一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物及其用途
【專利摘要】本發明涉及生物制藥領域，提供一種新的治療腫瘤的藥物復合物，具體涉及一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物及其用途；該藥物復合物用于治療腫瘤。該藥物復合物能在體外顯著增強精氨酸酶的抗腫瘤活性；能減少人重組精氨酸酶的免疫原性，延長精氨酸酶在體內的半衰期。本發明提供了多聚唾液酸修飾的精氨酸酶，該多聚唾液酸修飾的精氨酸酶由活化的多聚唾液酸在氰基硼氫化鈉存在的情況下與精氨酸酶反應成偶聯物；本發明的藥物復合物可增強精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，增強精氨酸酶的療效，尤其是治療黑色素瘤和乳腺癌的療效。
【專利說明】一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬醫藥【技術領域】，涉及新的治療腫瘤的藥物復合物；具體涉及一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物及其用途；該藥物復合物用于治療腫瘤，尤其治療黑色素瘤和肝癌。
【背景技術】
[0002]精氨酸酶是哺乳動物肝臟中參與尿素循環的一種關鍵酶，在尿素循環中將精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素。現有技術公開了精氨酸是維持部分腫瘤細胞生長的必需氨基酸，腫瘤細胞內精氨酸水平低于一定值后，將導致細胞死亡。精氨酸酶能在體內外特異高效的降解精氨酸。精氨酸在人體的正常生理功能中具有重要作用，是一種半必須氨基酸，正常體細胞能夠通過尿素循環將其他氨基酸轉化為精氨酸，從而抵消外源性精氨酸缺乏；然而，對于部分精氨酸依賴的腫瘤細胞，由于缺乏尿素循環過程中的關鍵酶，在外源性精氨酸剝奪時，無法自身合成精氨酸，最終導致細胞死亡。精氨酸酶能夠在體內外降解精氨酸，導致精氨酸依賴的腫瘤細胞死亡，而對正常細胞無影響。有研究在體外試驗中，發現精氨酸酶能顯著殺傷肝癌細胞、黑色素瘤細胞、胰腺癌細胞以及白血病細胞等[① Lam TL, Wong GK, Chong HC, Cheng PN, Choi SC, Chow TL, et al.Recombinant humanarginase inhibits proliferat1n of human hepatocellular carcinoma by inducingcell cycle arrest.Cancer letters.2009 ;277:91-100.② Hernandez CP, Morrow K，Lopez-Barcons LA，Zabaleta J，Sierra R，Velasco C，et al.Pegylated arginase I:a potential therapeutic approach in T-ALL.Blood.2010 ；115:5214-21.③ HsuehEC，Knebel SM，Lo WH, Leung YC, Cheng PN, Hsueh CT.Deprivat1n of arginine byrecombinant human arginase in prostate cancer cells.Journal of hematology &oncology.2012 ；5:17.]精氨酸酶治療肝癌的一期臨床結果顯示了其良好的成藥性能[YauT, Cheng PN, Chan P, Chan ff, Chen L, Yuen J, et al.A phase I dose-escalating studyof pegylated recombinant human arginase I (Peg-rhArgl)in patients with advancedhepatocellular carcinoma.1nvestigat1nal new drugs.2012.]，據了解，精氨酸酶用于肝癌的治療用研究已經完成二期臨床試驗，表現出良好的應用前景；皮膚惡性黑素瘤(cutanous malignant melanoma, CMM)發病率呈上升趨勢,據美國國家癌癥研究中心網上數據表明:美國白人CMM發病率從1973年的7.5/100000上升到2001年的22.5/100000。在我國，黑色素瘤發病率成增高趨勢，盡管多數早期患者通過手術能夠得到治愈，但對于進展期患者，化療通常效果不佳，因而尋找新的治療策略尤為重要。
[0003]但精氨酸酶在體內低親和力和較短的半衰期等因素影響了藥物的抗腫瘤療效。因此，進一步提高精氨酸酶體內的抗腫瘤活性將有助于其抗腫瘤應用。
