半乳凝素-9在系統性紅斑狼瘡或類似炎癥性疾病中的作用的制作方法

半乳凝素-9在系統性紅斑狼瘡或類似炎癥性疾病中的作用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療系統性紅斑狼瘡疾病或相類似機制的炎癥性疾病的藥物的應用。本發明提供一種治療系統性自身免疫疾病的方法，該方法包括將治療有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽，與藥物學可接受的載體一起給藥于有此需要的對象，其中所述的系統性自身免疫疾病得到有效治療或緩解。
【專利說明】半乳凝素-9在系統性紅斑狼瘡或類似炎癥性疾病中的作用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域。具體而言，本發明涉及半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療系統性自身免疫疾病的藥物的應用。所述的系統性自身免疫疾病包括系統性紅斑狼瘡疾病或相類似機制的炎癥性疾病。
【背景技術】
[0002]系統性紅斑狼瘡疾病(SLE)是一種原型系統性自身免疫疾病。成人系統性紅斑狼瘡診斷和治療指南(Guidelines for Referral and Management of Systemic LupusErythematosus in Adults, Arthritis Rheuml999 ;42:1785)指出該病包括全身癥狀和病癥，肌肉骨骼，皮膚，腎臟，腸胃系統，呼吸系統，心血管系統，網狀內皮組織，血液和神經系統均有病變。其中皮膚表現是SLE中最為常見的，此外，血清學異常包括抗核抗體，雙鏈DNA, SM，RNP, Ro/SSA和La/SSB的抗體，以及低補體水平。
[0003]SLE在美國每100，000人口中會發生40-50例。發病率為每年每十萬人中有2_8例新增病例。受到種族基因的影響，在美國SLE在亞洲人，黑人和加勒比海人以及夏威夷人更為常見。在英國，印度裔亞洲人的SLE發病率較高(ArthritisRheum.1998 ；41:1714-24.Hormonal, environmental, and infectious riskfactors for developing systemiclupus erythematosus.Cooper GS, Dooley MA, Treadwell EL, St Clair EW, Parks CG,Gilkeson GS.)。SLE顯著影響妊娠年齡的婦女可能與激素部分相關。該病可在任何年齡發病，兒童中，女性和男性的發病率之比為3: 1，在妊娠年齡期間，這個比例高達10: 1，而在老年人中降之為8: I。對于所有的SLE患者，女性與男性的整體發病率之比為9或10: I。約20%的患者在16歲之前發病，65%在16-65歲之間發病，而15%在55歲之后發病。
[0004]SLE可表現為各種器官的病變；疲勞(74-100% )、關節炎/關節痛(83_95%)、皮膚(80-91% )、發熱(40-80 % `)、體重減輕(44-60 % )、腎病(34-73 %)、腸胃疾病(38-44% )、肺病(24-98%)、心臟病(20-46%)、淋巴結病(21-50%)、脾臟腫大(9-20%)、肝腫大(7-25 % )、中樞神經系統癥狀(25-75 % ) (Systemic Lupus Erythematosus:Clinical and Laboratory Features,Klippel JH,Crofford LJ，Stone JH，Weyand CM editon Primer on the Rheumatic Diseases，12th edition，2001 ;335_346)
[0005]系統性紅斑狼瘡的臨床診斷分類目前是按照系統性紅斑狼瘡國際協作組(SLICC)在2009年ACR大會上公布了對ACR SLE分類標準的修訂版。該分類標準包括臨床標準11條:1.急性或亞急性皮膚狼瘡；2.慢性皮膚狼瘡；3.口腔或鼻咽部潰瘍；4.非瘢痕形成引起的脫發；5.炎性滑膜炎:醫生觀察到的兩個或以上腫脹關節或者伴有晨僵的壓痛關節；6.漿膜炎；7.腎臟:尿蛋白/肌酐異常(或24hr尿蛋白> 500mg)或紅細胞管型；8.神經系統:癲癇發作，精神異常，多發性單神經炎，脊髓炎，外周或顱神經病，腦炎(急性精神錯亂狀態)溶血性貧血；10.白細胞減少(< 4000/mm3，至少一次)或淋巴細胞減少(< 1000/mm3至少一次)；11.血小板減少(< 100，000/mm3，至少一次)；免疫學標準6條:
1.ANA高于實驗室正常參考值范圍；2.抗dsDNA抗體高于實驗室正常參考值范圍(ELISA方法則要兩次均高于實驗室正常參考值范圍)；3.抗Sm抗體；4.抗磷脂抗體包括狼瘡抗凝物，梅毒試驗假陽性，抗心磷脂抗體(至少兩次異?；蛑懈叩味?，抗_b2gpl ;5.低補體包括低C3、低C4、低CH50 ；6.直接Coombs試驗陽性(非溶血性貧血狀態)。確定SLE需符合
1.腎活檢證實為狼瘡腎炎且ANA陽性或抗dsDNA陽性或2.滿足四條標準，包括至少一條臨床標準和至少一條免疫學標準。。[0006]SLE的治療目前總的來說是缺乏系統性藥物治療方案的。目前的治療手段包括免疫抑制劑如環磷酰胺、甲氨蝶呤和霉酚酸嗎乙酯。對輕微的SLE的治療主要用非留類抗炎藥物和鎮痛藥治療發熱、關節炎等?？蛇m當增加抗瘧疾藥如羥氯喹和皮質類固醇以控制關節痛。中重度時采用皮質類固醇和類固醇如硫唑嘌呤、環磷酰胺等,但長期使用皮質類固醇和類固酉享藥物有可倉泛造成心血管并發癥。(Development of autoantibodies before theclinical onset of systemic lupus erythematosus.Arbuckle MRiMcClain MTiRubertoneMV，Scofield RH，Dennis GJ，James JA，Harley JB.N Engl J Med.2003 ；349:1526-33.)，不僅如此，長期使用皮質類固醇和類固醇藥物還可能造成骨質疏松，骨無血管性壞死，庫興樣特征，皮膚變化，肌肉萎縮和肌無力等等。臨床上一直在探索新的治療途徑。
[0007]1.干擾素-a (IFN- α )和漿細胞樣樹突細胞在SLE中的作用
