一種具有止血功能的難溶性多糖復合物及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種具有止血功能的難溶性多糖復合物，包括難溶性多糖和血液成分，血液成分是全血或血衆，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。本發明通過將血液成分與難溶性多糖混合，使血液成分在難溶性多糖表面均勻分散地發生凝血反應，使凝血過程中產生的凝血因子被難溶性多糖表面吸附，并保持較高的促凝血活性，從而得到凝血效果極好的復合止血材料。本發明制備難溶性多糖復合物的方法簡單，使用便利、安全，可廣泛用于創傷和手術止血。與其他醫用材料、醫療器械組合，可制成創可貼、輸液貼、自粘敷料、片劑和膠囊芯料、手術包、急救包等，同時利用其吸附性能等特點吸附抗菌素和止痛藥等于其中，從而得到更好的療效。
【專利說明】一種具有止血功能的難溶性多糖復合物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學材料【技術領域】，具體涉及一種具有止血功能的難溶性多糖復 合物及其制備方法，以及包含該復合物的止血材料。
【背景技術】
[0002] 止血是緊急救生的關鍵步驟。開發能夠在很短的時間內（3分鐘)就能控制住像主 動脈流血這樣的緊急情況的止血材料，可以為進一步的醫療救治贏得寶貴的時間，大大降 低出血、創傷等導致的死亡。
[0003]目前已經有將難溶性多糖應用于止血的報道，其中多使用的主要有殼聚 糖（CN202020720U，CN102526795A)、纖維素（CN100348272C，CN1109756A)和淀粉 (CN102178691B)。殼聚糖是甲殼素經過脫乙酰化后制得的天然聚陽離子多糖，殼聚糖分子 具有凝血、抑菌、促進傷口愈合等多種作用，是一類生物相容性好、易生物降解、無免疫原 性、無刺激性的多功能高分子材料。目前應用于外出血的市場容量最大的止血材料之一是 美國HemCon公司的殼聚糖止血帶HemCon Bandage ,其主要成分便是殼聚糖材料。殼聚糖 促進凝血的機理是活化血小板加速凝血反應。同時殼聚糖材料具有極強的粘性，能夠粘附 在傷口的表面形成覆蓋物，阻止傷口出血，在創傷、手術止血治療中展現出十分光明的應用 前景。但是殼聚糖材料由于只活化血小板，對凝血通道的活化作用不明顯，因而凝血效果 有限。因此研究人員不得不尋找開發凝血效果更好的殼聚糖基凝血材料。把凝血酶負載 到殼聚糖材料表面是提高殼聚糖材料凝血效果的有效方法。例如中國專利CN101053669A， CN102526795A報道將凝血酶負載到殼聚糖材料表面，增強了材料的凝血效果。但是由于 殼聚糖表面基團與凝血酶的作用，導致凝血酶的活性下降。另外由于殼聚糖與凝血酶的相 互作用力較弱，因而凝血酶的吸附量不高。同時由于凝血酶價格昂貴（牛凝血酶價格約 30, 000元/克），大大限制了其負載到殼聚糖表面作為止血的應用。
[0004] 綜上所述殼聚糖負載凝血酶止血材料存在以下的缺陷：1)凝血酶價格昂貴（牛 凝血酶價格約30, 000元/克）；2)將凝血酶負載到殼聚糖材料表面的方法，使得兩者相互 作用力弱，不能實現凝血酶和止血材料的有效結合，負載的凝血酶容易脫落，用于傷口止血 時，脫落的凝血酶可能進入到血管導致血栓；3)凝血酶負載到殼聚糖表面后有較大的活性 損失，因而產品難以實現商業化。
[0005] 與殼聚糖材料相比，纖維素和淀粉材料的生物相容性更好，對血小板的活化作用 更弱，止血效果相對更差。目前針對纖維素的止血劑，主要是對纖維素進行修飾或者負載凝 血酶，由于負載凝血酶的價格昂貴，且負載過程中凝血酶活力損失較大，因而難以商業化。 而針對淀粉的止血劑，主要是利用淀粉的強吸水性以及負載凝血酶，因而也面臨著凝血酶 活力損失和價格昂貴的問題。
[0006] 為了制得止血效果好、并且能具有商業化前景的難溶性多糖止血材料，有必要解 決在止血材料中有效地引入凝血酶的技術和成本問題。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種具有止血功能的難溶性多糖復合物及其 制備方法，以及包含該復合物的止血材料。
[0008] 本發明采用如下的技術方案： 一種具有止血功能的難溶性多糖復合物，所述的復合物包括難溶性多糖和血液成分， 所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0009] 本發明的難溶性多糖復合物中，血液成分中存在的無機離子(如鈣離子、鎂離子 等）導致凝血反應被激發，原位發生凝血反應生成凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白 質；同時，血液成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質轉化成纖 維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發生交聯，生成網狀的纖維蛋白，難 溶性多糖表面被網狀的纖維蛋白包裹，根據酶與底物的特異性識別作用，生成的凝血酶等 促進凝血的蛋白質被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋 白上，而不會被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。這保證了本發明的難溶 性多糖復合物高效的凝血效率。并且本發明難溶性多糖復合物材料兼具活化的凝血因子和 難溶性多糖的特性，可廣泛用于創傷和手術止血，具有極大的優點。