[0004]多聚唾液酸是N-乙酰神經氨酸通過N-連接糖苷鍵多聚形成的獨特碳水化合物，研究發現多聚唾液酸化多肽或蛋白質在保持活性的前提下，修飾后可顯著降低肽類化合物水解，延長半衰期，降低免疫原性(Gregoriadis G, Fernandes A, Mital M, McCormack B:Polysialic acids !potential in improving the stability and pharmacokinetics ofproteins and other therapeutics.Cell Mol Life Sci 2000 ;57 (13-14):1964-1969)。Fernandes等利用多聚唾液酸對L-天冬酰胺酶進行修飾，修飾后酶的抗原性和免疫原性均低于天冬酰胺酶，但修飾后酶抗胰蛋白酶的水解能力和體外半衰期明顯增強(FernandesAl，Gregoriadis G:The effect of polysialylat1n on the immunogenicity andantigenicity of asparaginase !implicat1n in its pharmacokinetics.1nt JPharm2001 ；217(l-2):215-224);林怡等對銅鋅超氧化物歧化酶進行多聚唾液酸修飾，修飾后產物的穩定性實驗結果表明，多聚唾液酸修飾可提高銅鋅超氧化物歧化酶的酸堿穩定性、熱穩定性和抗酶降解能力(Wu JR, Lin Y，Zheng ZY，Lin CC, Zhan XB, Shen YQ:Improvement of the CuZn-superoxide dismutase enzyme activity and stability asa therapeutic agent by modificat1n with polysialic acids.B1technol Lett2010 ；32(12):1939-1945) 0此外多聚唾液酸通過改變神經系統神經黏附分子的黏附性調節神經細胞發育，對神經細胞功能的維持起重要作用(Weber M，Modemann S，Schipper P，Trauer H， Franke H， Illes P， Geiger KD, Hengstler JG, Kleemann WJ-1ncreasedpolysialic acid neural cell adhes1n molecule express1n in human hippocampusof heroin addicts.Neuroscience2006 ；138(4): 1215-1223 ;Angata K，Huckaby V，Ranscht B,Terskikh A,Marth JD,Fukuda M:Polysialic acid-directed migrat1n anddifferentiat1n of neural precursors are essential for mouse brain development.Mol Cel I B1l2007 ；27(19):6659-6668)。
[0005]細胞自嗷(autophagy)又叫 II 型程序性死亡(type II programmed celldeath)，是真核生物體內常見的“自我消化” (cellular degradat1n)的現象，能分解細胞內受損或多余的細胞器和蛋白產生核苷酸，氨基酸等小分子物質供細胞合成新的蛋白質，并能維持細胞內微環境的穩定。研究發現其與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關系密切。根據細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，哺乳動物細胞自噬可分為三種方式:大自嗷(macroautophagy)、小自嗷(microautophagy)和分子伴侶介導的自嗷(chaperone-mediated autophagy，CM) ?主要概述的大自嗷(以下簡稱自嗷)與腫瘤發展及治療關系最為密切 ΓSridhar S, Botbol Y，Macian F，et al.Autophagy and disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012:226 (2):255-73.]。自嗷是胞衆大分子物質和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程。現有技術其中的過程大致能分為4個階段「Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exa MedB1l.2012 ；738:169-84.]。自噬能對細胞對外部環境改變及各種剌激產生應激反應。細胞在生長條件下能發生較低水平的自噬，稱基礎自噬。然而，一旦受到外界的剌激，如饑餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調。如在營養物質缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內壞死細胞器產生氨基酶等供細胞合成新的蛋白質，維持細胞的存活 Γ ① Piacentini M，D’ Eletto M，Falasca L，et al.Transglutaminase2atthe crossroads between cell death and survival.Adv Enzymol Relat Areas MolB1l.2011 ；78:197-246:(? Cook KL, Shaiahan AN, Clarke R.Autophagy and endocrineresistance in breast cancer.ExnertRev Anticancer Ther.2011:11(8):1283-94.；③ Wirawan E，Vanden Berghe T，Lippens S，et al.Autophagy:for better or forworse.Cell Res.2012:22 (I):43-61.]。