[0008]1982年，Preble等在SLE患者的血清里發現了干擾素的活動(Preble 0T, BlackRJ, Friedman RM, Klippel JH, Vilcek J.Science.1982 ；216:429-31.Systemic lupuserythematosus:presence in human serum of an unusual acid-labile leukocyteinterferon) ; 1990年，Ronnblom等在使用I型干擾素時發現干擾素(IFN)-α/ β可誘導自身免疫(R6nnblom LE, Aim GV, Oberg KE.J Intern Med.1990 ；227:207-10.Possibleinduction of systemic lupus erythematosus by interferon-alpha treatment in apatient with a malignant carcinoid tumour.)。之后大量的有關 IFN-α 誘發產生包括抗核抗體，抗雙鏈DNA抗體在內的紅斑狼瘡臨床病例被發現；活動期SLE患者血清IFN-水平升高，并與疾病活動性、抗dsDNA滴度顯著相關。
[0009]I型IFN是由13種功能性IFN-α基因、I種IFN-β基因、I種IFNF-Θ基因、I種IFN-K基因和I種IFN-ω基因表達的細胞因子組成。(Immunol Rev.2005 ；24:9-26)。
[0010]幾乎所有的細胞都可以被病毒和細菌刺激產生I型IFN，但漿細胞樣樹突細胞(pDC)是天然的產生IFN細胞，比其他細胞類型高出1000倍。用單鏈RNA(ssRNA)、細菌DNA中的低甲基化CpG、或自身抗原-抗體免疫復合物刺激細胞的Toll樣受體(TLR)可誘導I型IFN的產生。
[0011]樹突細胞是一類在免疫應答與免疫耐受中發揮重要作用的免疫細胞，其最突出的功能特點是在病毒刺激下產生大量的I型干擾素，因此又被稱為是天然I型干擾素產生細胞。樹突狀細胞是迄今所知的功能最強的抗原提呈細胞，Toll樣受體(Toll-likereceptors, TLRs)是其重要的模式識別受體，在DCs分化和功能成熟中發揮重要作用。它通過識別細菌、蟲體、真菌和病毒等保守的病原相關分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns, PAMPs)而捕獲病原體,刺激DCs分化和功能成熟。
[0012]未成熟漿細胞樣樹突細胞主要通過TLR-NF- κ B途徑識別并捕獲抗原，在其成熟過程中同時發生遷移，由外周組織進入次級淋巴器官的T細胞依賴區，有效地將抗原提呈給初始T細胞并使之激活，觸發免疫應答。多種因素可影響漿細胞樣樹突細胞功能，如脂多糖、病毒、免疫抑制劑、T調節細胞、細胞因子、腫瘤抗原等。
[0013]漿細胞樣樹突細胞它在抗病毒、抗HIV感染以及自身免疫反應等方面均發揮十分重要的作用(Fitzgerald-Bocarsly, Jihong Dai, Sukhwinder Singh, et alPlasmacytoiddendritic cells and type I IFN:50years of convergent history.Cytokine &Growth Factor Reviews.2008，19:3-19)。通過大量產生I型干擾素、細胞因子、趨化因子以及與其它細胞之間的相互作用等途徑，漿細胞樣樹突細胞廣泛地參與到機體的固有免疫和適應性免疫應答過程中。它可以調控NK、T、B等細胞參與免疫反應的強度、持續時間以及應答方式，從而在腫瘤、感染和自身免疫性疾病過程中均發揮十分重要的功能(Colonna M.Toll-like receptors and IFN-alpha:partners in autoimmunity.J ClinInvest.2006，116:2319-22)。
[0014]研究表明:不同的病毒在初次感染機體時，一般都可誘導漿細胞樣樹突細胞產生I型干擾素來抵抗病毒感染，并遞呈抗原給T細胞和B細胞誘導特異性的免疫應答。持續性病毒感染患者當再次感染時，漿細胞樣樹突細胞的免疫剌激功能降低，從這些病人體內分離的衆細胞樣樹突細胞表現出很弱的T細胞剌激增殖作用(van der Molen RG，SprengersD，Binda RS, et al.Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendriticcells of patienwith chronic hepatitis B.Hepatology.2004，40:738_7460 MurakamiH，Akbar SM，Matsni H，et al.Decreased interferon—alphaproduction and impairedT heIperIpolarization by dendritic cells from patient with chronichepatitisC.Clin Exp.2004,137:559_565。Feldman S，Stein D，Amrute S，et al.Decreasedinterferon alpha production in HIV-1nfected patients correlates with numericaland functional deficiencies in circulating type2dendritic cell precursors.ClinImmunol.2001，101:201-210)。病毒可通過直接感染使漿細胞樣樹突細胞失能(PatteixmS，RaeA, HockeyN, et a·l.Plasmacytoid dendritic cells are highly susceptible tohuman immunodeficiency virus type I infection and release infectious virus.J Viml.2001，75:6710_6713。Mengshol JA, Golden-Mason L, Castel-blanco N，etal.1mpaired plasmacytoid dendritic cell maturation and differential chemotaxisin chronic hepatitis C virus !associations with antiviral treatment outcomes.Gut.2009,58:964-73o Amjad M，Abdel-Haq N，Faisal M，Kamal M，Moudgal V.Decreasedinterferon-alpha production and impaired regulatory function of plasmacytoiddendritic cells induced by the hepatitis C virus NS5protein.MicrobiolImmunol.2008,52(10):499-507)。
