高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，屬于獸藥【技術領域】。其包括下述步驟：（1）無菌采用經過高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原免疫的豬的脾臟，去除被膜和結締組織，沖洗，剪碎；（2）加入無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機絞碎，制成勻漿；（3）勻漿反復凍融8次后，于4℃下4000r/min離心15min，收取上清液；（4）將上清液置于透析袋內進行透析，收集透析外液，過濾除菌，加入冷凍保護劑，混合后分裝，-20℃保存。本發(fā)明能夠特異性提高豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的免疫效果，改善或增強豬的免疫功能和抗感染能力，具有預防和治療豬繁殖與呼吸綜合癥，降低發(fā)病率和死亡率的作用。
【專利說明】高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及獸藥【技術領域】。
【背景技術】[0002]豬繁殖與呼吸綜合癥(porcinereproductive and respiratory syndromes,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起豬的一種以繁殖障礙和呼吸道癥狀為特征的急性接觸性傳染病，是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。PRRSV在體內主要侵害單核/巨噬細胞，引起機體天然和特異性免疫功能抑制，因此PRRSV感染豬容易發(fā)生鏈球菌、豬支原體肺炎、豬圓環(huán)病毒2型、豬流感病毒等病原的繼發(fā)感染，使危害更加嚴重。2006年以來，疫情在我國各地暴發(fā)流行，大量仔豬、母豬發(fā)病致死，給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大損失，農業(yè)部組織專家開展流行病學、病原學等科技攻關，最后證實疫情是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒變異株引起的一種高致病性傳染病。這種高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥發(fā)病和死亡率高，仔豬發(fā)病率達到100%、死亡率達50%以上，母豬流產率達30%以上，育肥豬死亡率20%-30%。
[0003]目前對PRRS沒有有效治療藥物，免疫接種是預防該病的主要措施，但疫苗的免疫效果并不理想。因此，研發(fā)新的免疫增強劑和防治制劑具有重要意義。轉移因子(transferfactor, TF)是由具有免疫活性的T淋巴細胞釋放的一類可透析的、分子量為3-5 kDa小分子物質，是核酸和多肽相連且不含蛋白質的雜合分子，具有傳遞免疫信息、調節(jié)和增強機體免疫功能等作用，不僅能夠提高受體的淋巴細胞轉化率，增強白細胞吞噬能力和游走活性，促進抗體產生，而且對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及寄生蟲等病原有明顯抑制作用，已有用TF治療結核病、皰疹病毒感染、肺包蟲病等疾病的實驗報道，而且受體在接受TF后能夠快速(4-24 h)獲得相應的細胞免疫功能，并可維持數(shù)月或更長時間。TF分子量小，無熱原，無抗原性，不引起過敏反應，無明顯毒副作用和種屬差異，是一種新型、安全的免疫增強劑和免疫治療制劑。根據免疫特性的不同，TF分為非特異性TF和特異性TF(specific TF, STF)兩大類。STF是指采用某種特定抗原免疫或病原感染后的動物，再提取的含該抗原特異活性的轉移因子。STF可將特異性免疫信息傳遞到受體動物，激發(fā)其特異性免疫，STF的保護作用高于非特異性TF。目前尚無高致病性PRRS特異性TF (PRRS-STF)供臨床需要。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明提供一種豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，能夠特異性提高豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的免疫效果，改善或增強豬的免疫功能和抗感染能力，具有預防和治療豬繁殖與呼吸綜合癥，降低發(fā)病率和死亡率的作用。
[0005]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，包括下述步驟:
(I)無菌采取經過高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原免疫豬的脾臟，去除脾臟的被膜和結締組織，用生理鹽水沖洗,稱重,剪碎；
(2)按照其重量加入1.5-3倍的無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機2500 r/min絞碎，制成勻漿；
(3)勻漿_20°C冷凍和室溫融化，反復凍融8次后，于41:下4000 r/min離心15 min,收取上清液；
(4)將上清液置于透析袋內，用無熱源的等體積無菌生理鹽水在0-4°C環(huán)境下透析36-48h，收集透析外液，用直徑為0.22 的濾膜過濾除菌，加入冷凍保護劑，混勻，即得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子溶液，分裝，-20 °C保存。