[0006]研究揭示自噬能降解折疊錯誤的蛋白質、損傷的細胞器等，延緩機體衰老的發生。集體衰老相關疾病一神經退行性疾病可以被歸類為蛋白構象錯誤疾病，一般是由于大量折疊錯誤的蛋白質在細胞內堆積從而引發細胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，力口神經退行性疾病和惡件腫瘤都與細胞自曬密切相關[(I) Martinez-Borra T, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012 ；738: 169-84.；② CaballeroB, Coto-Montes A.An insight into the role of autophagy in cell responses inthe aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012:27 (3):263-75.；(? Mendelsohn AR, Larrick Tff.Rapamycin as an antiaging therapeutic ?:targetingmammalian target of rapamycin to treat Hutchinson-Gilford progeria andneurodegenerative diseases.Rejuvenat1n Res.2011:14(4):437-41.]。
[0007]據報道，自噬基因缺失或者突變的線蟲生長發育缺陷、衰老加速并縮短壽命；并且自噬也參與果蠅變態的發生。此外自噬在哺乳動物成年個體組織器官發育和分化中也起了重要作用「Mizushima N, Komatsu M.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011 ；147(4):728-41.]。此外作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導致細胞死亡。「Denton P, Nicolson S, Kumar S.Cell death byautophagy:facts and apparent artefacts.Cell Death Differ.2012: 19 (I):87-95.]。研究表明，腫瘤的發生與發展和自噬的關系極為密切。
[0008]一般來說，由于細胞自噬有利于細胞的存活，但是自噬對腫瘤細胞的發生發展目前尚沒有定論。自噬初期可以作為腫瘤發生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自嗤，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導致原癌細胞持續增殖。大多數腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬缺乏可引起自噬底物P62積聚通過NF-K B信號涂徑引起腫瘤形成「Trocoli A,P iavaher1-Mergny M.The complex interplaybetween autophagy and NF-κ B signaling pathways in cancer cells.Am I CancerRes^2011 ；1(5):629-49.]。然而在腫瘤生長到一定程度時，尤其是當腫瘤內還沒有形成足夠的血管為其擴增提供營養時，腫瘤細胞也可以通過自噬來克服營養缺乏和低氧的環境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h，HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這也說明了在營養缺乏等條件下自噬也是腫瘤細胞的一種自我保護的機制「Baldwin AS.Regulat1n of cell death and autophagy by IKK and NF-κ B:criticalmechanisms in immune funct1n and cancer.Tmmunol Rev.201 2:246⑴:327-45.]。
