一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞；分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞BMSC-S3細胞系；建立穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞系；PCR檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的基因；細胞免疫熒光化學分析和流式細胞術檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的抗原分子。本發明制備的BMSC-S3/PBD-1細胞穩定表達PBD-1，且具備標準BMSC干細胞特性，將穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞通過耳部靜脈輸注到患支原體肺炎的豬體內，有效劑量為1～5×105/次/kg體重，可以控制豬支原體肺炎疾病；BMSC-S3/PBD-1細胞可以長期在液氮罐中保存，來源有保障，本發明提供的干細胞制劑無耐藥性，外源蛋白為豬體特有，無藥物殘留的風險，應用前景廣闊。
【專利說明】一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制劑制備領域，尤其涉及一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]豬支原體肺炎俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病，具有高發病率，低死亡率的特點。
[0003]在新引進豬群多呈急性暴發，其發病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高達80%?100%。豬發病后可出現慢性干咳，生長緩慢，發育遲緩等特點，感染后可引起豬免疫力降低，從而導致其他病原如胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、肺炎巴氏桿菌等混合感染，引發豬呼吸道綜合征(Percineres Piratory Disease Complex,PRDC)或者其他疾病。而且，豬肺炎支原體可通過空氣傳播，很難隔離阻斷傳播途徑，極易引起全群發病，是公認的最難凈化的豬病，嚴重危害養豬業的發展。
[0004]到目前為止,對豬肺炎支原體感染的傳染病尚無特效治療藥物。
[0005]目前用于該病的免疫預防疫苗有2種，即滅活疫苗和弱毒疫苗，但都不能完全預防豬支原體肺炎發生。在臨床治療上過去多用土霉素和卡那霉素等，但療效不穩定，停藥后易復發，易形成僵豬。泰樂菌素(Tylosin)和替米考星(Tilmieosin)都是大環內酯類畜禽專用抗生素，對支原體有較好的療效。但有研究報道，泰樂菌素對豬支原體肺炎僅有預防作用而無治療效果，一旦停止用藥，病情就會反復發作，使得當前養豬業對該藥物產生了嚴重的依賴性，而這類藥物的濫用又導致了支原體的耐藥性，這進一步加劇了支原體感染病的流行和難以控制。此外，據歐洲.醫藥產品評價機構(EMEA)報道，替米考星在豬、羊體內，肝、腎中殘留較高，而肌肉、脂肪、皮膚中殘留較低(<0.05mg/kg)，其原形為主要殘留物，糞便中也存在微量代謝產物。因此，尋找一條新的無藥物殘留、無耐藥性的凈化豬肺炎支原體感染的有效途徑顯得尤為重要。
[0006]據文獻報道，β防御素有廣譜高效抗支原體、革蘭氏陽性、陰性菌、真菌和某些衣殼病毒的活性，且未見有耐藥性。PBD-1是豬防御系統中起重要作用的抗菌肽，與其它抗微生物多肽相比具有特殊的抗病機理，不會產生耐藥性，在動物體內及其產品中不會有藥物殘留的現象，并且已發現在豬的外周血單核細胞(PBMCs)和淋巴結細胞中具有很強的免疫調節作用，應用前景十分廣泛，有望成為新一代抗支原體肺炎藥物的理想選擇。
【發明內容】
[0007]本發明實施例的目的在于提供一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，旨在解決目前抗生素藥物易產生耐藥性、在豬體內殘留度高等問題。
[0008]本發明實施例是這樣實現的，一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0009]從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞；[0010]分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞BMSC-S3細胞系；
[0011]建立穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞系；
[0012]PCR檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的基因；
[0013]細胞免疫熒光化學分析和流式檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的抗原分子；
[0014]在被誘導條件下，細胞可向成脂細胞或成肌細胞分化。
[0015]進一步、從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞采用Ficol梯度分離法。
[0016]進一步、分離豬骨髓間充質干細胞選取的部位為初生豬腿骨的脛骨、股骨。
[0017]進一步、分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞采用的方法為差速貼壁法。
[0018]進一步、檢測BMSC-S3/PBD-1細胞是否穩定表達PBD-1PCR的方法為PCR檢測、細胞免疫熒光化學分析和流式檢測。
[0019]本發明采用Ficol梯度分離法從初生豬腿骨(脛骨、股骨)骨髓中分離出豬骨髓間充質干細胞，并利用差速貼壁法從中分離出一種亞型細胞，建立了穩定轉染PBD-1基因的細胞系，命名為BMSC-S3/PBD-1 (國家典型培養物保藏中心典藏號CCTCC C201336)。PCR檢測表明，BMSC-S3細胞表達PBD-1、Sox2、Pou5f、CD90和CD29基因，Nanog基因表達較弱，不表達Lin28。細胞ALP、PAS和Gimsa染色陽性。細胞免疫熒光化學分析，BMSC-S3/PBD-1細胞表達⑶34、⑶44和⑶90，不表達⑶45。流式檢測，⑶34、⑶44和⑶90的表達比例分別達到97.77%,89.53%和81.47%。上述結果證實BMSC-S3/PBD-1細胞已穩定表達PBD-1，且具備標準BMSC干細胞特性。將穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞通過靜脈輸注到患支原體肺炎的豬體內，可以有效控制豬支原體肺炎疾病。BMSC-S3/PBD-1細胞可以長期在液氮罐中保存，來源 有保障，該技術無耐藥性，外源蛋白為豬體特有，無藥物殘留的風險，應用前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法流程圖。
圖2是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的穩定轉染PBD-1基因的細胞系。
圖3是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的PCR檢測圖。
