凝結芽孢桿菌及其制備方法與在生物除臭劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于環保領域，公開了凝結芽孢桿菌及其制備方法與在生物除臭劑中的應用。本發明所涉及的凝結芽孢桿菌（Bacilluscoagulans），于2013年05月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.7646。本發明菌株是從畜禽糞便的樣品中篩選得到，該菌對多種惡臭具有明顯去除效果，其中NH3的平均去除率為97.75%，H2S平均去除率為97.40%，總烴平均去除率為99.85%，臭氣濃度平均去除率為90.46%，細菌總數平均去除率為71.23%。本發明生物除臭劑可用于垃圾、污水、畜禽動物舍空氣等的除臭和進化。
【專利說明】凝結芽孢桿菌及其制備方法與在生物除臭劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環保領域，涉及一株凝結芽孢桿菌及其制備方法與在生物除臭劑中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著我國城市化進程的加快，城市人口日益增多，隨之而來的是城市生活垃圾量的高速增加。據不完全統計，近年來我國垃圾增長率達到10%以上，每年產生近1.5億噸。目前，國內城市生活垃圾積存量已高達70億噸，占地約80多萬畝，其中80%~90%來自大中城市，平均每人每天產生的垃圾量約為1.2公斤，但其處理率僅為50%左右。全國600多座城市，已有三分之二的大中城市陷入“垃圾圍城”的困境。面對“垃圾圍城”的窘境，隨之而來的是日趨嚴重的“臭氣擾民”和“蚊蠅擾民”問題。
[0003]針對上述問題，目前市場已有的垃圾除臭劑主要有化學除臭劑、植物除臭劑和微生物除臭劑。化學除臭劑成本較高，易造成二次污染；植物除臭劑提取工藝復雜，生產成本更高。因此兩者在規模化除臭使用過程中受到了極大的成本限制、推廣限制，多用于小場地和小空間的應用或應急應用。因而微生物除臭劑因為“價廉物美”受到熱捧。
[0004]但現有微生物除臭劑產品或技術中多為酵母菌、乳酸菌等非芽孢桿菌為有效菌，或以酵母菌和乳酸菌為主復配部分芽孢桿菌等為有效菌株，如廣東省微生物研究所申請的酵母菌為主的除臭技術(專利號02152024.0和專利號01129774.3)，以及中國農業大學申請的以酵母菌、乳酸菌、固氮菌和光合細菌等非芽孢桿復配功能芽孢桿菌除臭技術(專利號200510069515.8)。該類技術采用非芽孢桿菌為除臭有效菌，忽略了非芽孢桿菌在液體環境中不存在抗逆性強的休眠體一芽孢，故在保藏和使用過程中無法保障其在液體制劑中的有效濃度和菌群比例，也必將導致在應用中使用效果的不確定性。因此，芽孢桿菌類除臭技術的開發顯得尤為必要，惠飛`開發的枯草芽孢桿菌除臭技術(專利號200910034842.8)和戴承鏞開發的巨大芽孢桿菌除臭技術(專利號200510091277.0)都說明芽孢桿菌類除臭技術的有效性。但迄今為止尚未見到凝結芽孢桿菌在生物除臭方面的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供凝結芽孢桿菌及其制備方法，本發明還提供所述凝結芽孢桿菌在生物除臭劑中的應用，具有生產方便、成本低廉、質量可靠、除臭效果穩定顯著，且不造成二次環境污染的優點。
[0006]本發明通過如下技術方案實現:
[0007]凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans),該菌于2013年05月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC7646，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC7646，保藏日期為2013年05月27日。[0008]上述凝結芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟:
[0009](I)取畜禽糞便，采用營養瓊脂進行平板稀釋涂布分離；
[0010](2)挑取80°C水浴25分鐘后的單菌落；
[0011](3)采用肉湯營養瓊脂斜面保藏單菌落；
[0012](4)采用針對氨氣和硫化氫的復篩方法，挑選去除率最高的單菌落，即為凝結芽孢桿菌。