[0009]另有研究公開了，抗腫瘤藥物誘導的腫瘤細胞自噬所體現的作用大致可以概括為兩種:大部分情況下是對腫瘤細胞的保護，某些情況下也能對腫瘤細胞進行殺傷。研究表明化療藥物5-FU以及單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)和西妥昔單抗(Cetuximab)均能顯著地誘導細胞自噬，且抑制由這3種藥物產生的細胞自噬能顯著增加腫瘤細胞對治療的敏感性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C, MenendezJA.Autophagy Facilitates the Development of Breast Cancer Resistance to theAnt1-HER2Monoc1naI Antibody Trastuzumab.PLoS One.2009 ；4 (7):e6251.1，Hou N, Faried A, Tsutsumi S, et al.1nhibit1n of Autophagy by3-MA Enhances theEffect of5-FU_Induced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009 ；16(3):761-771 ；
[0010]迄今為止，尚未見有人重組精氨酸酶誘導腫瘤細胞自噬以及細胞自噬抑制劑與人重組精氨酸酶聯合治療腫瘤的相關報道。
【發明內容】
[0011]本發明的目的是提供一種新的治療腫瘤的藥物復合物，具體涉及一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物及其用途；該藥物復合物用于治療腫瘤，尤其治療黑色素瘤和肝癌。該藥物復合物能在體外顯著增強精氨酸酶的抗腫瘤活性；能減少人重組精氨酸酶的免疫原性，延長精氨酸酶在體內的半衰期。
[0012]本發明基于目前主要用于腫瘤治療的化療藥物大多會產生耐藥性及有較強的副作用；其中，雖然精氨酸酶的抗腫瘤作用得到了廣泛的論證，但其體內親和力較低，起效劑量較大，存在一些潛在的毒副作用，因此，本發明提供一種自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物；該藥物復合物可加強精氨酸酶活性從而降低其用量和毒副作用；該藥物復合物可通過使用一種或者幾種自噬抑制劑與精氨酸酶制成復方藥物或是組合物，進行聯合給藥或是序貫給藥，加強精氨酸酶的抗腫瘤療效。
[0013]本發明還基于細胞自噬與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關系密切，本發明的研究中顯現細胞自噬在精氨酸酶對黑色素瘤和乳腺癌的治療過程中對人重組精氨酸酶有抵抗作用；并且使用自噬抑制劑能加強人重組精氨酸酶對黑色素瘤、肺癌、腦瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，尤其是黑色素和乳腺癌的療效。
[0014]具體而言，本發明的自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，由一種或多種自噬抑制劑和精氨酸酶組成；
[0015]本發明中，細胞自卩遼抑制劑包括但不限于:3_MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine);本發明的實施例中，優選細胞自卩遼抑制劑為:3_MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)。
[0016]本發明中所述的精氨酸酶包括求不限于鼠源精氨酸酶、人重組精氨酸酶以及各種長效化修飾的精氨酸酶，包括但不限于聚乙二醇修飾的人重組精氨酸酶、多聚唾液酸修飾的人重組精氨酸酶。
[0017]本發明中，采用活化的多聚唾液酸對精氨酸酶進行化學修飾，本發明的實施例中，由活化的多聚唾液酸末端第7位的單醛基與精氨酸酶的氨基進行反應獲得化學修飾長效精氨酸酶。
[0018]本發明中，所述的細胞自噬抑制劑與所述的精氨酸酶可制成藥物復合物、復方藥物或序貫使用，用于治療惡性腫瘤；其中，通過抑制精氨酸酶誘導的細胞自噬而抵消腫瘤由于細胞自噬而引起的對精氨酸酶治療的拮抗作用，從而顯著增強精氨酸酶對腫瘤的治療效果O
[0019]本發明中，所述的腫瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌和骨髓瘤，本發明的實施例中優選黑色素瘤和乳腺癌；
[0020]所述精氨酸酶通過誘導黑色素瘤凋亡和細胞周期阻滯殺傷腫瘤細胞；所述精氨酸酶通過誘導乳腺癌細胞凋亡殺傷腫瘤細胞。
[0021]本發明所述的藥物可進一步選自以下形式進行配方:
[0022]本發明所述的藥物復合物中，進一步選自下述的形式進行配制，包括:片劑、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體、納米微球等。
[0023]本發明進行了細胞實驗,實驗結果顯示,在精氨酸脫亞胺酶(argininedeiminase)殺傷腫瘤細胞時，細胞自噬能保護腫瘤細胞免于細胞死亡，從而降低了藥物的療效；所述藥物復合物中的人重組精氨酸酶也能顯著誘導黑色素瘤細胞和乳腺癌細胞發生細胞自噬，而細胞自噬則會部分抵消精氨酸酶的抗腫瘤效果，通過使用細胞自噬抑制劑抑制細胞自噬能增加黑色素瘤細胞和乳腺癌細胞對人重組精氨酸酶的敏感性，從而增強人重組精氨酸酶的療效
[0024]本發明中，采用一種或多種自噬抑制劑與人重組精氨酸酶制成復方藥物、組合物聯合給藥或是序貫給藥，用于治療惡性腫瘤，可增強人重組精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，增強人重組精氨酸酶的療效。