[0010] 本發明所述的難溶性多糖復合物，可以僅由難溶性多糖和血液成分組成，所述的 血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0011] 此外，本發明的難溶性多糖復合物還可以進一步包括外加的能促進激發凝血反應 的無機離子，也就是所述的難溶性多糖復合物由難溶性多糖、血液成分和外加的無機離子 組成，所述的外加的無機離子可以選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。 通過外加的無機離子，可以起到進一步促進凝血反應的效果。優選的，所述的外加的無機離 子在血液成分中的濃度為2mM?10mM。
[0012] 作為優選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0013] 進一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0014] 本發明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經化學處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經化學處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；本發明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經化學處理的高分子多糖與經化學處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0015] 但本發明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團修飾的、對凝血無抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發明。
[0016] 本發明所述的難溶性多糖復合物中，所述的全血可以是人或動物的全血。所述的 血漿為純的血漿，或者包含血細胞的血漿，所述的血細胞選自紅細胞、白細胞、巨噬細胞、血 小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無機離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發 明。
[0017] 本發明所述的難溶性多糖復合物中，所述的復合物中難溶性多糖與血液成分以任 意比例混合，優選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質量比為1:8?1:1。
[0018] 本發明還提供二種具有止血功能的難溶性多糖復合物的制備方法： 方法一包括如下步驟： 1) 將難溶性多糖與血液成分混合，制得難溶性多糖-血液成分復合材料，所述的血液 成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述的混合溫 度為5?37°C，所述的混合時間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復 合物。
[0019] 上述方法中，所述步驟1)中的難溶性多糖與血液成分混合，血液成分中存在的無 機離子(如鈣離子、鎂離子等）導致凝血反應被激發，原位發生凝血反應生成凝血因子FXa、 凝血酶等促進凝血的蛋白質；同時，血液成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促 進凝血的蛋白質轉化成纖維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發生交 聯，生成網狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面被網狀的纖維蛋白包裹，根據酶與底物的特異性 識別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質被包裹在難溶性多糖表面的纖 維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋白上，而不會被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并 保持較高的活性。
[0020] 上述方法中，所述步驟1)中，難溶性多糖與血液成分的混合比例為任意比例，優 選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質量比為1:8?1:1。
[0021] 作為優選，上述方法中，所述步驟1)中，所述的全血可以是人或動物的全血；所述 的血漿為純的血漿，或者包含血細胞的血漿，所述的血細胞選自紅細胞、白細胞、巨噬細胞、 血小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無機離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發 明。
[0022] 更優選的，所述步驟1)中，所述的血漿為添加鈣離子的血漿。
[0023] 上述方法中，所述步驟1)中的混合方式可以是聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次 抽吸等方式將所述的難溶性多糖與血液成分混合。