圖4是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的細胞免疫熒光化學分析圖。
圖5是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的流式細胞儀分析圖。圖6是本發明實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的細胞向成脂細胞或成肌細胞分化圖。
【具體實施方式】
[0021]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0022]圖1示出了本發明提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法的流程。為了便于說明，僅僅示出了與本發明相關的部分。[0023]如圖1所示，本發明的實施例提供的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法包括以下步驟:
[0024]從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞；
[0025]分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞BMSC-S3細胞系；
[0026]建立穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞系；
[0027]PCR檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的基因；
[0028]細胞免疫熒光化學分析和流式檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的抗原分子；
[0029]在被誘導條件下，細胞可向成脂細胞或成肌細胞分化。
[0030]作為本發明實施例的一優化方案，從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞采用Ficol梯度分離法。
[0031]作為本發明實施例的一優化方案，分離豬骨髓間充質干細胞選取的部位為初生豬腿骨的胚骨、股骨。
[0032]作為本發明實施例的一優化方案，分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞采用的方法為差速貼壁法。
[0033]作為本發明實施例的一優化方案，檢測BMSC-S3/PBD-1細胞是否穩定表達PBD-1PCR的方法為PCR檢測、細胞免疫熒光化學分析和流式檢測。
[0034]
【權利要求】
1.一種可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: 從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞； 分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞BMSC-S3細胞系； 建立穩定轉染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞系； PCR檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的基因； 細胞免疫熒光化學分析和流式檢測BMSC-S3/PBD-1細胞表達的抗原分子； 在被誘導條件下，細胞可向成脂細胞或成肌細胞分化； 收集經過檢測合格的BMSC-S3/PBD-1細胞，以磷酸緩沖液或生理鹽水進行稀釋，通過耳部靜脈輸注到患支原體肺炎的豬體內，有效劑量為I?5X IO5/次/kg體重。
2.如權利要 求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，從初生豬腿骨骨髓中分離豬骨髓間充質干細胞采用Ficol梯度分離法。
3.如權利要求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，分離豬骨髓間充質干細胞選取的部位為初生豬腿骨的脛骨、股骨。
4.如權利要求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，分離豬骨髓間充質干細胞的亞型細胞采用的方法為差速貼壁法。
5.如權利要求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，BMSC-S3細胞轉染PBD-1基因后，經G418篩選獲得穩定表達PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1細胞群，且經PCR檢測可表達Sox2、Pou5f、⑶90和⑶29基因，Nanog基因表達較弱，不表達Lin28。細胞ALP、PAS和Gimsa染色陽性，經細胞免疫熒光化學分析細胞表達⑶34、⑶44和⑶90，不表達⑶45，經流式細胞術分析⑶34、⑶44和⑶90的表達比例分別達到97.77%,89.53%和81.47%。在被誘導條件下，細胞可向成脂細胞或成肌細胞分化。
6.如權利要求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，待BMSC-S3/PBD-1細胞達到80%以上融合時，進行消化、傳代，并依此法反復傳代，達到純化和擴增BMSC-S3/PBD-1細胞的目的，收集細胞，凍存、復蘇備用； 收集經過檢測的BMSC-S3/PBD-1細胞，以磷酸緩沖液(PBS)或生理鹽水進行稀釋，通過耳部靜脈輸注到患支原體肺炎的豬體內，有效劑量為I?5X IO5/次/kg體重。
7.如權利要求1所述的可防治豬支原體肺炎的干細胞制劑的制備方法，其特征在于，在無菌條件下，將初生豬腿骨覆蓋物徹底分離，機械擠壓脛骨、股骨獲得骨髓，采用Ficol梯度分離法從收集的骨髓中分離出豬骨髓間充質干細胞，以I X IO5AiL密度接種于12孔細胞培養板，所用培養基為DMEM液體培養基，置37°C、5% CO2培養箱中培養； 待細胞鋪滿培養皿底部后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞，利用差速貼壁法從中分離出一種鋪路石狀的亞型細胞繼續培養； 待細胞融合達到85%以上時，將其接種于新的培養皿，于37°C、5% CO2培養箱中培養培養24小時，待細胞融合至70%?80%時，按照Lipofectamine2000轉染試劑盒操作說明書進行細胞轉染操作，6小時后更換有血清、無雙抗的DMEM培養基；轉染48小時后，開始用G418篩選；過程為:第I?3天1000 μ g/ml，接著用2000 μ g/ml的濃度繼續篩選，直至絕大部分細胞死亡，將G418濃度改為1000 μ g/ml維持篩選6周；將獲得細胞采用極限稀釋法傳至96孔細胞培養板，每孔大約I個細胞，交替使用常規培養基和G418培養基培養單個細胞，至其長出單個克隆；在熒光顯微鏡下挑選出最優的細胞克隆繼續培養，并不斷擴繁至建立新的細胞系； 最終建立穩定轉染PBD-1基因的.細胞系，命名為BMSC-S3/PBD-1。
【文檔編號】A61P11/00GK103432167SQ201310209723
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年5月27日 優先權日:2013年5月27日
【發明者】黃海軍, 高其雙, 陳志華, 占才耀, 錢運國, 彭霞, 向敏, 周莉, 盧順, 陶弼菲 申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所