[0025]本發明的突出的有益效果在于:解決了在延長精氨酸酶的體內半衰期的同時保持精氨酸酶的活性、降低其免疫原性的關鍵技術問題，尤其是提供了多聚唾液酸修飾的精氨酸酶，該多聚唾液酸修飾的精氨酸酶由活化的多聚唾液酸在氰基硼氫化鈉存在的情況下與精氨酸酶反應成偶聯物；本發明本發明的自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物可增強精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，增強精氨酸酶的療效，尤其是治療黑色素瘤和乳腺癌的療效。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1A，B:顯示了 A375細胞透射電子顯微鏡下細胞亞顯微結構圖；
[0027]圖1C，D顯示了 A375細胞經過不同時間或不同濃度人重組精氨酸酶處理后細胞亞顯微結構圖。
[0028]圖2A、2B、2C顯示，精氨酸酶處理72h顯著地抑制了 A375、MDA-MB_231、MCF_7細胞的增殖。
[0029]圖3A、B是細胞A375和MDA-MB-231的電泳圖。
[0030]圖4顯示:經過人重組精氨酸酶處理的A375細胞的LC3II的表達量高于對照組。
[0031]圖5A，B，C，D顯示了:抑制自噬增強A375細胞中重組精氨酸酶引起的線粒體膜電位的降低。
[0032]圖6顯示了重組精氨酸酶誘導A375細胞產生活性氧。
[0033]圖7是經多聚唾液酸修飾的重組人精氨酸酶分子量的凝膠電泳分析圖。
【具體實施方式】
[0034]實施例1:人重組精氨酸酶的制備。
[0035]采用PCR的方法獲得編碼人精氨酸酶的編碼序列，該基因編碼序列全長969bp，帶有酶切位點XhoI和EcoRI ;用XhoI和EcoRI內切酶分別雙酶切PCR產物和空質粒載體，將目的基因與載體連接后轉化氨芐抗性平板，挑取若干個陽性轉化子，取其中一個擴增并提取質粒，進行XhoI和EcoRI內切酶雙酶切鑒定；提取重組質粒，將重組載體用BglII酶切使線性化，電擊轉化畢赤酵母；挑取陽性轉化子；通過RDB、MM和MD平板篩選，得到表型為his+muts的克隆子，進一步在搖床水平上進行誘導表達，通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測搖床水平上精氨酸酶的表達情況，從而篩選分泌表達精氨酸酶的重組子；從若干株帶有精氨酸酶基因的重組酵母中篩選到分泌表達精氨酸酶的重組子；樣品純化中，將酵母離心后取上清。樣品經過超濾濃縮，采用凝膠排阻層析進行精制；選用Sephacryl S-200作為樣品的精制層析柱；
[0036]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC進行純度檢測，結果顯示，獲得的重組精氨酸酶純度約為95%，獲得的人重組精氨酸酶保存于4攝氏度冰箱，試驗臨用前用細胞培養基稀釋至使用濃度。
[0037]實施例2:自噬抑制劑藥物的配方
[0038](I)氯喹的配制:取適量氯喹溶于純水配成10mmol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C，體外實驗用PRM1-1640培養基稀釋500-1000倍用于抑制細胞自嗤；
[0039](2)氯化銨的配制:取適量氯化銨溶于水配成0.4mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C。體外實驗時稀釋50-80倍用于抑制細胞自噬；
[0040](3)羥基氯喹的配制:取適量羥基氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲存液，用0.1ym的濾器過濾除菌后保存于4°C，體外實驗室稀釋500-1000倍用于抑制細胞自噬；
[0041](4) 3-MA的配制:取適量3-MA干粉配制成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于_20°C。體外實驗時稀釋50-200倍用于抑制細胞自噬；
[0042](5) LY294002的配制:取適量LY294002干粉配制成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于-20°C。體外實驗時稀釋50-100倍用于抑制細胞自噬；
[0043](6)巴伐洛霉素Al的配制:取適量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于-20°C，體外實驗時稀釋1000倍用于抑制細胞自嗤；
[0044](7)自噬抑制劑與精氨酸酶復合藥物用于體內或體外抗腫瘤，自噬抑制劑3-MA的使用濃度范圍為Ο-lmol/L，自噬抑制劑CQ的使用濃度范圍為0-50mol/L，羥基氯喹的使用濃度范圍為0-50mol/L，LY294002的使用濃度范圍為Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用濃度范圍為O-lOmol/L，精氨酸酶的使用濃度范圍為0-100IU/ml。
