一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法。將蠶繭脫膠后得精練蠶絲絲素蛋白備用；精煉蠶絲絲素蛋白以浴比1:20浸入配制鹽溶液中溶解得到蠶絲絲素蛋白溶液；再經冷凍干燥制得蠶絲絲素肽粉止血材料。本發明的材料是蠶絲絲素蛋白水解的中間產物，與蠶絲絲素的氨基酸組成相同，分子量比蠶絲絲素蛋白小；無菌、無細胞毒性、無致敏和刺激作用。可用緩慢出血和快速、大量出血。本發明操作簡單，耗能少，不使用強酸強堿，不破壞氨基酸，基本無污水和廢渣，簡易可行，具有實用價值。
【專利說明】—種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學材料技術，尤其是涉及一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法。
技術背景
[0002]當人體失血超過800 mL時就會危及生命，而一旦意外傷害導致動脈出血，可能在10分鐘內出血超過800mL，因此在急救醫學上對于動脈出血搶救有“白金10分鐘”的說法。但在實際應用特別是在戰爭或交通事故中，因缺乏有效的止血藥物，很多傷員在送救途中錯過治療最佳階段，而喪失生命或造成傷殘。每年我國有上百萬的人死于失血過多，這些人群主要集中在車禍、摔砸傷、地震災害、洪水災害、手術中或手術后以及其它突發事件等出血。在戰場上，50%的陣亡士兵是由于出血過多所致。所以為了減少失血造成的不必要的死亡，各國醫學界對止血材料的止血性能提出了更高的要求:作為止血敷料或止血劑的材料不僅要具備良好的止血性能，而且要具有優良的生物相容性，無毒副作用，無刺激性，易于加工成型等優異性能，開發出止血效果更佳的材料勢在必行。
[0003]蠶絲絲素肽粉是蠶絲絲素蛋白水解的中間產物，與蠶絲絲素的氨基酸組成相同，但其分子量比蠶絲絲素要小得多，具有良好的生物相容性，對機體無毒性、無致敏和刺激作用，在不影響細胞活性對細胞有良好的細胞附著率和增殖率，而且具有維持細胞正常形態和功能的作用，被認為是目前生物相容性與膠原蛋白效果相當的物質。所以作者認為蠶絲絲素蛋白作為止血材料的應用前景非常廣闊。但蠶絲絲素肽粉的生產，一般采用強酸、強堿法水解絲素或絲素用中性鹽溶解后再經酶水解，控制一定的水解條件可以獲得各種不同分子量的絲素肽。現有制備方法，均存在過程復雜且會破壞部分氨基酸，產生的廢液對環境造成污染、生產成本過高等問題，不適合大規模生產。這些缺陷極大地限制了蠶絲絲素肽的應用。因此為解決上述問題，需要開發`出方法操作簡單，耗能少，更有效地制備蠶絲絲素肽粉的方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法，該方法制備的蠶絲絲素肽粉止血材料價格便宜、原料易得、止血速度快、抗菌抑菌、與人體生物相容性好、可以生物降解、能促使創面快速修復及其它功能性如止痛等的快速止血材料。
[0005]本發明采用的技術方案的步驟如下:
(O將蠶繭切剖去蛹剝成片狀后在質量百分比濃度為2%的中性絲光皂溶液中精練，中間用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液和去離子水反復洗凈，用質量百分比濃度為
0.5%的苦味酸胭脂紅溶液檢驗至絲膠脫凈為止，再用質量百分比濃度為0.05%碳酸鈉溶液浸泡，用去離子水洗凈后離心脫水，置入恒溫干燥箱烘干，得精練蠶絲絲素蛋白備用；
(2)將步驟(1)中得到的精煉蠶絲絲素蛋白以浴比1:20浸入配制鹽溶液中，在溫度為80~180°C和壓強為100~500千帕斯卡條件下溶解2~24小時，得到蠶絲絲素蛋白溶液；