[0024] 作為優選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0025] 進一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0026] 本發明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經化學處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經化學處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經化學處理的高分子多糖與經化學處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0027] 但本發明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團修飾的、對凝血無抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發明。
[0028] 上述方法中，所述步驟2)中的干燥方法可以是真空干燥或冷凍干燥，所述的真空 干燥溫度可以是20°C?38°C，時間為0. 5?5 h。
[0029] 方法二包括如下步驟： 1) 將難溶性多糖、血液成分、無機離子混合，制得難溶性多糖-血液成分復合材料；所 述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述 的混合溫度為5?37°C，所述的混合時間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復 合物。
[0030] 上述方法中，所述步驟1)中的加入無機離子的目的是促進啟動凝血通道，促進凝 血反應的發生，所述的無機離子選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種，所 述的無機離子可以來自包括上述離子的可溶性無機鹽，所述的外加的無機離子在血液成分 中的濃度為2mM?10mM。
[0031] 上述方法中，所述步驟1)中的難溶性多糖、血液成分、無機離子混合，促進凝血反 應的激發，原位發生凝血反應生成凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質；同時，血液 成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質轉化成纖維蛋白單體，生 成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發生交聯，生成網狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面 被網狀的纖維蛋白包裹，根據酶與底物的特異性識別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等 促進凝血的蛋白質被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋 白上，而不會被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。
[0032] 上述方法中，所述步驟1)中，難溶性多糖與血液成分的混合比例為任意比例，優 選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質量比為1:8?1:1。
[0033] 作為優選，上述方法中，所述步驟1)中，所述的全血可以是人或動物的全血。所述 的血漿為純的血漿，或者包含血細胞的血漿，所述的血細胞選自紅細胞、白細胞、巨噬細胞、 血小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無機離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發 明。
[0034] 上述方法中，所述步驟1)中的混合方式可以是聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次 抽吸等方式將所述的難溶性多糖與血液成分混合。
[0035] 作為優選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0036] 進一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0037] 本發明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經化學處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經化學處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經化學處理的高分子多糖與經化學處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0038] 但本發明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團修飾的、對凝血無抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發明。
[0039] 上述方法中，所述步驟2)中的干燥方法可以是真空干燥或冷凍干燥，所述的真空 干燥溫度可以是20°C?38°C，時間為0. 5?5 h。
[0040] 方法一或方法二的步驟完成后，還可以將制得的具有止血功能的難溶性多糖復合 物磨碎、滅菌保存，可以更方便地做成止血材料。
[0041] 所述的滅菌采用Co-60射線滅菌。
[0042] 本發明還提供一種用于止血的材料，所述的止血材料包含本發明所述的難溶性多 糖復合物作為有效成分，或者還包含醫學上可接受的其他輔料或其他藥物。