[0045]實施例3:人重組精氨酸酶能誘導黑色素瘤A375和乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7發生細胞自噬
[0046]A375細胞用3.2IU/ml的精氨酸酶處理24h后，進行石蠟包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察細胞亞顯微結構，結果如圖1A所示，給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現；將eGFP-LC3質粒轉入黑色素瘤A375中，再用3.2IU/ml的精氨酸酶處理24h，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀綠色熒光斑點，結果如圖1B顯示，給藥組細胞內有大量的熒光斑點，而對照組較少；
[0047]將收集到的黑色素瘤A375細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，加入相應抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色，A375細胞經過不同時間或不同濃度人重組精氨酸酶處理后,通過Western Blot的檢測，結果如圖1C和ID所示，與對照組相比，給予人重組精氨酸酶組的A375細胞的LC3II的表達水平增強。
[0048]實施例4:人重組精氨酸酶能抑制A375細胞和乳腺癌細胞的增殖
[0049]將適當濃度的A375、MDA-MB-231、MCF-7細胞種在96孔培養板內，加入不同濃度的精氨酸酶，體系終體積為100 μ L，培養72h，向每孔加入10 μ MTT液，在培養箱內放置4h，之后用含DMSO溶解，570nm下測量光密度值(0.D.)，結果如圖2A、2B、2C顯示，精氨酸酶處理72h顯著地抑制了細胞的增殖。
[0050]實施例5:抑制細胞自噬后細胞內相關蛋白的表達水平檢測
[0051 ] 用RIPA裂解液裂解抽取細胞總蛋白，定量后按每孔20 μ g蛋白量上樣進行蛋白電泳并轉膜進行Western blot，用ECL化學發光試劑盒進行化學發光，結果如圖4所示:經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理的A375細胞的LC3II的表達量高于對照組，經過20 μ M CQ和3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理后的A375細胞的LC3II的表達量高于3.2IU/ml人重組精氨酸酶單獨處理后的A375細胞。而經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶和2mM的3-MA處理后的MDA-MB-231細胞的LC3II的表達量低于3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理后的MDA-MB-231細胞；由于3-MA是一種PI3KIII抑制劑，PI3KIII在細胞自噬的調控中起重要的作用，其能與Beciln I等分子結合，參與調控自噬體膜的運輸；因此抑制PI3KIII將阻遏自噬體的形成，從而起到抑制細胞自噬的作用；從現象上看，由于自噬體膜的形成與運輸受阻，導致ATG8/LC3分子無法通過泛素化在自噬體膜上定位；所以LC3II分子的表達水平會因此下降，Western Blot的結果證明2mM的3-MA能抑制由3.2IU/ml人重組精氨酸酶所誘導的MDA-MB-231細胞誘發的自噬，而CQ是自噬溶酶體的抑制劑，CQ能造成溶酶體的堿化，使溶酶體酶失去活性，從而造成自噬體的堆積，這造成了自噬體無法在溶酶體內進行降解，導致了處于自噬體膜表面的LC3II分子的量增加，Western Blot的結果證明20 μ M的CQ能抑制由3.2IU/ml人重組精氨酸酶誘導的A375細胞的細胞自噬。
[0052]實施例6:抑制自噬能增強人重組精氨酸酶誘導的A375細胞凋亡
[0053]A375細胞經過人重組精氨酸酶和抑制劑處理72小時經過流式細胞檢測，將收集到的A375細胞用PBS洗I次，之后加入500μ1結合液和5μ1 Anexin V-FITC，避光室溫孵育15min，隨即進行流式細胞檢測，結果如圖4所示，經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理72h的A375細胞的細胞凋亡率高于對照組，而3.2IU/ml人重組精氨酸酶與20 μ M的CQ聯合干預的Α375細胞的細胞凋亡率顯著高于3.2IU/ml人重組精氨酸酶單獨處理的A375細胞。
[0054]實施例7:抑制自噬增強A375細胞中重組精氨酸酶引起的線粒體膜電位的降低