[0015]HIV感染者和艾滋病人外周血中漿細胞樣樹突細胞數目減少，功能降低，而在長時間存活的HIV陽性病人，其外周血漿細胞樣樹突細胞的數目與HIV感染者、艾滋病人，甚至正常人相比并未減少反而增多，并有活性的增強。漿細胞樣樹突細胞高的HIV感染者其外周血HIV的RNA檢測到低，甚至檢測不到。體內研究證實漿細胞樣樹突細胞及其分泌的IFN-α可抑制HIV的復制。進一步的研究發現艾滋病病人外周血漿細胞樣樹突細胞低下與巨細胞病毒感染、進展性多灶性淋巴細胞浸潤性腦炎和卡氏肺囊蟲的發生有關(SoumefisV，Scott I，Liu YJ, et al.Natural typelIFN producing cells in HIV infection.HumInmaunol.2002，63:1206_1212。Soumelis V，Scott I，Gheyas F，et al.Depletion ofcirculating natural typellFN-producing cells in HIV-1nfected patients.Blood,2001,98:906-912)。因此，增強漿細胞樣樹突細胞分泌IFN-α的試劑可以為有效治療免疫功能低下所導致的病毒長期感染及HIV感染提供新的途徑。
[0016]研究表明漿細胞樣樹突細胞在系統性紅斑狼瘡疾病的發病中起了非常重要的作用。在活動期SLE病人的外周血中發現了可誘導漿細胞樣樹突細胞產生I型干擾素的誘導因子。在SLE的發病機制中，漿細胞樣樹突細胞及其分泌的IFN-a起到了至關重要的作用。SLE病人組織損傷產生的凋亡細胞和血清中的自身抗體結合后，形成免疫復合物，刺激漿細胞樣樹突細胞分泌大量的IFN-α，而分泌的IFN-α可誘導單核細胞向樹突細胞分化，單核細胞轉化的樹突細胞攝取凋亡細胞后遞呈自身抗原給自身反應性T細胞,并促進自身反應性B細胞的增殖，大量產生自身抗體，自身抗體的產生又加劇了組織的損傷，形成了一個惡性的循環(Banchereau J, Paczesny S, Blanco P, et al.Dendritic cells:controllersof the immune system and a new promise for immunotherapy.Ann NY Acad Sci,2003,987:180-187)。
[0017]2.半乳凝素和半乳凝素-9
[0018]半乳凝素(Galectin)是一類β _半乳糖苷結合蛋白的總稱，屬于凝集素家族，至今為止已有15位半乳凝素家族成員被發現，他們均含有以下2個特性:1)含特征性的氨基酸序列。由大約130個高度保守的氨基酸序列組成糖識別結構域(carbohydraterecognition domain, CRD) ；2)對β-半乳糖苷的親和性。半乳凝素屬于可溶性蛋白質，存在于細胞中或分泌到胞外。 [0019]半乳凝素缺乏信號肽，它在胞質中合成，不經過內質網、高爾基體，而由小泡直接分泌到細胞外。這種特殊的分泌方式避免了半乳凝素過早地和新生成的糖蛋白上的寡糖黏附。半乳凝素通過與細胞表面復合糖上的β_半乳糖苷結合，而發揮調節細生存和信號轉導的生物學功能。半乳凝素的多價性會引導特定細胞表面的糖受體交聯、凝集，與細胞的信號轉導有關。半乳凝素家族個體成員的多價性在發揮不同生物學效應中起重要作用，具有參與細胞生長和凋亡、細胞黏附、血管形成及mRNA剪切等多種生物學功能，與許多腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移密切相關。
[0020]半乳凝素-9 (Galectin-9)是1997年由Wada等從鼠胚腎組織中分離出來的，隨后由Tureci等在結節性硬化型霍奇金淋巴瘤的腫瘤組織中克隆并命名(WadaJ，Kanwar YS.1dentification and characterization of galectin-9, a NovelB-galactoside-binding mammalian lectin.J Biol Chem，1997，272:6078-6086.Tureci0，SchmittH，Fadle N.et al Molecular definition of a novelhuman galectin which isimmunogenic in patients with hodgkin’sdisease.J B iolChem，1997，272:6416-6422)。它具有半乳凝素家族成員特征性的保守氨基酸序列并在過敏反應中能起到誘導嗜酸粒細胞聚集和活化的功能。半乳凝素-9在人體組織中廣泛分布于肺臟、胰島細胞、肝臟、扁桃體、腸管和多種免疫細胞中，且在多種腫瘤組織中也有表達。
[0021]研究表明，半乳凝素-9廣泛參與了體內的調節細胞的發育、分化，誘導細胞凋亡以及抗腫瘤等多種生物學活動。半乳凝素-9的特異性受體現在發現的有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白-3 (Tcell Igmucin-3, Tim-3),半乳凝素-9/Tim_3結合后的信號通路是通過:I)誘導T細胞凋亡在免疫耐受的誘導及自身免疫病防治中發揮重要作用；2)活化樹突狀細胞促進機體的免疫應答。但是半乳凝素-9通過何種機制介導不同的功能的機理目前仍不清楚。
