明所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯在藥物制劑中的應用，是一種載藥聚合物納米粒的組合物，它是用PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，包載難溶性藥物(如多西紫杉醇等)、蛋白質藥物、基因類藥物，制成載藥聚合物膠束納米粒，加上醫藥學上可接受的輔料制備而成的藥物組合。
[0021]本發明所述的載藥聚合物納米粒是將PEG修飾的透明質酸膽固醇酯溶于蒸餾水制得濃度為I?5mg/mL的空白膠束溶液，將難溶或微溶性藥物溶于有機溶劑后，逐滴加入上述的空白膠束溶液中，經超聲處理后，置于蒸餾水中透析除去有機溶劑，透析液經離心、過濾后，必要時凍干，制得粒徑為I?IOOOnm的聚合物載藥膠束。
[0022]上述PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，具有臨界膠束濃度低，生物相容性好，延長體內循環時間，癌細胞靶向能力強特點。
[0023]上述PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，且具有易形成載藥聚合物納米粒，制備納米粒工藝簡便，納米粒膠束穩定性好，包封率高、納米粒給藥途徑多等特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:CHS 的 IH-NMR 圖
[0025]圖2HACS 的 1H-NMR 圖譜
[0026]圖3PEG-HACS 的 1H-NMR 圖譜
[0027]圖4HACS和PEG-HACS熒光發射光譜I1A3與聚合物對數濃度關系圖。
[0028]圖OTTX 溶液劑、DTX-HACS NPs 和 DTX-PEG-HACS NPs 的體外釋放曲線(η = 3)
【具體實施方式】
[0029]通過下面實施例說明本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍，不局限于此。
[0030]實施例1膽固醇半琥珀酸酯的制備
[0031]膽固醇(CH0，1.25g)、丁二酸酐(SA，0.90g)溶于5mL無水吡唆，70 °C磁力攪拌24h ;反應液冷卻至室溫，分別用冰稀鹽酸200mL、蒸餾水洗滌，沉淀，抽濾；粗產品依次用水/無水乙醇混合液(1/1，V/V)、無水乙醇重結晶，得膽固醇半琥珀酸酯(CHS)。IH-NMR圖譜(圖1)確認其CHS結構。
[0032]實施例2透明質酸膽固醇琥珀酸酯(HACS)的制備
[0033]透明質酸鈉(MW5000，HA-Na, 200mg)溶于5mL甲酰胺中，50°C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取實施例1中的CHS(243mg)溶于lOmLN，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)，加入N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DDC，154.5mg)、4_ 二甲氨基吡啶(DMAP，12.2mg)冰浴反應2h，將其逐滴加入HA-Na中，充氮保護，40°C磁力攪拌24h ;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得透明質酸膽固醇琥珀酸酯(HACS)。HACSIH-NMR圖譜(見圖2)確認HACS結構，取代度約為20%。
[0034]實施例3PEG修飾的透明質酸膽固醇琥珀酸酯(PEG-HACS)的制備[0035]稱取實施例2中的HACS (120mg)溶于20mLpH6.8的PBS中，室溫磁力攪拌2h，分別加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，29mg)、l-羥基-苯并-三氮唑(H0Bt，21mg，溶于2mL甲醇滴入)、單甲氧基聚乙二醇胺(mPEG_NH2，250mg)，室溫磁力攪拌24h ;反應液甲醇/水(I: 1，V/V)透析ld，蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得PEG修飾的透明質酸膽固醇琥珀酸酯(PEG-HACS)，PEG-HACS的IH-NMR圖譜(見圖3)確認PEG-HACS結構，取代度約為8%。
[0036]實施例4HACS以及PEG-HACS臨界膠束濃度的測定
[0037]精密稱定IOmgHACS或PEG-HACS，分散于少量蒸餾水中，磁力攪拌24h，冰浴探頭超聲30min (超聲功率95W，工作2s，間歇5s)，定容至IOmL得lmg/mL的空白膠束溶液；將Img/mL 的空白膠束溶液稀釋至 1X10_3、2X10_3、5X10_3、1X10_2、2.5X 10'5X ΙΟ'?.5X10'
IX 10'5 X lOmg/mL的膠束溶液，分別加入到定量的芘(終濃度為5 X 10_6mol/L)中，混合液超聲30min，40°C水浴lh，靜置過夜，利用熒光分光光度計測定芘的熒光強度。激發波長為335nm，發射波長I1為372nm，I3為383nm，狹縫寬度Ex為5nm，Em為3nm。
[0038]以lgC(g/L)與芘在372nm和383nm處的熒光強度比值(I1A3)作圖(圖4)，曲線的拐點所對應的聚合物濃度即為該聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)。計算得HACS的CMC值為 5.6X l(T3g/L，PEG-HACS 的 CMC 值為 6.3X l(T3g/L。由此表明所制備的 HACS 和 PEG-HACS的臨界膠束濃度都較小，以此制備的載藥膠束具有較好的稀釋穩定性。
[0039]實施例5空白HACS膠束納米粒制備
[0040]按I-5mg/mL的濃度將兩親性HACS溶于蒸餾水中，經超聲處理制備成粒徑為100-IOOOnm的空白膠束納米粒溶液(HACS NP)。
[0041 ] 實施例6空白PEG-HACS膠束納米粒制備
[0042]按I-5mg/mL的濃度將兩親性PEG-HACS溶于蒸餾水中，經超聲處理制備成粒徑為100-IOOOnm的空白膠束納米粒溶液(PEG-HACS NP)。
[0043]實施7載多西紫杉醇HACS膠束納米粒的制備
