表面展示sars雙價抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和應用，該病毒是由重組蛋白SP-N-TM和SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質粒并通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將該基因組DNA轉染家蠶細胞，在細胞內包裝得到的重組桿狀病毒；其中重組蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端連接GP64的信號肽SP，C-端連接GP64的跨膜域TM構成；SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端連接SP，C-端連接TM構成。該重組桿狀病毒將SARS病毒的N蛋白及RBD蛋白基因在病毒衣殼表面展示，具有良好的免疫原性。
【專利說明】表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒及其制備方法和 應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種表面展示SARS雙價抗原的重組桿 狀病毒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 嚴重急性呼吸綜合征（Severe Acute Respiratory Syndromes)，又稱傳染性非典 型肺炎，簡稱SARS，是一種因感染SARS冠狀病毒引起的新的呼吸系統傳染性疾病。主要通 過近距離空氣飛沫傳播，以發熱、頭痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等為主要臨床表現，嚴重 者可出現呼吸窘迫。本病具有較強的傳染性，在家庭和醫院有顯著的聚集現象。首發病例， 也是全球首例，于2002年11月出現在廣東佛山，并迅速形成流行態勢。2002年11月至 2003年8月5日，29個國家報告臨床診斷病例共8422例，死亡916例。報告病例的平均死 亡率為9. 3%。該病毒很可能來源于動物，由于外界環境的改變和病毒適應性的增加而跨越 種系屏障傳染給人類，并實現了人與人之間的傳播。
[0003] 雖然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期內被"消滅"或自動消失，SARS 在人群中再次出現的可能性很大。再次發生SARS疫情的時間，主要與病毒侵襲人體的時間 有關，不一定表現為冬春高發。動物攜帶病毒的季節性分布、人接觸感染動物的機會等都將 影響再次發生疫情的時間。動物仍然是病毒的可能來源，人群對SARS病毒仍然普遍易感， 其疫苗仍是目前的研究重點。
[0004] 目前SARS疫苗包括治療性疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定進 展，但也存在相應的問題，具體見下表。
[0005] 表 1
【權利要求】
1. 一種表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒是由重組蛋白 SP-N-TM和SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質粒通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組 進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉染家蠶細 胞，在家蠶細胞內包裝得到所述的表面展示SARS抗原N基因和RBD基因的重組桿狀病毒； 其中，所述重組蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白 GP64的信號肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構成； 所述重組蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白 GP64的信號肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構成。
2. 根據權利要求1所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 供體質粒為pFastBacDual，重組蛋白SP-N-TM的編碼基因插入到供體質粒pFastBacDual的 pl〇啟動子下，重組蛋白SP- RBD -TM的編碼基因插入到供體質粒pFastBacDual的pPolh 啟動子下，構建成重組轉座質粒后再與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組。
3. 根據權利要求2所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 重組蛋白SP-N-TM的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述重組蛋白SP-RBD-TM的氨基酸 序列如SEQ ID N0:2所示。
4. 根據權利要求3所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 重組蛋白SP-N-TM的編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述重組蛋白SP-RBD-TM 的編碼基因核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5. 根據權利要求4所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒，其特征在于，所述 家蠶細胞為家蠶BmN細胞。
6. 權利要求2飛任一所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特 征在于，步驟如下： (1) PCR擴增獲得桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因、SARS病毒的N蛋白 的編碼基因、SARS病毒的RBD蛋白的編碼基因和桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編 碼基因； (2) 通過重疊 PCR擴增的方法獲得由SP的編碼基因、N蛋白的編碼基因和 TM的編碼基因依次連接的重組基因 SP-N-TM，且在其5'和3'端分別引入 和幻7/7 I酶切位點；重疊 PCR獲得由SP的編碼基因、RBD蛋白的編碼基因和TM 的編碼基因依次連接的重組基因 SP-RBD-TM，且在其5'和3'端分別引入及麗7 I和I酶切位點；將重組基因 SP-N-TM連接到載體pFastBacDual的p 10啟動子下， SP-RBD-TM連接到載體pFastBacDual的pploh啟動子下，構建成重組轉座質粒； (3) 重組轉座質粒轉化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態細胞， 進行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養平板上進行藍 白斑篩選，避光培養4(T48h后挑取白斑，白斑繼續培養24?48h后抽提重組桿狀病毒基因組 DNA進行PCR鑒定； (4) 取步驟（3)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質體介導法轉染家蠶細胞， 發病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進行PCR鑒定，鑒定正確的即為表面展示 SARS雙價抗原的重組桿狀病毒； 所述PCR鑒定使用兩組引物，分別為SEQIDN0:5、SEQIDN0:7和SEQIDN0 :12構成 的引物組，以及SEQIDN0:6、SEQIDN0:13和SEQIDN0:18構成的引物組。
7. 根據權利要求6所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特征 在于，步驟（1)中擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因使用的引物核苷酸序 列如SEQ ID NO: 7?8所示；擴增SARS病毒N蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列如SEQ ID Ν0:9~10所示；擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 11?12所示。
8. 根據權利要求6所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒的制備方法，其特 征在于，步驟（1)中擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因使用的引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 13~14所示；擴增SARS病毒RBD蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列 如SEQ ID NO: 15?16所示；擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引 物核苷酸序列如SEQ ID NO: 17?18所示。
9. 權利要求1飛任一所述的表面展示SARS雙價抗原的重組桿狀病毒在制備SARS疫苗 中的應用。
【文檔編號】A61P31/14GK104293740SQ201310301800
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月18日 優先權日:2013年7月18日
【發明者】張耀洲, 閆晶晶, 舒特俊, 陳劍清, 蓋其靜, 趙紅玉 申請人:特菲(天津)生物醫藥科技有限公司