(3)將第步驟(2)中得到的蠶絲絲素蛋白溶液經冷凍干燥制得蠶絲絲素肽粉止血材料。
[0006]所述鹽溶液為氯化鈣、乙醇和水配成的有機無機混合溶劑，其中氯化鈣、乙醇和水的重量百分比為0.1-1:0.1-1:1。
[0007]本發明具有的有益效果是:
本發明的材料是蠶絲絲素蛋白水解的中間產物，與蠶絲絲素的氨基酸組成相同，分子量比蠶絲絲素蛋白小；無菌、無細胞毒性、無致敏和刺激作用。本發明所制備的蠶絲絲素肽粉可以用于不同醫用場合的止血，包括緩慢出血和快速、大量出血。該材料止血效果好,止血速度快,經過肝切口的動物止血實驗模型,其止血性能可與美國Medafor公司生產Arista止血粉媲美。
[0008]本發明操作簡單，耗能少，不使用強酸強堿，不破壞氨基酸，基本無污水和廢渣，簡易可行，具有重大實用價值。
【具體實施方式】
[0009]實施例1:
(I)將蠶繭切剖去蛹剝成片狀后稱取20g在質量百分比濃度為2%的中性絲光皂溶液中精練2次，每次50min，中間用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液和去離子水反復洗凈，用質量百分比濃度為0.5%的苦味酸胭脂紅溶液檢驗至絲膠脫凈為止，然后再在50°C下，用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液浸泡30min，用去離子水洗凈后離心脫水，置入40°C恒溫干燥箱烘干，得精練蠶絲絲素。
[0010](2)取4克脫膠后的精練蠶`絲絲素置于氯化鈣、乙醇和水的質量百分比為
0.1:0.1:1的80mL配制鹽溶液中，在溫度為180°C和壓強為500千帕斯卡下溶解24小時。冷卻后將蠶絲絲素粗溶液抽濾去除不溶物，得到純凈的蠶絲絲素蛋白溶液待用。
[0011](3)將待用的蠶絲絲素蛋白溶液在-80°c預冷凍12h，再將冷凍樣品放入冷凍干燥機干燥2天，制得分子量為10000的蠶絲絲素肽粉止血材料。
[0012]實施例2:
(I)將蠶繭切剖去蛹剝成片狀后稱取20g在質量百分比濃度為2%的中性絲光皂溶液中精練2次，每次50min，中間用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液和去離子水反復洗凈，用質量百分比濃度為0.5%的苦味酸胭脂紅溶液檢驗至絲膠脫凈為止，然后再在50°C下，用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液浸泡30min，用去離子水洗凈后離心脫水，置入40°C恒溫干燥箱烘干，得精練蠶絲絲素。
[0013](2)取5克脫膠后的精練蠶絲絲素置于氯化鈣、乙醇和水的質量百分比為1:1:1的IOOmL配制鹽溶液中，在溫度為80°C和壓強為100千帕斯卡下溶解2小時。冷卻后將蠶絲絲素粗溶液抽濾去除不溶物，得到純凈的蠶絲絲素蛋白溶液待用。
[0014](3)將待用的蠶絲絲素蛋白溶液在_80°C預冷凍12小時，再將冷凍樣品放入冷凍干燥機干燥2天，制得分子量為2000的蠶絲絲素肽粉止血材料。
[0015]實施例3:
(I)將蠶繭切剖去蛹剝成片狀后稱取20g在質量百分比濃度為2%的中性絲光皂溶液中精練2次，每次50min，中間用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液和去離子水反復洗凈，用質量百分比濃度為0.5%的苦味酸胭脂紅溶液檢驗至絲膠脫凈為止，然后再在50°C下，用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液浸泡30 min，用去離子水洗凈后離心脫水，置入40°C恒溫干燥箱烘干，得精練蠶絲絲素。