[0006]步驟(I)中抗原免疫過程為:將高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活毒疫苗用生理鹽水稀釋后，肌肉注射給2頭3月齡健康豬，間隔2周免疫一次，首次注射2頭份/頭，第2-4次免疫4頭份/頭；第四次免疫10天后，前腔靜脈采血，分離血清，經ELISA檢測抗PRRSV抗體水平為陽性即合格。
[0007]高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活毒疫苗為JXAl-R毒株。高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(JXAl-R毒株)安全性高，副作用小，抗體產生較快，抗體轉陽率高，免疫效果好。
[0008]步驟(4)中透析袋孔徑為7.0kD。
[0009]步驟(4)中采用蔗糖作為冷凍保護劑，特異性轉移因子溶液中蔗糖的質量濃度為
3.4%。加入蔗糖保護劑對本發(fā)明的轉移因子起到良好的保護作用，可以抑制在貯藏期內多肽的變性，從而保證轉移因子的生物學活性。
[0010]采用上述技術方案所產生的有益效果在`于:
1.本發(fā)明的轉移因子能夠特異性提高豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的免疫效果，改善或增強豬的免疫功能和抗感染能力，具有預防和治療豬繁殖與呼吸綜合癥，降低發(fā)病率和死亡率的作用。
[0011]2.本發(fā)明的轉移因子采用活毒疫苗抗原免疫過的豬脾臟提取，抗原誘導的免疫應答反應全面，免疫效果明顯高于滅活疫苗，轉移因子的組成成分更加全面，為進一步研發(fā)PRRS疫苗免疫增強劑及免疫治療制劑提供實驗依據。
[0012]3.采用透析的方法進行轉移因子的提取，制備方法更加便捷，成本低廉，能夠有效阻止相關成分的丟失。
[0013]4.采用蔗糖作為冷凍保護劑能夠阻止轉移因子結構的改變，對冷凍及貯藏期內生物大分子的聚集和伸展，保證轉移因子的生物學活性起顯著作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0015]圖1是本發(fā)明PRRSV-STF氨基酸組成的高效液相色譜分析圖；
圖2是本發(fā)明PRRSV-STF對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性的影響示意圖；
圖3是本發(fā)明PRRSV-STF對小鼠外周血淋巴細胞增殖活性影響示意圖；
圖4是本發(fā)明PRRSV-STF對PRRS活疫苗免疫豬外周血淋巴細胞的增殖活性影響示意圖?！揪唧w實施方式】
[0016]以下實施例中，高致病性PRRS活疫苗(JXA1-R株)為吉林省元亨生物技術有限公司生產。3月齡健康豬(杜洛克X長白X大約克夏三元雜交)，均購自河北保定某規(guī)?；i場，所購豬均沒有接種過PRRS疫苗。
[0017]實施例1
(1)將高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R毒株)疫苗用生理鹽水稀釋后，肌肉注射給2頭3月齡健康豬，間隔2周免疫一次，首次注射2頭份/頭，第2-4次免疫4頭份/頭；第四次免疫10天后，前腔靜脈采血，分離血清，經ELISA檢測抗PRRSV抗體水平為陽性即合格。無菌采用經過豬繁殖與呼吸綜合癥抗原免疫的豬的脾臟，去除脾臟的被膜和結締組織，用生理鹽水沖洗,稱重,剪碎；
(2)按照其重量加入1.5倍的無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機2500 r/min絞碎，制成勻漿；
(3)勻漿_20°C冷凍和室溫融化，反復凍融8次后，于41:下4000 r/min離心15 min,收取上清液；
(4)將上清液置于孔徑為7.0kD透析袋內，用無熱源的等體積無菌生理鹽水在0-4 °C環(huán)境下透析40h，收集透析外液，用直徑為0.22 y m的濾膜過濾除菌，加入蔗糖作為冷凍保護劑，混勻，即得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子溶液，分裝，-20 °C保存。特異性轉移因子溶液中蔗糖的質量濃度為3.4%。
[0018]實施例2
(1)將高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R`毒株)疫苗用生理鹽水稀釋后，肌肉注射給2頭3月齡健康豬，間隔2周免疫一次，首次注射2頭份/頭，第2-4次免疫4頭份/頭；第四次免疫10天后，前腔靜脈采血，分離血清，經ELISA檢測抗PRRSV抗體水平為陽性即合格。無菌采用經過豬繁殖與呼吸綜合癥抗原免疫的豬的脾臟，去除脾臟的被膜和結締組織，用生理鹽水沖洗,稱重,剪碎；
(2)按照其重量加入3倍的無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機2500r/min絞碎，制成勻
漿；
(3)勻漿_20°C冷凍和室溫融化，反復凍融8次后，于41:下4000 r/min離心15 min,收取上清液；
(4)將上清液置于孔徑為7.0kD透析袋內，用無熱源的等體積無菌生理鹽水在0-4 °C環(huán)境下透析48h，收集透析外液，用直徑為0.22 y m的濾膜過濾除菌，加入蔗糖作為冷凍保護劑，混勻，即得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子溶液，分裝，-20 °C保存。特異性轉移因子溶液中蔗糖的質量濃度為3.4%。
[0019]實施例3