[0013]上述的制備方法具體是:將畜禽糞便稀釋100-1000倍的無菌水中，經80°C水浴20分鐘，再將稀釋液取0.1rnL涂布于營養瓊脂上，置于37°C中培養2_3天，最后挑選單一菌落于營養肉湯瓊脂斜面培養基中，于37°C培養箱中培養2-4天后冰箱保藏。其中，營養肉湯瓊脂培養基和營養肉湯液體培養基等均為微生物常用培養基。
[0014]篩選時，將冰箱中保藏的凝結芽孢桿菌的斜面接種一環至營養肉湯液體培養基中，37 °C培養2天制成菌液。
[0015]所述復篩主要針對臭氣的主要成分一氨氣和硫化氫的去除率進行。具體方法如下:
[0016](I)降氨試驗:取18mL菌液于2L大燒杯中，并加入500mg/L的氨水2mL ;再往大燒杯中放入裝有20mL0.005N硫酸吸收液的50mL小燒杯，蓋上雙層塑料薄膜密封。
[0017](2)降硫化氫試驗:取IOmL菌液于2L大燒杯中，并加入10mg/L的硫化氫溶液IOmL,再往大燒杯中放入裝有20mL氫氧化鎘吸收液的50mL小燒杯，蓋上雙層塑料薄膜密 封。
[0018]以上處理均以等量的無菌水作為對照，每個處理重復3次，置于30°C的培養箱中培養。24小時后，取出小燒杯檢測氨或硫化氫的濃度。氨的測定采用納氏試劑比色法，硫化氫的測定采用亞甲基藍比色法。
[0019]在復篩中挑取氨氣和硫化氫去除率最高的一株，經分子測序，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌鑒定手冊》鑒定為凝結芽孢桿菌。挑取第一代凝結芽孢桿菌培養后制成斜面送交中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC7646，保藏日期為2013年05月27日。
[0020]本發明中的凝結芽孢桿菌(CGMCC7646)具有以下微生物學特征:
[0021]1.形態學特征
[0022]細胞呈桿狀，0.6~1X2.5~5微米，作色均勻，無莢膜，運動，革蘭氏陽性。芽孢橢圓，無伴孢晶體。油鏡觀察，擔擱、成對或鏈狀排列，芽孢端生。
[0023]2.培養學特征
[0024]凝結芽孢桿菌在營養瓊脂培養基中37°C培養48小時后菌落凸起，表面濕潤，邊緣光滑，白色而有光澤，無可溶性色素。
[0025]3.常見生理生化性質如表1:
表1
[0026]
【權利要求】
1.凝結芽孢桿菌(ifeciJrJrW1Scoa講/?ms),其特征在于該菌于2013年05月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC 7646，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。
2.權利要求1凝結芽孢桿菌的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 取畜禽糞便，采用營養瓊脂進行平板稀釋涂布分離； 挑取80°C水浴25分鐘后的單菌落； 采用肉湯營養瓊脂斜面保藏單菌落； 采用針對氨氣和硫化氫的復篩方法，挑選去除率最高的單菌落，即為凝結芽孢桿菌。
3.根據權利要求2所述凝結芽孢桿菌的制備方法，其特征在于將畜禽糞便稀釋100-1000倍的無菌水中，經80°C水浴20分鐘，再將稀釋液取0.1mL涂布于營養瓊脂上，置于37°C中培養2-3天,最后挑選單一菌落于營養肉湯瓊脂斜面培養基中，于37°C培養箱中培養2-4天。
4.根據權利要求2所述凝結芽孢桿菌的制備方法，其特征在于采用肉湯營養瓊脂斜面保藏。
5.根據權利要求2或3所述凝結芽孢桿菌在生物除臭劑中的應用，其特征在于將凝結芽孢桿菌接種至肉湯營 養液體培養基，制成第一代種，再移至發酵罐，經擴大培養形成芽孢后，即得液體凝結芽孢桿菌除臭菌劑。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于發酵罐中液體配方中，每1000mL水中，糖類10-25g、酵母膏l_3g、麩皮過濾水I wt %、pH為5.5。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于擴大培養是在37°C的培養溫度條件下擴大培養48-52小時。
【文檔編號】A61L101/52GK103695331SQ201310264360
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2013年6月27日
【發明者】楊繼國, 任杰, 司衛麗, 藍啟添 申請人:深圳市新寶環保能源科技有限公司