[0022]半乳凝素-9的誘導細胞凋亡功能:Sdinchez-Fueyo等的研究發現(Sdinchez-FueyoA, Tian J, Picarella D, et al.Tim_3inhibits Thelper type 1-mediated auto—anda.11oimmune responses and promotesimmunological tolerance.Nat Immunol,2003,4:1050-1052.)半乳凝素-9對于Thl細胞免疫的調節是負調節作用，半乳凝素_9結合Tim_3分子后可以下調自身免疫性疾病，誘導免疫耐受，導致了 T效應細胞的凋亡。這在自身免疫性糖尿病小鼠(Chou FC, Shieh SJ, Sytwu HK.Attenuation of Thlresponsethroughgalectin_9and Tcell Ig mucin3interaction inhibits autoimmunediabetes in NODmice.Eur J Immunol，2009，39:2403-2411]模型，以及炎性腸道疾病的小鼠模型[Li X，Chen G, Li Y, et al.1nvolvement of T cell Ig mucin-3 (Tim-3) in the negativeregulation of inflammatory bowel disease.Clin Immunol, 2010,134:169-177]都得至Ij的證實。在對類風濕性關節炎患者外周血⑶4+T細胞的研究中發現Tim-3可能直接參與類風濕性關節炎的發病，Seki 等(Seki M, Oomizu S, Sakata KM, et al.Galectin_9suppressesthegeneration of Thl7, promotes the induction of regulatory T cells, andregulates experimental autoimmune arthritis.Clin Immunol, 2008,127:78-88)。
[0023]經研究證明，半乳凝素-9與Thl7細胞表面的Tim-3分子結合可以誘導Thl7細胞凋亡，并可促進調節性T細胞因子的分泌，緩解類風濕性關節炎癥狀。同樣在多發性硬化實驗性自身免疫性腦脊髓炎的動物模型中，半乳凝素_9/Tim-3通路通過誘導Thl效應細胞凋亡，降低了自身免疫性EAE小鼠的發病程度及死亡率(Zhu C，Anderson AC，Schubart A,et al.The Tim-3ligand galectin-9negatively regulates T helper type I immunity.NatImmunoI, 2005,6:1245-1252)。
[0024]半乳凝素-9的腫瘤免疫功能:半乳凝素-9可誘導骨髓瘤細胞凋亡和影響腫瘤細胞轉移。重組半乳凝素-9可通過活化了 JNK和P38-MAPK信號通路和caspase8、9、3參與的細胞凋亡途徑實現對5種骨髓瘤細胞的增殖抑制(Kobayashi T, Kuroda J, AshiharaE, et al.Galectin-9exhibitsant1-mye1ma activity through JNK and p38MAP kinasepathways.Leukemia, 2010, 24:843-850)。半乳凝素-9可以通過作用于Jurkat細胞表面的N-聚糖誘導 Jurkat 細胞凋亡(Lu LH, Nakagawa R, Kashio Y, et al.Characterization ofgalectin-9-1nduced death of Jurkat T cells.J Biochem，2007，141:157-172)。乳腺癌細胞中高表達半乳凝素-9的亞克隆細胞MCF-7在體外培養增殖時表現為聚集成簇，而低表達半乳凝素 _9 的亞克隆細胞不聚集(Irie A, Yamauchi A, Kontani K, et al.Galectin_9asa prognosticfactor with antimetastatic potential in breast cancer.ClinCancerRes, 2005,11:2962-2968)。說明半乳凝素_9可誘導乳腺癌細胞的聚集，影響細胞的遠程轉移。
[0025]目前的研究局限在自身免疫性糖尿病小鼠，炎性腸道疾病的小鼠，多發性硬化實驗性自身免疫性腦脊髓炎的動物模型中，在臨床病例中類風濕性關節炎患者外周血和體外腫瘤細胞上也有過初步的探討，但目前尚無半乳凝素-9在SLE疾病上的作用的研究報到。在治療SLE疾病的機理上，把抑制漿細胞樣樹突細胞產生過多的IFN-α，當作有效治療和緩解SLE疾病發生和進行的有效途徑和手段。
[0026]2.1.半乳凝素-9及其亞型
[0027]半乳凝素-9是在人類中由LGALS9基因編碼的蛋白質。(Tureci O, Schmitt H，Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U (1997)." Molecular definition of a novel humangalectin which is immunogenic in patients with Hodgkin' s disease".J BiolChem272(10):6416-22; " Entrez Gene:LGALS91ectin, galactoside-binding, soluble,9(galectin9) ".http://www.ncb1.nlm.nih.gov/sites/entrez ? Db = gene&Cmd =ShowDetailView&TermToSearch = 3965.)作為半乳凝素家族一員，半乳凝素-9含有兩個糖識別結構域(carbohydraterecognition domains, CRD)結構，即 N 端 CRD(含有 148個氨基酸)和C端CRD (含有149個氨基酸)，兩者由一條肽鏈連接。依據其肽鏈長度的不同，可將半乳凝素-9分為三類:長鏈半乳凝素-9(galectin9L，肽鏈58個氨基酸，分子量約43，500)、中鏈半乳凝素_9(galectin9M，肽鏈26個氨基酸，分子量約39，900)和短鏈半乳凝素-9 (galectin9S,肽鏈14個氨基酸，分子量約38700)。(TureciO, SchmittH,FadleN,PfreundschuhM and SahinU.Molecular definition of a novel human galectinwhich is immunogenicin patients with Hodgkin' s diseasel997.J.Biol.Chem.272,6416-6422.MatsumotoR, MatsumotoH, SekiM, HataM, AsanoY, KanegasakiS, StevensRL andHirashimaM.Human ecalectin,a variant of human galectin-9,is a novel eosinophilchemoattractant produced by T lymphocytes1998.J.Biol.Chem.273,16976-16984)