[0043] 本發明還提供一種用于止血的材料，其特征在于：所述的止血材料可以是單獨的 難溶性多糖復合物，也可以是包含難溶性多糖復合物和輔料，也可以是包含難溶性多糖復 合物和其他藥物，還可以是包含難溶性多糖復合物、輔料和其他藥物，所述的輔料包括聚乙 二醇、聚丙三醇、碳酸鈣等，所述輔料的優選的重量百分數為〇?80% ;所述的其他藥物可以 是具有消炎、止痛、抗菌功能的藥物，例如慶大霉素、氧氟沙星等。
[0044] 所述的止血材料的劑型可以是軟膏、糊膏、霜膏、止血貼、止血紗布、止血微球等。
[0045] 本發明具有如下優點： 1、反應條件溫和、操作簡便易行，原料廉價易得。殼聚糖、纖維素、淀粉等以及動物血漿 的價格都非常便宜。
[0046] 2、通過將難溶性多糖-血漿復合，凝血活化后的促凝因子在材料的表面保持了較 高的活性，使得難溶性多糖-血漿復合材料具有極好的效果。
[0047] 3、所得的難溶性多糖-血漿復合物，保持了難溶性多糖本身生物相容性好的特 性。有利于應用于各種創傷和手術止血。同時利用材料本身的吸附性能等，可以吸附抗菌 素、止痛藥于其中，復合用藥。
[0048] 本發明的有益效果是：本發明所制備的材料在創傷、手術止血治療中有明顯優勢。 由于動物血漿很便宜（約2元/kg)，通過將動物血漿與高分子多糖材料混合，1元價格的 動物血漿與高分子多糖材料復合得到的具有止血功能的難溶性多糖復合物的止血效果與 10, 000元牛凝血酶所起到的作用相當，可以大大降低止血材料的成本。由于血漿在難溶性 多糖復合物的表面凝血，使得促凝的活化后凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質吸附 在難溶性多糖復合物的表面。由于這種吸附作用，使它們不會被抗凝血酶抑制，從而在難溶 性多糖復合物的表面保持很高的活性。而單獨將血凝塊凝血時，由于血凝塊形成過程中產 生的凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質很快就被抗凝血酶等抑制劑結合，失去了促 凝的活性，因而，單獨的血凝塊促凝效果微弱。難溶性多糖復合物中的高分子多糖可以激 發血液成分中的血小板促進凝血反應，而表面活化的凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋 白質可以直接活化血液成分中的凝血因子酶原，大大的加速凝血反應，起到快速止血的作 用。并且難溶性多糖復合物保持了高分子多糖材料良好的生物相容性，因而不會引起組織 反應，也不會引起傷口感染，使用非常安全，無嚴重毒副作用。同時利用高分子多糖材料的 吸附性能，可將其他藥物如消炎、止痛、抗菌藥等吸附于其中，得到更好的療效。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049] 圖1為本發明的難溶性多糖復合物的形成過程示意圖。
[0050] 圖2為本發明的殼聚糖/血漿復合物與自然凝血、殼聚糖、血凝塊的體外凝血效果 比較圖，誤差線由三組實驗數據得到。
[0051] 圖3為本發明的殼聚糖/血漿復合物、殼聚糖/全血復合物與自然凝血、游離凝血 酶、云南白藥、殼聚糖/凝血酶復合材料的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實驗數據得 到。
[0052] 圖4為本發明的不同比例殼聚糖/血漿復合物(分別按1:0. 5，1:1，1:2，1:4， 1:8的質量比混合）與自然凝血、殼聚糖的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實驗數據得 到。
[0053] 圖5為本發明的纖維素/血漿復合物、纖維素/全血復合物與自然凝血、游離凝 血酶、纖維素、纖維素/凝血酶復合材料的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實驗數據得 到。
[0054] 圖6為本發明的不同比例淀粉/血漿復合物(分別按1:1，1:2，1:4的質量比混 合）與自然凝血、淀粉的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實驗數據得到。
[0055] 圖7為本發明的木質素/血漿復合物、瓊脂糖/血漿復合物與自然凝血、木質素、 瓊脂糖的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實驗數據得到。
[0056] 圖8為本發明的氨基化殼聚糖/血漿復合物、巰基化殼聚糖/血漿復合物、羧基化 殼聚糖/血漿復合物與自然凝血、氨基化殼聚糖、巰基化殼聚糖、羧基化殼聚糖的體外凝血 效果比較圖。誤差線由三組實驗數據得到。
【具體實施方式】
[0057] 本發明提供一種具有止血功能的難溶性多糖復合物，所述的復合物包括難溶性 多糖和血液成分，所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿 的高分子多糖。
[0058] 本發明中難溶性多糖復合物的形成過程示意圖如圖1所示。本發明的難溶性多糖 復合物中，血液成分中存在的無機離子(如鈣離子、鎂離子等）導致凝血反應被激發，原位發 生凝血反應生成凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質；同時，血液成分中的纖維蛋白 原被凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質轉化成纖維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體 在難溶性多糖的表面發生交聯，生成網狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面被網狀的纖維蛋白 包裹，根據酶與底物的特異性識別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等促進凝血的蛋白質 被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋白上，而不會被血 漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。這保證了本發明的難溶性多糖復合物高 效的凝血效率。并且本發明難溶性多糖復合物材料兼具活化的凝血因子和難溶性多糖的特 性，可廣泛用于創傷和手術止血，具有極大的優點。