[0044]20mgHACS溶于蒸餾水制得濃度5mg/mL的空白膠束溶液，將2.0mg的多西紫杉醇(DTX)溶于400yL甲醇后，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴超聲30min(超聲功率95W，工作2s，間歇5s)，置于蒸餾水中透析除去甲醇，透析液經離心、過濾后，制得粒徑為I-IOOOnm的載藥HACS膠束納米粒(DTX-HACS NPs)。
[0045]實施例8載多西紫杉醇PEG-HACS膠束納米粒的制備
[0046]15mg PEG-HACS溶于蒸餾水制得濃度3mg/mL的空白膠束溶液，將1.5mg的DTX溶于400 μ L甲醇后，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴探頭超聲30min (超聲功率95W，工作2s，間歇5s)，置于蒸餾水中透析除去甲醇，透析液經離心、過濾后，制得粒徑為I-IOOOnm 的載藥 PEG-HACS 膠束 納米粒(DTX-PEG-HACS NPs)。表 I 是 DTX-PEG-HACS 膠束納米粒及相關膠束納米粒的一些性質。
[0047]表I DTX-PEG-HACS膠束納米粒及相關膠束納米粒的一些性質
[0048]
【權利要求】
1.PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其特征是在于⑴它是透明質酸(HA)骨架的羥基上引入疏水性基團膽固醇酯以及在HA的羧基上引入親水鏈PEG而形成的，具有兩親性，(2)在水中能自組裝形成聚合物膠束，作為難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物的納米載體，其包含η個重復單元并具有以下結構通式(I):
2.根據權利要求1所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其中HA的分子量為5X IO3?5父1050&，優選5父1030&。
3.根據權利要求1所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其中在至少一個重復單元中，RpHR4中的一個或多個為具有結構通式(II)的膽固醇酯，其中η為2?5的整數，膽固醇酯包括膽固醇半琥珀酸酯、膽固醇半戊酸酯、膽固醇半己酸酯、膽固醇半辛酸酯，優選膽固醇半琥珀酸酯，否則H R3、R4為羥基。
4.根據權利要求1所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其中R5為具有結構通式(III)的單甲氧基聚乙二醇胺(PEG-NH-)，否則R5為-ONa，CH3O- (CH2OCH2O) n-CH2CH2NH- (III)其中單甲氧基聚乙二醇胺分子量為I X IO3?6 X IO3Da,優選2X 103Da。
5.根據權利要求1所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其中接枝的疏水性基團膽固醇酯的總取代度為5%?40%，接枝的PEG的取代度為2?10%。
6.根據權利要求1所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，其制備方法包括以下過程:膽固醇(CH0)、脂肪烴二酸酐(丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、辛二酸酐中的任意一種，優選丁二酸酐)溶于無水吡啶，70°C磁力攪拌24h;反應液冷卻至室溫，分別用冰稀鹽酸200mL、蒸餾水洗滌，沉淀，抽濾；粗產品依次用水/無水乙醇混合液(1/1，V/V)、無水乙醇重結晶，得膽固醇半脂肪酸酯；透明質酸鈉(HA-Na)溶于甲酰胺中，50°C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取一定量膽固醇半脂肪酸酯溶于N，N’ - 二甲基甲酰胺(DMF)，加定量的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DDC)、4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴下反應2h，將其逐滴加入HA-Na中，充氮保護，40°C磁力攪拌24h ;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用少量甲酰胺溶解后蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得透明質酸膽固醇酯；`透明質酸膽固醇酯溶于PH6.8的PBS中，室溫磁力攪拌2h，分別加入一定量的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、1-羥基-苯并-三氮唑(HOBt，溶于2mL甲醇滴入)、和單甲氧基聚乙二醇胺(PEG-NH2),室溫磁力攪拌24h;反應液經甲醇/水(I: 1，V/V)透析ld，蒸餾水透析3d，冷凍真空干燥得PEG修飾的透明質酸膽固醇酯。
7.—種載藥聚合物納米粒的組合物,其特征在于如權利要求1?6任何一項所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯，包載難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物，制成載藥聚合物膠束納米粒，加上醫藥學上可接受的輔料制備而成的藥物組合。
8.根據權利要求7所述，其中難溶性藥物包括抗腫瘤藥或非留體抗炎藥中的任一物質或其衍生物，優選紫杉烷類、喜樹堿類、甲氨蝶呤和姜黃素。
9.根據權利要求7中所述的載藥聚合物納米粒組合物，其制備方法包括以下過程:將所述的PEG修飾的透明質酸膽固醇酯溶于蒸懼水制得濃度為I?5mg/mL的空白膠束溶液,將難溶藥物溶于有機溶劑后，逐滴加入上述的空白膠束溶液中，經超聲處理后，置于蒸餾水中透析除去有機溶劑，透析液經離心、過濾，必要時再凍干，制得粒徑為I?IOOOnm的聚合物載藥膠束。
10.根據權利要求7所述的載藥聚合物納米粒的組合物，其特征在于:所述的組合物適用于注射制劑、口服制 劑或外用制劑。
【文檔編號】A61K9/16GK103435718SQ201310364416
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】欒立標, 王文娟 申請人:中國藥科大學