[0028]2.2.半乳凝素-9的衍生物
[0029]半乳凝素-9可以通過改進蛋白質結構來加強或減弱其功能，如在基因的某一點的定點突變、或一個/幾個基因的缺失突變、或插入基因片段。也可利用與Fe或白蛋白等的融合蛋白以及化學修飾 等形式來延長其代謝。
[0030]長效的蛋白質藥物的技術方法包括:蛋白藥物的化學修飾、蛋白質融合、微囊化/納米粒、糖基化、構建抗蛋白酶突變體等。
[0031]化學修飾是將分子量小的蛋白質藥物共價連接到具有較大分子量的分子上，例如聚乙二醇，共價連接到大分子上能減小免疫原性，改善可溶性和生物學利用度，以及增加抗蛋白水解作用，同時也能夠延長半衰期。聚乙二醇(polyethylenelycol, PEG)是由環氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，PEG類修飾劑和其他修飾劑相比，具有無毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相對分子量范圍寬，選擇余地大等優點。而且PEG可以將它的許多優良特性賦予修飾后的生物分子。經聚乙二醇共價修飾后，蛋白質藥物的相對分子質量有所增加，減少了藥物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的穩定性，降低免疫原性，這些改變均有利于延長藥物在體內的半衰期，從而，蛋白質藥物的藥代動力學和藥效性質得到明顯改善。1991年，第一種經聚乙二醇修飾的蛋白質藥物-PEG腺苷脫氨酶被FDA批準上市，用于治療一種嚴重的兒童免疫缺陷癥。2001年，PEG修飾的干擾素(PEG Intron)獲FDA批準上市，用于治療慢性丙型肝炎。
[0032]蛋白質融合是將兩個或多個基因的編碼區首尾連接，由同一調控序列控制構成的基因表達產物。此技術具有設計簡單，構建時不需要插入連接序列而直接在C端或N端融合。常選用人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fe片段應用最為廣泛。人血清白蛋白是血漿中含量最多的蛋白，分子量67kDa，它在血管和血管外室的循環中分布廣，半衰期可達到19天，且結構非常穩定，無明顯的免疫原性，是血液中重要的物質輸送和藥物運輸載體，所以它成為藥物設計理想的載體蛋白，用于改善藥物的半衰期，延遲藥物清除，增加藥物暴露，減少注射頻率，改善病人對治療的順從性和耐受性。
[0033]另一種蛋白質融合技術是Fe融合?？贵wFe段所特有的生物學功能與某些多肽或蛋白融合也可增加該蛋白質的血漿半衰期。人IgG免疫球蛋白是體內的主要抗體，它的半衰期約為20天。IgG融合蛋白的構建方式大多是將IgG的Fe (Hinge CH2，CH3)片段或CH(CHlHinge CH2，CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連。
[0034]微囊化技術也是一種長效的蛋白質藥物的技術，它能增強治療因子的藥代動力學特性，改進藥物穩定性以及使藥物靶向釋放等。用微囊包埋蛋白質和多肽藥物，不僅可以通過緩釋作用實現長效皮下注射制劑，而且可以通過微囊表面和粒徑的設計，實現口服、黏膜給藥、吸入等新劑型。技術的原理是將藥物活性部分包封于聚合層中，通過皮下或肌肉給藥，聚合層隨著時間減少，使藥物從微囊中緩慢持續釋放，這有利于穩定藥物，減少胃腸道酶的破壞，改變其體內運轉過程，延長藥物在體內的作用時間。Medus持續釋放系統也被用于蛋白質藥物緩釋過程中，它是由多聚L-谷氨酸骨架組成，帶有疏水的生育酚分子，形成毫微球粒的膠體懸液。由于毫微球粒的疏水區域的藥物相互作用產生了持續釋放藥物的效果。在體內，蛋白質藥物被生理溶液中內源蛋白代替，導致藥物緩釋。蛋白質藥物最高濃度顯著降低，藥物釋放明顯延長。
[0035]抗蛋白酶突變體:因為蛋白質很容易被內源血清中或組織中蛋白酶分解，并且蛋白酶對蛋白的降解可以發生在吸收、分布及排泄等各個階段，這就直接影響藥物的體內半衰期、生物利用度、血漿清除率等參數。將一個或多個抗蛋白水解突變體引入到生物活性分子上，是長效的蛋白質藥物的藥物設計和發展的要點。這些變體發生細小的構象變化，導致增強抗蛋白水解作用。
[0036]糖基化:蛋白質表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動力學性質、生物活性和穩定性等，并且，糖基化是某些蛋白質發揮生物活性所必需的。對比治療性蛋白質的糖基化形式和非糖基化形式，一方面蛋白質藥物表面增加了側鏈，提高蛋白質穩定性，阻礙蛋白酶對蛋白藥物的降解作用，另一方面使蛋`白質藥物分子量增大，減少腎小球濾過。
[0037]本領域的技術人員應該理解，本文引用的參考文獻不應視為承認是請求保護的本發明的現有技術。

【發明內容】

[0038]本發明人對半乳凝素對漿細胞樣樹突細胞的影響進行了一系列的研究，對照了在各類刺激物影響下I型干擾素分泌的情況，發現半乳凝素-9能夠抑制在系統性紅斑狼瘡疾病中被激活的樹突細胞I型干擾素的分泌，從而起到抑制系統性紅斑狼瘡疾病的病理發展，減緩癥狀的作用。因此，本發明提供一種新型的治療系統性紅斑狼瘡疾病或相類似機制的炎癥性疾病的方法。具體地，所述方法使用半乳凝素-9進行。
[0039]另外，本發明提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療系統性紅斑狼瘡疾病或相類似機制的炎癥性疾病的藥物的應用。
[0040]在本發明的第一方面中，本發明提供一種治療系統性自身免疫疾病的方法，該方法包括將治療有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽，與藥物學可接受的載體一起給藥于有此需要的對象，其中所述的系統性自身免疫疾病得到有效治療或緩解。