[0059] 本發明所述的難溶性多糖復合物，可以僅由難溶性多糖和血液成分組成，所述的 血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0060] 此外，本發明的難溶性多糖復合物還可以包括外加的能促進激發凝血反應的無機 離子，也就是所述的難溶性多糖復合物由難溶性多糖、血液成分和外加的無機離子組成，所 述的外加的無機離子可以選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。通過外加 的無機離子，可以起到進一步促進凝血反應的效果。優選的，所述的外加的無機離子在血液 成分中的濃度為2mM?10mM。
[0061] 作為優選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0062] 進一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0063] 本發明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經化學處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經化學處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經化學處理的高分子多糖與經化學處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0064] 但本發明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團修飾的、對凝血無抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發明。
[0065] 本發明所述的難溶性多糖復合物中，所述的全血可以是人或動物的全血。所述的 血漿為純的血漿，或者包含血細胞的血漿，所述的血細胞選自紅細胞、白細胞、巨噬細胞、血 小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無機離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發 明。
[0066] 本發明所述的難溶性多糖復合物中，所述的復合物中難溶性多糖與血液成分以任 意比例混合，優選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質量比為1:8?1:1。
[0067] 下面結合實施例和附圖進一步描述本發明，實施例和對比實施例中以豬的全血、 血漿為例，來說明本發明的難溶性多糖復合物的制備方法和凝血效果，以人或者其他動物 的全血、血漿為原料制備難溶性多糖復合物的方法、凝血效果的規律均相同。凝血效果以凝 血時間計，凝血時間越短，凝血效果越好。
[0068] 對比實施例1 自然凝血效果的測定：在25°C進行體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半小 時。體外實驗時，取40ul的0. 2M CaCl2溶液加入到10ml的離心管中，然后加入2ml恒溫 的全血，全血凝固的時間記為自然凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次 記錄的平均值，得到自然凝血時間為9. 6min，其凝血效果見圖2?圖8。
[0069] 對比實施例2 殼聚糖凝血效果的測定：取50mg殼聚糖(分子量15萬?20萬）加入到10ml的離心管 中，在25°C進行體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半小時。然后加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，全血凝固時的時間記為殼聚糖的凝血時間。將上述測定 凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平均值，得到殼聚糖的凝血時間為4. 1 min，由此 可見殼聚糖的凝血效果一般，其凝血效果見圖2和圖4。
[0070] 對比實施例3 血凝塊凝血效果的測定：將l〇〇ul血漿置于試管中，加入10ul鈣離子，放置半小時待其 凝血。然后干燥，攪碎；在25°C進行體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半小時。加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察干燥后血凝塊的凝血效果，全血凝固 時的時間記為血凝塊的凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平 均值，得到血凝塊的凝血時間為2. 3 min，其凝血效果一般，見圖2。