[0016](2)取6克脫膠后的精練蠶絲絲素置于氯化鈣、乙醇和水的質量百分比為
0.6:0.4:1的120mL配制鹽溶液中，在溫度為150°C和壓強為300千帕斯卡下溶解15小時。冷卻后將蠶絲絲素粗溶液抽濾去除不溶物，得到純凈的蠶絲絲素蛋白溶液待用。
[0017](3)將待用的蠶絲絲素蛋白溶液在_80°C預冷凍12小時，再將冷凍樣品放入冷凍干燥機干燥2天，制得分子量為6000的蠶絲絲素肽粉止血材料。
[0018]止血性能的測定:
實驗動物:健康成年SD大白鼠,體重為180± IOg,由上海長征醫院實驗動物中心提供。
[0019]對照組:美國Medafor公司生產的Arista止血粉
實驗方法:老鼠肝切口止血預實驗，麻醉成功后，將SD大鼠固定于解剖臺上，并用碘爾康溶液消毒，在肋弓下沿著腹中線切一縱行切口，長度約2cm，深度先至皮膚全層，然后提起腹肌沿著腹中線剪開腹肌，注意避開腹內重要臟器，輕輕擠壓腹部，肝中葉從切口處被擠出，注意避免損傷肝中葉，用無菌紗布吸干肝臟周圍腹腔液，用天平稱過重量的無菌紗布墊于肝中葉下，快速切除肝中葉，切線約是肝中葉下緣以上2cm。同時立刻上止血材料，并計時，直至出血停止，記下出血時間，稱出吸血的無菌紗布重量，與之前稱出的重量相減得出出血量。
[0020]止血性能的測定結果:
實驗結果見附表1，實施例1中蠶絲絲素肽粉止血材料的止血時間為91秒，出血量為
0.94g ;實施例2中蠶絲絲素肽粉止血材料的止血時間為83秒，出血量為0.85g ;實施例3中蠶絲絲素肽粉止血材料的止血時間為87秒，出血量為0.95g ;其中作為對照組的美國Medafor公司生產的Arista止血粉的止血時間為86秒，出血量為0.93g。由此可見，蠶絲絲素肽粉止血材料的可溶性非常好，遇到血液能迅速地溶解，與創面的粘附能力強，止血效果好，與Arista止血粉止血效果相當。
[0021]表1蠶絲絲素肽粉止血材料和Arista止血粉的出血時間及出血量
【權利要求】
1.一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (O將蠶繭切剖去蛹剝成片狀后在質量百分比濃度為2%的中性絲光皂溶液中精練，中間用質量百分比濃度為0.05%的碳酸鈉溶液和去離子水反復洗凈，用質量百分比濃度為0.5%的苦味酸胭脂紅溶液檢驗至絲膠脫凈為止，再用質量百分比濃度為0.05%碳酸鈉溶液浸泡，用去離子水洗凈后離心脫水，置入40°C恒溫干燥箱烘干，得精練蠶絲絲素蛋白備用； (2)將步驟(1)中得到的精煉蠶絲絲素蛋白以浴比1:20浸入配制鹽溶液中，在溫度為80~180°C和壓強為100~500千帕斯卡條件下溶解2~24小時，得到蠶絲絲素蛋白溶液； (3)將步驟(2)中得到的蠶絲絲素蛋白溶液經冷凍干燥制得蠶絲絲素肽粉止血材料。
2.根據權利要求1所述的一種蠶絲絲素肽粉止血材料的制備方法，其特征在于:所述鹽溶液為氯化鈣、乙醇和水配成的有機無機混合溶劑，其中氯化鈣、乙醇和水的質量百分比為 0.1-1:0.1-1:1。`
【文檔編號】A61L15/32GK103497240SQ201310248965
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年6月21日 優先權日:2013年6月21日
【發明者】馮新星, 朱海霖, 雷彩虹, 陳建勇 申請人:浙江理工大學, 中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所