[0041]在一個實施方案中，所述系統性自身免疫疾病是系統性紅斑狼瘡疾病(SLE)或相類似機制的炎癥性疾病。
[0042]在一個實施方案中，所述半乳凝素-9是是長鏈、中鏈，或短鏈半乳凝素_9。
[0043]在一個實施方案中，所述半乳凝素-9包括N端糖識別結構域CRD和C端糖識別結構域CRD。在一個優選實施方案中，所述半乳凝素-9是氨基酸序列SEQ ID No:l。
[0044]在一個實施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是化學修飾的半乳凝素_9。在一個進一步的實施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是聚乙二醇修飾的半乳凝素_9。
[0045]在一個實施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是含有半乳凝素-9序列的融合蛋白。在一個優選的實施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。在又一個實施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9與免疫球蛋白(IgG)的Fe片段的融合蛋白。
[0046]本發明還提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療系統性紅斑狼瘡疾病或相類似機制的炎癥性疾病的藥物的應用。其中術語“乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽”具有與上述相同的定義。
[0047]在本發明的第二方面中，本發明還提供一種調節體內干擾素水平的方法，該方法包括將有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽，與藥物學可接受的載體一起給藥于有此需要的對象，其中所述的體內干擾素水平得到調節。在一個進一步實施方案中，所述調節是降低。
[0048]在一個實施方案中，其中所述干擾素是I型干擾素。
[0049]本發明還提供乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備調節體內干擾素水平的藥物的應用。其中術語“乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽”具有與上述相同的定義。
[0050]在本發明的第三方面中，本發明提供一種抑制漿細胞樣樹突細胞產生干擾素能力的方法，所述方法包括使半乳凝素-9或其活性衍生物接觸漿細胞樣樹突細胞。
[0051 ] 在本發明的第四方面中，本發明還提供一種抑制炎癥的方法，該方法包括將有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽，與藥物學可接受的載體一起給藥于有此需要的對象，其中所述的炎癥得到有效抑制。
[0052]在一個實施方案中，所述炎癥是由系統性紅斑狼瘡或相類似機制的炎癥性疾病引起的。在另一個實施方案中，所述炎癥是由I型干擾素引起的。
[0053]本發明還提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療由I型干擾素引起的炎癥的藥物的應用。
[0054]本領域技術人員應該理解，術語“半乳凝素-9活性變種”包括任何與半乳凝素-9具有大致相同的功能和/或生物特性(如結合受體的能力)和/或大致相同結構(即氨基酸序列)的化合物或復合物。術語“半乳凝素-9活性衍生物”包括任何含有半乳凝素-9或半乳凝素-9活性變種的化合物或復合物。
[0055]從本文提供 的其它描述，包括不同實施例，本發明的其他特征和優點將是顯而易見的。所提供的實施例舉例說明在實踐本發明中有用的不同組分和方法。實施例不限制請求保護的本發明?；诒竟_內容，本領域技術人員可以鑒定和采用對于實踐本發明有用的其他組分和方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特征和優點將更明顯，其中:
[0057]圖1.人半乳凝素-9蛋白(長鏈)序列(SEQ ID No:1)；
[0058]圖2.人樹突細胞(2萬個細胞)在不同培養條件下分泌IFN-a的情況。在培養液中加入各種刺激物共培養16個小時，其中一組加有Galectin-9 (4ug/ml)，用ELISA方法測定 IFN-a。
[0059]圖3.人樹突細胞(2萬個細胞)在與CpG2216并分別在不同濃度的人重組Galectin-9蛋白或Galectin-1蛋白的條件下共培養16個小時，用ELISA方法測定IFN_a分泌情況。
【具體實施方式】
[0060]下文提供了實施例以進一步舉例說明本發明的不同特征。這些實施例僅是用于舉例說明對于實踐本發明有用的方法。這些實施例對請求保護的本發明不構成限制。
[0061 ] 實施例1重組人半乳凝素-9 (Gal-9)蛋白的表達:
[0062]通過化學合成的方法，設計合成重組人Gal-9蛋白基因的序列(SEQ ID No:2)，其序列包括長度為Ala2-Thr323共322AA，(NCBI Accession#BAA31542)，前端加入與表達載體相連的Not I酶切位點，6個His(用于親和層析，與鎳柱結合，減少純化步驟)和EK酶切位點，還包括終止密碼子TAA，·及克隆用KpNI限制性內切酶接頭共9bp。
[0063]用限制型內切酶Not I和KpNI將上述重組人Gal_9蛋白基因單體切下，與經NotI及KpN I酶切的載體pET32a連接，轉化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉化子。經質粒提取，酶切鑒定后證明重組人Gal-9蛋白基因單體已克隆至pET32a中。用CaCl2法將pET32a轉化大腸桿菌BL21/DE3感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉化子，經質粒檢測和酶切分析獲得含有pET32a的重組轉化子BL21/pET32a。