[0071] 實施例1 殼聚糖/血漿復合物的制備：將50mg殼聚糖材料(分子量15萬?20萬）與100ul抗 凝血漿混合(按1:2的質量比)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時，得到殼聚糖/ 血漿復合材料，將其在30°C真空干燥5h，得到殼聚糖/血漿復合物。
[0072] 殼聚糖/血漿復合物凝血效果的測定：將殼聚糖/血漿復合物磨碎，在25°C進行 體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半小時。取50mg殼聚糖/血漿復合物，然后加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時的時間記為 殼聚糖/血漿復合物的凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平 均值，得到殼聚糖/血漿復合物的凝血時間為1 min，其凝血效果較好，見圖2。由此可見， 殼聚糖與添加鈣離子的血漿復合之后凝血效果大大提高。
[0073] 制得的殼聚糖/血漿復合物分別與對比實施例1-3的自然凝血、殼聚糖、血凝塊的 體外凝血效果比較圖見圖2,由圖2可知，殼聚糖/血漿復合物的凝血效果優于殼聚糖和血 凝塊的凝血效果，更優于自然凝血的效果。
[0074] 實施例2 殼聚糖/全血復合物的制備：將50mg殼聚糖(分子量15萬?20萬)與100ul全血混合 (按1:2的質量比)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時，得到殼聚糖/全血復合材 料，將其在30°C真空干燥5h，得到殼聚糖/全血復合物。
[0075] 殼聚糖/全血復合物凝血效果的測定：將殼聚糖/全血復合物磨碎，在25°C進行 體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半小時。取50mg殼聚糖/全血復合物，然后加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時的時間記為 殼聚糖/全血復合物的凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平 均值，得到殼聚糖/全血復合物的凝血時間為1. 1 min，其凝血效果較好，見圖3。
[0076] 對比實施例4 游離凝血酶凝血效果的測定：在25°C進行體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫 半小時。取凝血酶（Sigma T4648凝血酶，生產商Sigma-Aldrich公司）配制成lmg/ml溶 液，取l〇〇ul進行體外凝血實驗。然后加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血， 考察其凝血效果，全血凝固時的時間記為殼聚糖/全血復合物的凝血時間。將上述測定凝 血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平均值，得到凝血酶的凝血時間為〇. 67 min，其凝血 效果很好，見圖3。
[0077] 對比實施例5 殼聚糖/凝血酶復合材料的制備：參考中國專利CN 102526795A的方法，將5g殼聚糖 分散于30ml蒸餾水中；將凝血酶溶于pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液，得到質量濃度為0. 1 % 的凝血酶（Sigma T4648凝血酶，生產商Sigma-Aldrich公司)溶液10ml ;然后將二者按體積 比3:1混合，制得殼聚糖與凝血酶的重量比例為500:1的混合溶液40mL。在攪拌的條件下， 加入0. 5g丙三醇和lg甘露醇，并逐滴加入質量濃度5%的氯化鈣溶液50ul，混合均勻，再 于攪拌狀態下，逐滴加入體積濃度1 %戊二醛溶液250ul進行交聯，然后傾入適當形狀的模 具中，放置2小時，待形成凝膠后，-20°C冷凍24小時，再于-40°C真空冷凍干燥36小時，倒 模、磨碎、封裝。得到固定凝血酶的殼聚糖/凝血酶復合材料。
[0078] 殼聚糖/凝血酶復合材料凝血效果的測定：在25°C進行體外凝血實驗，將全血預 先在25°C水浴恒溫半小時。取50mg該殼聚糖/凝血酶復合材料，加入40ul的0. 2M CaCl2， 最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時的時間記為殼聚糖/凝血酶復合材 料的凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平均值，得到殼聚糖/ 凝血酶復合材料的凝血時間為2. 2 min,與對比實施例4游離凝血酶的凝血效果對比，固定 凝血酶的殼聚糖/凝血酶復合材料的凝血效果降低，說明凝血酶固定后凝血效果降低，見 圖3。
[0079] 對比實施例6 云南白藥凝血效果的測定：在25°C進行體外凝血實驗，將全血預先在25°C水浴恒溫半 小時。取云南白藥(產品批號ZA12041)粉末0. lg，加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml 恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時的時間記為云南白藥的凝血時間。將上述測定凝 血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平均值，得到云南白藥的凝血時間為4. 2 min，其促 凝效果一般，見圖3。