(1)將高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R毒株)疫苗用生理鹽水稀釋后，肌肉注射給2頭3月齡健康豬，間隔2周免疫一次，首次注射2頭份/頭，第2-4次免疫4頭份/頭；第四次免疫10天后，前腔靜脈采血，分離血清，經ELISA檢測抗PRRSV抗體水平為陽性即合格。無菌采用經過豬繁殖與呼吸綜合癥抗原免疫的豬的脾臟，去除脾臟的被膜和結締組織，用生理鹽水沖洗,稱重,剪碎；
(2)按照其重量加入2倍的無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機2500r/min絞碎，制成勻漿；
(3)勻漿_20°C冷凍和室溫融化，反復凍融8次后，于41:下4000 r/min離心15 min,收取上清液；
(4)將上清液置于孔徑為7.0kD透析袋內，用無熱源的等體積無菌生理鹽水在0-4 °C環(huán)境下透析36h，收集透析外液，用直徑為0.22 y m的濾膜過濾除菌，加入蔗糖作為冷凍保護劑，混勻，即得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子溶液，分裝，-20 °C保存。特異性轉移因子溶液中蔗糖的質量濃度為3.4%。
[0020]對本發(fā)明的轉移因子PRRS-STF進行性能檢測:
1.理化性質的檢測
經檢測，STF呈淡黃色的澄清液體，有微弱的腥味，pH值為6.44。與20%磺基水楊酸反應無沉淀生成，與茚三酮反應溶液呈藍紫色，生理鹽水對照顯示茚三酮的顏色(淡黃色)；與硝酸和鑰酸銨反應有黃色沉淀生成，生理鹽水對照無沉淀生成；紫外分光光度計測定的OD260 ?和OD280 ?的平均值分別為0.43和0.155，兩者的比值(0D26Q/0D28(l)為2.77，核酸的含量為21.5 mg/mL。上述結果表明，PRRSV-STF溶液內不含蛋白質，而含有核酸和氨基酸，與TF的理化性質相符。
[0021]2.PRRS-STF中氨基酸種類及其含量的測定取I mL樣品加入9 mL 6.0mol/L的鹽酸，110°C下水解14 h，冷卻至室溫；取水解液5 mL真空抽干，再加入0.1 mol/L的鹽酸
1.0 mL溶解后，再經過氨基酸衍生后，用高效液相色譜儀(Agilent 1200)檢測STF中的氨
基酸組成及其含量。
`[0022]經高效液相色譜儀(Agilent 1200)分析得知，PRRSV-STF含有18種水解氨基酸(見圖1，其中I-18分別為天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、?；撬?，經計算得出18中氨基酸的含量(見表I)。其中谷氨酸的含量最高，為0.642 mg/mL，其次為非蛋白氨基酸一?；撬?，含量為0.298 mg/mL，此后依次為甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸等，每mL中含氨基酸總量為3.479 mg。
[0023]表I高致病性PRRSV-STF的氨基酸種類及其含量
【權利要求】
1.一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，其特征在于其包括下述步驟: (1)無菌采取經過高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原免疫豬的脾臟，去除脾臟的被膜和結締組織，用生理鹽水沖洗,稱重,剪碎； (2)按照其重量加入1.5-3倍的無菌生理鹽水，用高速組織搗碎機2500 r/min絞碎，制成勻漿； (3)勻漿-20°C冷凍和室溫融化，反復凍融8次后，于41:下4000 r/min離心15 min,收取上清液； (4)將上清液置于透析袋內，用無熱源的等體積無菌生理鹽水在0-4°C環(huán)境下透析36-48h，收集透析外液，用直徑為0.22 y m的濾膜過濾除菌，加入冷凍保護劑，混勻，即得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子溶液，分裝，-20 °C保存。
2.根據權利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，其特征在于步驟(I)中抗原免疫過程為:將高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活毒疫苗用生理鹽水稀釋后，肌肉注射給2頭3月齡健康豬，間隔2周免疫一次，首次注射2頭份/頭，第2-4次免疫4頭份/ 頭；第四次免疫10天后，前腔靜脈采血，分離血清，經ELISA檢測抗PRRSV抗體水平為陽性即合格。
3.根據權利要求2所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，其特征在于所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥活毒疫苗為JXAl-R毒株。
4.根據權利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，其特征在于步驟(4)中透析袋孔徑為7.0kD。
5.根據權利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥特異性轉移因子的制備方法，其特征在于步驟(4)中采用蔗糖作為冷凍保護劑，特異性轉移因子溶液中蔗糖的質量濃度為 3.4%。
【文檔編號】A61K39/12GK103446182SQ201310338679
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權日:2013年8月6日
【發(fā)明者】宋勤葉, 袁洪興, 逯紀成, 陳桂清, 孫泰然 申請人:河北農業(yè)大學