[0064]利用大腸桿菌工程菌BL21/pET32a生產重組人Gal_9蛋白。挑取大腸桿菌工程菌BL21/pET32a，接種于LB培養基中，接種量I~2% V/V，于30°C培養過夜，次日在無菌條件下將上述培養好的種子培養基按1: 10V/V或1: 5V/V接種于發酵培養基上，30°C發酵至0.D600達到0.4~0.8，升溫至42°C誘導，3~5小時后離心收菌；取少量細胞加2X上樣緩沖液，按標準做SDS-PAGE凝膠電泳，經誘導的BL21/pET32a的碎菌后的上清在20kD的位置出現一條新的蛋白帶，轉化PET32空載體的BL21/DE3菌和經誘導的BL2 l/pET32a的碎菌后的沉淀中不出現此條帶，證明重組蛋自在BL21/pET32a中誘導可溶表達。表達的重組蛋白的純化是將上述收集菌體用NaCl加磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4°C離心，收集上清，得粗提液。將粗提液進行SephaCryl5200分子篩純化，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白，其純度可達90%以上。
[0065]檢測重組蛋白是利用抗體結合活性的試驗。在96孔板中每孔包被重組蛋白樣品IOOul，37°C，Ih ;孔以IOOul的1%的BSA封閉，37°C，lh ;每孔加入抗人Gal_9蛋白抗體(購自Abcom公司)，37°C，Ih ;每孔加IOOul 二抗的1: 1000辣根過氧化物酶標記抗體，37°C，Ih;經ELISA檢測表明本發明提取的重組蛋白與人Gal-9蛋白抗體結合活性強，每孔包被ng水平重組蛋白即可獲得明顯的檢測信號，結果顯示本發明提供的重組蛋白可用于抗體的檢測。
[0066]實施例2人漿細胞樣樹突細胞的培養以及影響漿細胞樣樹突細胞I型干擾素分泌的研究
[0067]材料和方法:
[0068]R848 (I μ g/mL)(購自 InvivoGen, San Diego, CA)
[0069]CpG typeA 寡脫氧核苷酸鏈(2216，5 μ Μ)，type B (2006，5 μ Μ)，type C(C274,5 μ Μ)
[0070]Y-輻射的單純皰疹病毒(HSV)-1 (KOS strain ；10PFU/cell)
[0071]流感病毒(PR8strain；IOPFU/cell)
[0072]仙臺病毒(Sendaivirus) (Cantellstrain ；5PFU/cell)
[0073]重組Galectin-1 (購自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0074]重組人GM-CSF(lOOng/mL,購自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0075]重組人IL-4(200ng/mL,購自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0076]IFN-α ELISA kit(PBL, Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)
[0077]人CD14 微珠(購自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0078]BDCA4+分離試劑盒(購自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0079]抗人CD123-PE
[0080]抗人CD14-PE
[0081]抗人BDCA2-FITC
[0082]抗人CD 11 c-APC
[0083]抗人CD4-APC_Cy7
[0084]實驗步驟:
[0085]人漿細胞樣樹突細胞的培養。人外周血單核細胞獲取是采新鮮抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度離心法分離患者外周血的單個核細胞。PBS洗去血小板，漿細胞樣樹突細胞的分離是利用流式細胞分選儀進行的(FACS Aria，BD Biosciences,Sunnyvale, CA)。經過抗-CD123-PE ;抗-CDlIc-APC 或抗-CDllc-PE ;FITC_ 標記的 mAbs 和抗-CD4-APC-Cy7混合物的篩選將CD123high/CDllc7lineage7CD4+漿細胞樣樹突細胞分離出來，并按照BDCA2的標準分離純度達到99%以上。臺盼藍染色，細胞活率須> 98%。
[0086]部分研究中在分離患者外周血的單個核細胞后，將懸浮單個核細胞利用流式細胞分選儀進行的ant1-⑶14-PE的的篩選或用⑶14磁珠將⑶14+細胞分離出來。⑶14+單個核細胞細胞懸液鋪在培養皿中，加入擴增漿細胞樣樹突細胞培養液，其為含100ng/ml GM-CSF和200ng/ml IL-4。培養5天后，獲得未成熟的樹突細胞。
[0087]將細胞濃度為I X IO5個/200uL，接種于96孔培養板，200uL/孔，分別加入R848，CpG,流感病毒(PR8strain ;10PFU/cell),仙臺病毒(Cantellstrain ;5PFU/cell),血清等，其中一組加入人重組半乳凝素_9(4ug/ml)然后置于37%，5% CO2培養箱內培養16小時。
[0088]IFN-a因子的檢測。培養16小時的上清轉入獨立1.5mL離心管中。以IFN kit檢測上清液中的I型干擾素的含量，具體操作參照試劑盒說明書進，用酶標儀(A450nm波長)測定各孔吸光度，與標準曲線對照，求出IFN值。
[0089]結果如圖2所示:
[0090]人樹突細胞(2萬個細胞/每孔)在不同培養條件下的分泌IFN-a情況。在培養液中加入各種刺激物共培養16個小時,其中一組加有Galectin-9 (4ug/ml)，用ELISA方法測定IFN-a。
[0091]實施例3半乳凝素-9對漿細胞樣樹突細胞I型干擾素分泌的抑制作用的研究
[0092]材料和方法:
[0093]R848 (I μ g/mL)(購自 InvivoGen, San Diego, CA)
[0094]CpG typeA 寡脫氧核苷酸鏈(2216，5 μ Μ)，type B (2006，5 μ Μ)，type C(C274,5 μ Μ)
[0095]Y-輻射的單純皰疹病毒(HSV)-1 (KOS strain ；10PFU/cell)
[0096]流感病毒(PR8strain；IOPFU/cell)
[0097]仙臺病毒(Cantellstrain；5PFU/cell)