[0080] 實施例1制得的殼聚糖/血漿復合物、實施例2制得的殼聚糖/全血復合物與對 比實施例1的自然凝血、對比實施例4-6的游離凝血酶、云南白藥、殼聚糖/凝血酶復合材 料的凝血效果比較圖見圖3,由圖3可知，殼聚糖/血液成分復合物(殼聚糖/血漿復合物、 殼聚糖/全血復合物）的凝血效果與游離凝血酶相差不大，并且大大優于商業化的止血產 品，如云南白藥，也優于固定了凝血酶的殼聚糖/凝血酶復合材料，由于本發明制備方法簡 單，原料低廉，因而前景十分廣闊。
[0081] 實施例3 不同比例的殼聚糖/血漿復合物的制備：將50mg殼聚糖(分子量15萬?20萬）分別 與 25111、50111、100111、200111、400111 抗凝血漿混合(分別按1:0.5，1:1，1:2，1:4，1:8的 質量比混合)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時，分別制得殼聚糖/25ul血漿復 合材料、殼聚糖/50ul血漿復合材料、殼聚糖/lOOul血漿復合材料、殼聚糖/200ul血漿復 合材料、殼聚糖/400ul血漿復合材料，將上述血漿復合材料分別在30°C真空干燥，分別制 得殼聚糖/25ul血漿復合物、殼聚糖/50ul血漿復合物、殼聚糖/lOOul血漿復合物、殼聚糖 /200ul血漿復合物、殼聚糖/400ul血漿復合物。
[0082] 不同比例的殼聚糖/血漿復合物凝血效果的測定：在25°C進行體外凝血實驗， 將全血預先在25°C水浴恒溫半小時。上述血漿復合物分別各取50mg，加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血時間，全血凝固時的時間記為殼聚糖/血漿復 合物的凝血時間。將上述測定凝血時間的步驟重復三次，取三次記錄的平均值，分別得到不 同比例的殼聚糖/血漿復合物的凝血時間數據見表1。
[0083] 表1不同比例的殼聚糖/血漿復合物的凝血時間數據
【權利要求】
1. 一種具有止血功能的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的復合物包括難溶性多 糖和血液成分，所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的 高分子多糖。
2. 根據權利要求1所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的難溶性多糖復合物 中還進一步包括無機離子。
3. 根據權利要求2所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的無機離子選自鈣離 子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的難溶性多 糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它們的混合物。
5. 根據權利要求4所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的改性的高分子多糖 選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一 種或任意多種。
6. 根據權利要求4或5所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的高分子多糖選 自纖維素、木質素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。
7. 根據權利要求1-3任一項所述的難溶性多糖復合物，其特征在于：所述的復合物中 難溶性多糖與血液成分以任意比例混合，優選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質量 比為1:8?1:1。
8. 權利要求1所述的具有止血功能的難溶性多糖復合物的制備方法，其特征在于包括 如下步驟： 1) 將難溶性多糖與血液成分混合，制得難溶性多糖-血液成分復合材料，所述的血液 成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述的混合溫 度為5?37°C，所述的混合時間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復 合物。
9. 權利要求2所述的具有止血功能的難溶性多糖復合物的制備方法，其特征在于包括 如下步驟： 1) 將難溶性多糖、血液成分、無機離子混合，制得難溶性多糖-血液成分復合材料，所 述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述 的混合溫度為5?37°C，所述的混合時間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復 合物。
10. 根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于：所述的無機離子選自鈣離子、鎂離 子、鍶離子中的任意一種或任意多種。
11. 一種用于止血的材料，其特征在于：所述的止血材料包含權利要求1-7任一項所述 的難溶性多糖復合物作為有效成分，或者還包含醫學上可接受的輔料或其他藥物。
12. 根據權利要求11所述的止血材料，所述的止血材料的劑型選自軟膏、糊膏、霜膏、 止血貼、止血紗布、止血微球。
【文檔編號】A61K9/06GK104208096SQ201310222368
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月4日 優先權日:2013年6月4日
【發明者】范杰, 李云龍, 廖曉峰, 尚小強, 陳昊 申請人:浙江大學