[0055]A375細胞經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶分別處理24h和72h，收集細胞，經JC-1染色，隨即進行流式細胞檢測，經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理后的A375細胞與對照組相比，線粒體膜電位明顯降低(圖5A)，線粒體膜電位抑制劑環孢霉素(CsA)減弱精氨酸酶在A375細胞中誘導的細胞自噬(圖5B)，增強精氨酸酶對A375細胞的殺傷作用(圖5C)，并且20 μ M CQ增強Α375中3.2IU/ml重組精氨酸酶引起的線粒體膜電位降低(圖OT)。
[0056]實施例8:重組精氨酸酶誘導A375細胞產生活性氧
[0057]A375細胞經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理72h，收集細胞，經過DCFH-DA標記，隨即進行流式細胞檢測，經過3.2IU/ml人重組精氨酸酶處理后的A375細胞與對照組相比，活性氧的產生量明顯增加(圖6)。
[0058]實施例9:多聚唾液酸的活化
[0059](I)將多聚唾液酸按10mg/ml多聚唾液酸與新鮮配制的10mM高碘酸鈉混合，置于20°C暗處攪拌5min ；
[0060](2)加入兩倍體積的乙二醇中和過量的高碘酸鈉，置于20°C暗處繼續攪拌30min ；
[0061](3)將氧化的多聚唾液酸置于0.01%碳酸銨緩沖液(ρΗ7.4)中4°C透析24h，透析袋應能截留3.5KDa的分子；
[0062](4)以分子量為8KDa的干燥聚乙二醇覆蓋反相透析濃縮多聚唾液酸溶液；
[0063](5)將透析液凍干，置于_40°C保存備用。
[0064]實施例10:多聚唾液酸修飾重組精氨酸酶的反應
[0065](I)將人重組精氨酸酶的緩沖體系置換為pH7.4Tris-Hcl緩沖液；
[0066](2)在4mg/ml氰基硼氫化鈉存在的情況下，活化的多聚唾液酸與人重組精氨酸酶摩爾比按50: I進行混合；
[0067](3)將反應容器置于35°C的環境中密閉攪拌反應24h ；
[0068](4)反應結束后用70%硫酸銨沉淀蛋白，4°C攪拌Ih后離心收集沉淀；
[0069](5)將沉淀用pH7.410mM的磷酸鹽緩沖液溶解并在相同的緩沖液中4°C透析24h ；
[0070]取活化的多聚唾液酸與純化的精氨酸酶按摩爾比50: I進行反應，控制氰基硼氫化鈉的用量為4mg/ml，蛋白濃度為lmg/ml，反應體系為5ml，35°C密閉攪拌反應48h ;對反應后的產物與1mM PBS pH7.4溶液中透析24h，濃縮反應產物并進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，實驗結果如圖7所示:與未反應的重組人精氨酸酶相比，經多聚唾液酸修飾的重組人精氨酸酶分子量明顯增加，一單位的多聚唾液酸的分子量為30KDa，反應后產物的分子量約為65KDa，與預期分子量大小一致(圖7)。
【權利要求】
1.一種細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，由一種或多種自噬抑制劑和精氨酸酶組成； 所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素Al、NH4C1、氯喹或羥基氯喹； 所述的精氨酸酶選自鼠源精氨酸酶、人重組精氨酸酶或長效化修飾的精氨酸酶。
2.按權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。
3.按權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，所述的精氨酸酶選自聚乙二醇修飾的人重組精氨酸酶或多聚唾液酸修飾的人重組精氨酸酶。
4.按權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，所述的長效化修飾的精氨酸酶是采用活化的多聚唾液酸末端第7位的單醛基與精氨酸酶的氨基進行反應獲得化學修飾長效精氨酸酶。
5.按權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶制成下述劑型的復方藥物:片劑、溶液、分散劑、膠束、乳劑、月旨質體或納米微球。
6.按權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物，其特征在于，所述的藥物中，細胞自噬抑制劑與精氨酸酶序貫使用。
7.權利要求1所述的細胞自噬抑制劑與精氨酸酶藥物復合物在制備治療腫瘤藥物中的用途。
8.按權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌和骨髓瘤。
9.按權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自黑色素瘤或乳腺癌。
10.按權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的細胞自噬抑制劑抑制精氨酸酶誘導的細胞自噬，抵消腫瘤由于細胞自噬而引起的對精氨酸酶治療的拮抗作用。
【文檔編號】A61P35/00GK104338134SQ201310334478
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】鞠佃文, 王子玉, 趙舒薇, 李玉彬, 曾賢, 范佳君, 王紹飛, 李力 申請人:復旦大學