[0098]重組Galectin-l (R&D Systems, Minneapolis, MN) [0099]重組人GM-CSF(lOOng/mL,購自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0100]重組人IL-4(200ng/mL,購自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0101]IFN-α ELISA kit(PBL, Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)
[0102]人CD14 微珠(購自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0103]BDCA4+分離試劑盒(購自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0104]抗人CD123-PE、抗人 CD14-PE、抗人 BDCA2-FITC、抗人 CDllc_APC、抗人CD4-APC-Cy7
[0105]實驗步驟:
[0106]人漿細胞樣樹突細胞的培養。人外周血單核細胞獲取是采新鮮抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度離心法分離患者外周血的單個核細胞。PBS洗去血小板，漿細胞樣樹突細胞的分離是利用流式細胞分選儀進行的(FACS Aria，BD Biosciences,Sunnyvale, CA)。經過抗 CD123-PE ;抗 CDlIc-APC 或抗 CDllc-PE ;以及 FITC-標記的 mAbs和抗⑶4-APC-Cy7混合物的篩選將⑶123high/⑶Ilc7lineage7⑶4+漿細胞樣樹突細胞分離出來，并按照BDCA2的標準分離純度達到99%以上。臺盼藍染色，細胞活率須> 98%。
[0107]部分研究中在分離患者外周血的單個核細胞后，將懸浮單個核細胞利用流式細胞分選儀進行的抗CD14-PE的的篩選或用CD14磁珠將CD14+細胞分離出來。CD14+單個核細胞細胞懸液鋪在培養皿中，加入擴增漿細胞樣樹突細胞培養液，其為含100ng/ml GM-CSF和200ng/ml IL-4。培養5天后，獲得未成熟的樹突細胞。
[0108]將細胞濃度為1父105個/200此，接種于96孔培養板，2001117孔，培養基中加入CpG2216用來刺激樹突細胞的分泌并分為二組，分別加入梯度濃度的人重組半乳凝素-9或半乳凝素-1 (4ug/ml)然后置于37%，5% CO2培養箱內培養16小時。
[0109]IFN-a閔子的檢測。培養16小時的上清轉入獨立1.5mL離心管中。以IFN kit檢測上清液中的I型干擾素的含量，具體操作參照試劑盒說明書進行，用酶標儀(A450nm波長)測定各孔吸光度，與標準曲線對照，求出IFN值。結果如圖3所示:[0110]人樹突細胞(2萬個細胞/每孔)在與CpG2216并分別在不同濃度的人重組Galectin-9蛋白或Galectin-1的條件下共培養16個小時，用ELISA方法測定IFN_a分泌情況。
[0111]應該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經對本發明進行具體地顯示和描述，但是本領域的普通技術人員應該理解，在不背離由后附的權利要求所定義的本發明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節的變化，可以進行各種實施方案的任意
組合。`
【權利要求】
1.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療系統性自身免疫性疾病的藥物的應用。
2.權利要求1的應用，其中所述系統性自身免疫疾病是系統性紅斑狼瘡疾病(SLE)或相類似機制的炎癥性疾病。
3.權利要求1的應用，其中所述半乳凝素-9是長鏈、中鏈，或短鏈半乳凝素_9。
4.權利要求1的應用，其中所述半乳凝素-9包括N端糖識別結構域CRD和C端糖識別結構域CRD。
5.權利要求1的應用，其中所述半乳凝素-9是人半乳凝素-9，其氨基酸序列為SEQIDNo:1。
6.權利要求1的應用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是化學修飾的半乳凝素_9。
7.權利要求6的應用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是聚乙二醇修飾的半乳凝素_9。
8.權利要求1的應用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是含有半乳凝素-9序列的融合蛋白。
9.權利要求8的應用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。
10.權利要求9的應用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9與免疫球蛋白(IgG)的Fe片段的融合蛋白。
11.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備調節體內干擾素水平的藥物的應用。
12.權利要求11的應用，其中所述干擾素為I型干擾素，所述調節是降低。
13.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽用于制備用于治療由I型干擾素引起的炎癥的藥物的應用。
14.抑制漿細胞樣樹突細胞產生干擾素能力的方法，所述方法包括使半乳凝素-9或其活性衍生物接觸漿細胞樣樹突細胞。
15.抑制炎癥的方法，所述方法包括將有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其藥物學可接受的鹽，與藥物學可接受的載體一起給藥于有此需要的對象，其中所述的炎癥得到有效抑制。
16.權利要求15的方法，其中所述炎癥是由系統性紅斑狼瘡或相類似機制的炎癥性疾病引起的。
17.權利要求15的方法，其中所述炎癥是由I型干擾素引起的。
【文檔編號】A61P37/02GK103623393SQ201310280152
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年7月4日 優先權日:2012年8月23日
【發明者】李立新 申請人:上海博笛生物科技有限公司